福建省政和縣煙草細菌性葉斑病的癥狀及病原菌鑒定

林可竟 周挺 詹夢琳 徐進 鄭鈺婷 林勇 林偉 顧鋼 蔡學(xué)清

摘要：【目的】明確福建省政和縣云煙87上新發(fā)生的一種細菌性病害的病原菌，為進一步探討其發(fā)病規(guī)律并制定有效的防控措施提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎闷桨鍎澗€分離法對采自福建省政和縣的罹病云煙87煙葉進行病原菌分離純化，對分離獲得的細菌菌株通過柯赫氏法則驗證其致病性，并采用生物學(xué)特征、生理生化反應(yīng)及特異性引物檢測、16S rDNA序列分析等明確其分類地位。【結(jié)果】從病葉上分離純化獲得15株細菌，經(jīng)柯赫氏法則證明15株細菌菌株均為該病害的致病菌，且致病力無明顯差異。分離菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2 d后，菌落為白色隆起，邊緣不規(guī)則且黏稠，菌體短桿狀，極生4根鞭毛，革蘭氏染色反應(yīng)陰性;經(jīng)8項關(guān)鍵性生理生化特性測定、Biolog 94種表型測試、煙草野火病菌特異性引物檢測及16S rDNA基因序列分析，將15株細菌菌株鑒定為扁桃假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas amygdali pv. tabaci）?！窘Y(jié)論】引發(fā)福建省政和縣烤煙葉部細菌性病害的致病菌為扁桃假單胞菌煙草致病變種。

關(guān)鍵詞：煙草;細菌性葉斑病;病原菌鑒定;扁桃假單胞菌煙草致病變種

中圖分類號：S432.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-3034-07

Symptoms and pathogen identification of tobacco bacterial

leaf spot disease in Zhenghe， Fujian

LIN Ke-jing1， ZHOU Ting2， ZHAN Meng-lin1， XU Jin3， ZHENG Yu-ting1，

LIN Yong4， LIN Wei5， GU Gang2*， CAI Xue-qing1*

（1College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou? 350002， China; 2Institute of Tobacco Science， Fujian Provincial Tobacco Company， Fuzhou? 350003， China; 3Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing? 100193， China; 4Zhenghe Branch of Nanping Tobacco Corporation， Fujian Provincial Tobacco Corporation， Nanping， Fujian? 353600， China; 5Nanping Branch of Fujian Provincial Tobacco Corporation， Nanping， Fujian? 353000， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogenic agent of tobacco（Yunyan 87） bacterial leaf spot disease newly found in Zhenghe County of Fujian in 2020， so as to provide a theoretical basis for further exploring the disease regularity and the precise control measures. 【Method】 The bacterial strains were isolated and purified from disease leaves of tobacco Yunyan 87 in Zhenghe County of Fujianby the plate-marking method， the pathogenicity of the isolated strains were tested by Koch’s Postulation， and its taxonomic status were confirmed by bacteria biological characteristics，physiological and biochemical characteristics， and specific primer detection and 16S rDNA gene sequence analysis. 【Result】The results showed that fifteen strains were isolated from diseased leaves of tobacco. According to Koch’s Postulation， all the fifteen strains were the pathogens of tobacco bacterial leaf spot disease and their pathogenicity was no obvious difference. The colonies of the pathogen were bulge and white on NA plate in 1-2 d cultivation， the edges were irregular and thick.The bacterial cellswere rod-shaped and had 4 flagella on polar. Gram stain was negative. Based on 8 key physiological and biochemical characteristics， 94 phenotypes in Biolog instrument， specific primer detection and 16S rDNA sequence analysis of the pathogens， all 15 tested isolates were identified as Pseudomonas amygdali pv. tabaci. 【Conclusion】The tobacco bacterial leaf diseases in Zhenghe County of Fujian is caused by P. amygdali pv. tabaci.

Key words： tobacco; bacterial leaf spot disease; pathogen identification; Pseudomonas amygdali pv. tabaci

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201106-02）; Science and Technology Project of Fujian Provincial Company of China Tobacco （KH1702210）

0 引言

【研究意義】由扁桃假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas amygdali pv. tabaci）（Gardan et al.， 1999）[同物異名：丁香假單胞菌煙草致病變種P. syringae pv. tabaci （Wolf et Foster） Young & Dye Wikie]引起的煙草野火病和丁香假單胞菌角斑致病變種[P. syringae pv. angulata（Frome et al.） Holland]引起的煙草細菌性角斑病是世界煙草生產(chǎn)上普遍發(fā)生且危害嚴重的2種細菌病害，給煙草種植造成了嚴重損失（張廣民等，2002）。2020年，福建省政和縣種植的云煙87發(fā)生疑似煙草野火病，罹病煙株葉片出現(xiàn)單一或連片分布的圓形或不規(guī)則形褐色病斑，病斑周圍有黃色暈圈。該病發(fā)生面積約20 ha，其中5.7 ha重度發(fā)生，發(fā)病率62%～87%，給當?shù)責熮r(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此，明確其病因，可為該病害的精準防控提供理論依據(jù)。【前人研究進展】煙草野火病和角斑病主要分布于亞洲、非洲、歐洲及南美洲的煙葉主產(chǎn)區(qū)。據(jù)報道，這2種煙草細菌性病害在我國山東、遼寧、河南、安徽、四川、貴州、湖南、云南和黑龍江等省均有發(fā)生為害（王振國，2012;臺蓮梅等，2014;張萌，2016;陳燾等，2018），而這2種病害在田間?；旌习l(fā)生，癥狀易混淆。據(jù)報道，煙草野火病菌能產(chǎn)生特殊的氨基酸（野火毒素），病斑周圍產(chǎn)生典型的黃色暈圈，而角斑病菌不能產(chǎn)生野火毒素，病斑不產(chǎn)生黃色暈圈（張萌，2016）;另據(jù)報道，煙草野火病菌與煙草角斑病菌對煙草品種、煙苗齡期及葉位的敏感不同，如野火病菌易侵染煙苗前期（42 d）的下部葉片，而角斑病菌易侵染煙苗中后期（84 d）的上部葉片。此外，野火病菌侵染對氣候因素如溫度、氣壓、紫外線等比角斑病菌敏感，因此認為這2種病害的病原菌屬于不同的致病變型（Deall and Cole，1986）;但隋原（2011）研究發(fā)現(xiàn)，61株來自吉林和黑龍江省主要產(chǎn)煙區(qū)的野火病菌菌株在侵染不同品種煙草時的潛育期、病斑大小、單株病斑數(shù)和病情指數(shù)存在一定差異，對這些菌株的DNA聚類分析顯示，親緣關(guān)系的遠近與致病性間無明顯相關(guān)性。程璐（2018）采用傳統(tǒng)的生物學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法將遼寧阜新地區(qū)煙草角斑病的病原菌鑒定為P. syringae pv. tabaci FX分離株，對分離株的全基因組進行測序，并將其序列與Wang等（2015）在NCBI上登錄的分離自四川越西縣的煙草野火病菌菌株yuexi-1的全基因組序列進行分析比對，結(jié)果顯示，這2株菌株有423個不同的毒力基因，推斷毒力因子的區(qū)別可能是導(dǎo)致二者在煙草上致病所表現(xiàn)的癥狀不同的原因。而陳瑞朋（2018）利用全基因組比對的手段分別獲得煙草野火病菌和角斑病菌的LAMP特異性檢測引物，建立了煙草野火病和角斑病病原的LAMP快速檢測方法，可對這2種病害進行田間快速診斷。但也有研究發(fā)現(xiàn)，煙草野火病菌經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)后會變異成產(chǎn)毒較弱或不產(chǎn)毒素的菌株，接種后病斑周圍黃色暈圈較弱或不產(chǎn)生黃色暈圈，因此認為野火病菌是角斑病菌一個產(chǎn)生暈圈的菌系，即兩者是屬于同一種病菌不同的菌系（張廣民等，2002;姜新等，2007）。【本研究切入點】2020年，福建省政和縣種植的云煙87發(fā)生疑似煙草野火病，但至今未見該病害在福建省煙區(qū)為害狀的詳細描述及其病原物系統(tǒng)鑒定的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對罹病煙葉采用常規(guī)方法進行病原菌分離純化，對分離獲得的細菌菌株通過柯赫氏法則驗證其致病性，并采用生物學(xué)特征、生理生化反應(yīng)及特異性引物檢測、16S rDNA序列分析等明確其分類地位，為明確福建省政和縣煙草細菌性葉斑病的發(fā)病規(guī)律并制定有效的防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試樣品 采自福建省政和縣楊源鄉(xiāng)種植的帶有不規(guī)則褐色病斑的云煙87病葉，用于病原菌分離。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）（不加瓊脂的NA培養(yǎng)基）、金氏B培養(yǎng)基（KB）、明膠水解培養(yǎng)基、蔗糖還原培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基和碳素化合物基本培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基配方均參照方中達（1998）的方法，121 ℃滅菌20 min，備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 細菌分離與純化 采用平板劃線分離法，參照方中達（1998）的方法。

1. 2. 2 細菌培養(yǎng) 將1.2.1純化的細菌菌株接種到NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)基中，28 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后備用。

1. 2. 3 煙苗培育 將云煙87種子點播至育苗盤內(nèi)，長至3片真葉時移栽至AB150型花盆內(nèi)，長至5片真葉時備用。

1. 2. 4 菌落形態(tài)觀察 將分離獲得的細菌菌株接種到NA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d，觀察并記錄菌落的顏色和形態(tài)特征。

1. 2. 5 致病性測定 采用注射接種法和噴霧接種法。注射接種法：將分離菌株的懸浮液（濃度約為1.0×108 CFU/mL）注射接種至云煙87葉片的細胞間，以細胞間充滿細菌懸浮液為準，每株菌株接種3片煙草葉片，3次重復(fù)，接種后24 h開始觀察，記錄發(fā)病情況;噴霧接種法：將分離菌株的懸浮液（濃度約為1.0×108 CFU/mL）噴霧接種至云煙87，每株菌株接種6株煙苗，3次重復(fù)，以葉片正、反面噴濕為準，接種后保濕24 h，第2 d開始觀察，記錄發(fā)病情況。上述接種均以無菌水接種作對照，接種發(fā)病后再分離病原菌。

1. 2. 6 革蘭氏染色 采用結(jié)晶紫草酸銨染色法，參照方中達（1998）的方法進行。

1. 2. 7 電鏡觀察 采用磷鎢酸負染法，于透射電子顯微鏡（Hitachi HC-1）下觀察。

1. 2. 8 生理生化測定 分離菌株在KB培養(yǎng)基上是否有綠色熒光、對碳素化合物（甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖和山梨醇）的利用、明膠水解、果聚糖的產(chǎn)生、在38 ℃下的生長情況等的測定和觀察，參照方中達（1998）的方法。

1. 2. 9 Biolog測定 采用Gen III Microstation biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

1. 2. 10 分子生物學(xué)鑒定 采用菌落PCR法。分別挑取分離菌株的單菌落，放入裝有20 μL ddH2O的離心管中，于沸水中水浴10 min，制備DNA模板，供后續(xù)PCR擴增。煙草野火病菌特異性引物40429F/40429R（5'-CGTGCGGGGCTTTTTGTTGTC-3'/5'-T TAGCGGGTTTTGGTTTGCG-3'）檢測，參照陳瑞朋等（2018）的方法;煙草野火病菌和煙草角斑病菌多重PCR引物TabB1F/TabB1R（5'-ATTGAAGAAGCG TTCGAGCG-3'/5'-GTTTCGGGTCGGCACGATTG-3'）檢測及煙草角斑病菌特異性引物2F2/2R2（5'-CA AACCAGCTGAAAACAAAC-3'/5'-ATGGGGGTGA TTCTCAATCG-3'）檢測，參照張萌（2016）的方法;細菌16S rDNA基因擴增通用引物27F/1492R（5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'）檢測，參照Lane（1991）的方法;對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶正確的送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行核苷酸序列測定，測序結(jié)果在NCBI上在線比對，并運用MEGA 7.0的鄰接法基于16S rDNA構(gòu)建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病害癥狀

調(diào)查結(jié)果（圖1）顯示，煙草細菌性葉斑病在田間蔓延速度快，主要為害葉片，初期受害部位為水漬狀圓形或不規(guī)則小斑點，后斑點逐漸擴大，中心變成褐色，周圍有明顯的黃色暈環(huán)，病斑直徑1～3 mm，隨后病斑逐漸擴展，合并成不規(guī)則形的黃褐色斑，病情嚴重的葉片不規(guī)則形病斑連成一片，葉片枯死。切取病健交界處在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見溢菌現(xiàn)象。

2. 2 病原菌的分離與純化

采用常規(guī)分離法從病葉上分離純化獲得15株細菌菌株，編號為Yan1～Yan15。15株菌株在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征相似，培養(yǎng)1～2 d的菌落為白色隆起，邊緣不規(guī)則且菌落黏稠（圖2-A），培養(yǎng)3～4 d后，菌落分泌黏性物質(zhì)增加，逐漸圓潤，菌落邊緣呈透明狀，中間呈淡黃色（圖2-B）。

2. 3 致病性測定結(jié)果

將2.2分離純化的15株細菌菌株（Yan1～Yan15）進行煙草致病性測定，結(jié)果顯示，注射接種煙草細胞后24 h未出現(xiàn)枯斑反應(yīng)，接種點周圍出現(xiàn)明顯的褪綠暈圈，接種2～3 d后，接種點周圍出現(xiàn)壞死枯斑;噴霧接種3 d后，葉片出現(xiàn)水漬狀斑點，隨后病斑逐漸擴大，褐變，邊緣出現(xiàn)褪綠暈圈，與田間癥狀高度相似。分離接種發(fā)病的病斑，獲得的菌株菌落形態(tài)特征與接種的菌株相同，經(jīng)柯赫氏法則驗證，15株分離菌株均為煙草細菌性葉斑病的病原菌。將15株菌株分別轉(zhuǎn)接至NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，懸浮于終濃度為40%甘油溶液中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 4 細菌鑒定結(jié)果

2. 4. 1 細菌形態(tài)特征 菌株Yan1～Yan15的菌體呈短桿狀，細胞大小約1.50 mm′0.75 mm，極生4根鞭毛，鞭毛長約4～5 mm（圖3），革蘭氏染色陰性。

2. 4. 2 生理生化測定結(jié)果 菌株Yan1～Yan15均可利用甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖，不能利用海藻糖;果聚糖產(chǎn)生和明膠液化測定結(jié)果為陽性;KB培養(yǎng)基上生長的菌落在紫外線下發(fā)出綠色熒光，38 ℃下不能生長。

2. 4. 3 Biolog測定結(jié)果 從2.4.2的測定結(jié)果可知，菌株Yan1～Yan15的生理生化指標均表現(xiàn)一致，隨機挑選菌株Yan3、Yan5、Yan9和Yan15進行71種碳源的利用性及23種化學(xué)敏感性測試，培育48 h后經(jīng)Microlog軟件讀數(shù)，結(jié)果（表1）顯示4株菌株與數(shù)據(jù)庫中P. syringae pv. tabaci（同物異名：P. amygdali pv. tabaci）的相似度最高。

2. 4. 4 細菌菌株的特異性引物檢測 對菌株Yan1～Yan15進行煙草野火病菌和煙草角斑病菌PCR特異性引物擴增，結(jié)果顯示，用煙草野火病菌特異性引物40429F/40429R進行PCR擴增，15株細菌菌株均能擴增獲得大小約203 bp單一的特異性條帶（圖4-A）;用煙草野火病菌和煙草角斑病菌多重PCR引物TabB1F/TabB1R進行擴增，15株細菌菌株均能擴增獲得大小分別為708和389 bp的2條特異性條帶（圖4-B），而使用煙草角斑病菌的特異性引物2F2/2R2進行PCR擴增，供試15株細菌菌株均未擴增到目的條帶，說明分離獲得的菌株為煙草野火病菌。

2. 4. 5 細菌菌株16S rDNA基因鑒定結(jié)果 從2.4.4的測定結(jié)果可知，菌株Yan1～Yan15的特異性引物檢測結(jié)果均表現(xiàn)一致，隨機挑選4株菌株（Yan3、Yan5、Yan9和Yan15）進行16S rDNA基因鑒定。用細菌16S rDNA通用引物27F/1492R對4株菌株進行PCR擴增后測序，測序結(jié)果在NCBI上在線比對，結(jié)果表明，4株菌株與扁桃假單胞菌煙草致病變種（P. amygdali pv. tabaci）、扁桃假單胞菌流淚致病變種（P. amygdali pv. lachrymans）、丁香假單胞菌丁香致病變種（P. syringae pv. syringae）、薩氏假單胞菌（P. savastanoi）和凍結(jié)假單胞菌（P. congelans）相應(yīng)序列的同源性最高，達99.0%以上。利用MEGA 7.0，以短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）為外群，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果（圖5）顯示，4株菌株均與扁桃假單胞菌煙草致病變種聚為一支。

3 討論

煙草野火病在烤煙上普遍發(fā)生，給煙草種植業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。本研究從福建省政和縣罹病的煙葉中分離到15株細菌菌株，根據(jù)柯赫氏法則證明15株細菌菌株均為煙草細菌性葉斑病病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化等傳統(tǒng)的生物學(xué)特征以及特異性引物40429F/40429R和16S rDNA基因序列等分子生物學(xué)分析比對，將15株細菌菌株鑒定為扁桃假單胞菌煙草致病變種，與在我國云南和湖南等地報道的煙草野火病病原菌相同（劉雅婷等，2002;陳燾，2017）。已有研究表明，野火病菌在不同的烤煙品種上致病力存在差異，可劃分為不同的生理小種（黃杏娥等，2007;孫劍萍等，2011;唐明等，2016;林凡力，2019）。本研究分離的15株野火病菌菌株對云煙87的致病力無明顯差異，但對福建省其他烤煙品種的致病力是否存在差異，即福建煙區(qū)煙草野火病菌是否存在生理小種分化現(xiàn)象，有待進一步探究。

通常認為煙草野火病的初侵染源主要是田間越冬的病殘體或帶菌種子。林滋鑾等（1995）對福建省煙草侵染性病害的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草野火病在福建省武平、上杭、云霄、連城、清流和寧化等地有零星分布，但尚未見該病在政和縣發(fā)生為害的報道，也未見對福建省煙草野火病的病原物進行系統(tǒng)鑒定的研究報道。2020年政和縣煙草野火病發(fā)生突然，病源從何而來有待研究和分析。該病菌寄主范圍廣（Knoche et al.，1994;Kang et al.，2015），其在田間的發(fā)生和蔓延與煙草的生育期等有關(guān)（Deall et al.，1986），烤煙生長季節(jié)，病菌是否無癥狀寄生于某種作物或雜草亟待摸清。Joung等（2017）報道土壤中的細菌可在雨后形成氣溶膠，隨風(fēng)遠距離傳播;而Ali等（2020）報道黃瓜細菌性角斑病菌（P. amygdali pv. lachrymans）在設(shè)施環(huán)境中可隨氣溶膠快速傳播;另外，國內(nèi)煙草品種對煙草野火病菌大都表現(xiàn)不抗病或抗性較低（朱賢朝等，2002），其中，云煙87對煙草野火病菌敏感（黃杏娥等，2007），這可能是2020年政和縣云煙87煙草野火病發(fā)病重、傳播速度快、危害面廣的重要原因。

4 結(jié)論

本研究首次鑒定并報道了福建省政和縣煙草野火病的致病菌為扁桃假單胞菌煙草致病變種，為該病害的防控提供依據(jù)。由于云煙87抗性弱，病菌致病力強，煙草野火病蔓延速度快，造成的損失大，因此，應(yīng)加強病害監(jiān)測，做好綜合防治。

參考文獻：

陳瑞朋. 2018. 煙草野火病菌與角斑病菌LAMP快速檢測方法的建立與應(yīng)用[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué). [Chen R P. 2018. Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Pseudomonas syringae pv. tabaci and Pseudomonas syringae pv. angulata[D]. Tai’an：Shandong Agricultural University.]

陳瑞朋，盧凱，張敏，劉元德，宗浩，牛紀軍，劉文濤，徐后娟. 2018. 煙草野火病菌特異性檢測引物篩選及應(yīng)用[J]. 中國煙草科學(xué)， 39（1）：72-76. [Chen R P， Lu K， Zhang M， Liu Y D， Zong H，Niu J J，Liu W T，Xu H J. 2018. Screening and application of Pseudomonas syringae pv. tabaci-specific primers[J]. Chinese Tobacco Science， 39（1）：72-76.] doi：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.01.010.

陳燾. 2017. 郴州桂陽煙區(qū)野火病的測報、鑒定及生防菌篩選研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué). [Chen T. 2017. Forcas-ting， identifying and bio-control bacteria screening of tobacco wildfire disease from Guiyang tobacco area in Chenzhou[D]. Changsha： Hunan Agricultural University.]

陳燾，周瑋，李宏光，趙松義，蔡訓(xùn)輝，范彥君，周清明. 2018. 煙草野火病的發(fā)生及綜合防治研究進展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 37（1）：469-476. [Chen T， Zhou W， Li H G， Zhao S Y，Cai X H， Fan Y J， Zhou Q M. 2018. Research progress in disease occurrence and integrated control of tobacco wildfire[J]. Genomics and Applied Bio-logy， 37（1）：469-476.] doi：10.13417/j.gab.037.000469.

程璐. 2018. 煙草角斑病菌全基因組序列分析及其生防制劑的應(yīng)用[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué). [Cheng L. 2018. Study of complete genome sequencing and biological control of Pseudomonas syringae pv. tabaci[D]. Shen-yang： Shenyang Agricultural University.]

方中達. 1998. 植病研究方法[M]. 第3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：179-211. [Fang Z D. 1998. Plant disease research methods[M]. The 3th Edition. Beijing：China Agriculture Press：179-211.]

黃杏娥，劉雅婷，李永忠，陳赟娟，饒省和，王瑞建. 2007. 不同煙草品種對云南煙草野火病菌的抗性鑒定[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 22（6）：813-817. [Huang X E， Liu Y T， Li Y Z， Chen Y J， Rao S H， Wang R J. 2007. Identification of tobacco cultivars resistance to Pseudomonas syringae pv. tabaci of Yunnan[J]. Journal of Yunnan Agricultural University，22（6）：813-817.] doi：10.16211/j.issn. 1004-390x（n）.2007.06.009.

姜新，白建保，王左斌，宋影. 2007. 煙草角斑病研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（7）：138-139. [Jiang X， Bai J B， Wang Z B，Song Y. 2007. Research on tobacco angular leaf spot disease[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，35（7）：138-139.] doi：10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.07.070.

林凡力. 2019. 中國5省市煙草野火病菌遺傳多樣性研究[D]. 重慶：西南大學(xué). [Lin F L. 2019. Genetic diversity analysis of tobacco wildfire in five provinces of China[D]. Chongqing：Southwest University.]

林滋鑾，盧洪興，陳炳全，陳錦云. 1995. 福建省煙草侵染性病害種類分布與為害[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技， （5）：14-15. [Lin Z L， Lu H X， Chen B Q，Chen J Y. 1995. Species distribution and damage of tobacco infectious diseases in Fujian Province[J]. Fujian Agricultural Science and Technology， （5）：14-15.]

劉雅婷，張世珖，李永忠，楊煥文. 2002. 云南煙草野火病病原細菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）鑒定[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 17（1）：4-9. [Liu Y T， Zhang S G， Li Y Z， Yang H W. 2002. Identification of Pseudomonas syringae pv. tabaci isolated from Yunnan[J]. Journmal of Yannan Agricultural University， 17（1）：4-9.] doi：10.16211/ j.issn.1004-390x（n）.2002.01.002.

隋原. 2011. 吉林和黑龍江兩省煙草野火病菌遺傳多樣性研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué). [Sui Y. 2011. Genetic diversity of Pseudomonas syringae pv. tabaci from Jilin and Heilongjiang Provinces of China[D]. Changchun：Jilin Agricultural University.]

孫劍萍，孫宏偉，虞艷芳. 2011. 黑龍江省煙草野火病菌生理小種鑒別寄主的篩選[J]. 煙草科技， （10）：75-77. [Sun J P， Sun H W， Yu Y F. 2011. Differential host screen for physiologic races of Pseudomonas syringae pv. tabaci in Heilongjiang[J]. Tobacco Science & Technology， （10）：75-77.] doi：10.3969/j.issn.1002-0861.2011.10.018.

臺蓮梅，靳學(xué)慧，張亞玲. 2014. 黑龍江煙草病害種類鑒定及發(fā)生情況[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（10）：124-126. [Tai L M， Jin X H， Zhang Y L. 2014. Species identification of tobacco disease and occurrence in Heilongjiang[J]. Guizhou Agricultural Sciences，42（10）：124-126.] doi：10. 3969/j.issn.1001-3601.2014.10.032.

唐明，謝冰，程智敏，向金友，饒在生. 2016. 宜賓煙區(qū)烤煙野火病的致病力分化、生物學(xué)特性及抑菌藥劑篩選[J]. 煙草科技， 49（10）：9-14. [Tang M， Xie B， Cheng Z M， Xiang J Y， Rao Z S. 2016. Physiologicity differentiation and biological characteristics of Pseudomonas syringae pv. tabaci and effective bactericide screening in Yibin tobacco planting areas[J]. Tobacco Science & Technology， 49（10）：9-14.] doi：10.16135/j.issn1002-0861.2015. 0642.

王振國. 2012. 影響煙草野火病發(fā)生的關(guān)鍵因子分析及控制技術(shù)研究[D]. 重慶：西南大學(xué). [Wang Z G. 2012. Studies on key-factor analysis of tobacco wildfire disease’s occurrence and its control techniques[D]. Chongqing： Southwest University.]

張廣民，呂軍鴻，闞光鋒，王智發(fā). 2002. 煙草野火病研究概況[J]. 中國煙草學(xué)報， 8（2）：34-37. [Zhang G M， Lü J H， Kan G F， Wang Z F. 2002. Recent development in the study of tobacco wildfire disease[J]. Acta Tabacaria Sinica，8（2）：34-37.] doi：10.3321/j.issn：1004-5708.2002. 02.008.

張萌. 2016. 煙草野火和角斑病菌鑒定方法研究[D]. 牡丹江：牡丹江師范學(xué)院. [Zhang M. 2016. Study on the methods of identification of tobacco wildfire and angular leaf spot disease[D]. Mudanjiang： Mudanjiang Normal University.]

朱賢朝，王彥亭，王智發(fā). 2002. 中國煙草病害[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社. [Zhu X C， Wang Y T， Wang Z F. 2002. Tobacco diseases in China[M]. Beijing： China Agricultural Press.]

Ali C，Yuan L F， Li L， Shi Y X， Xie X W， Wang Q， Li B J. 2020. Aerosol transmission of Pseudomonas amygdali pv. lachrymans in greenhouses[J]. Science of the Total Environment， 748：14143. doi： 10.1016/j.scitotenv.2020. 141433.

Deall M W， Cole J S. 1986. A Comparative study of the pathogenicity and epidemiology of strains of Pseudomonas syringae pv. tabaci that cause wildfire and angular leaf spot diseases of tobacco in Zimbabwe[J]. Plant Pathology， 35（1）：74-81. doi：10.1111/j.1365-3059. 1986. tb01983.x.

Gardan L， Shafik H， Belouin S， Broch R， Grimont F， Grinont P A D. 1999. DNA relatedness among the pathovars of Pseudomonas syringae and description of Pseudomonas tremae sp. nov. and Pseudomonas cannabina sp. nov. （ex Sutic and Dowson 1959）[J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 49：469-478. doi： 10.1099/002 07713-49-2-469.

Joung Y S， Ge Z F， Buie C R. 2017. Bioaerosol generation by raindrops on soil[J]. Nature Communications，8：14668. doi： 10.1038/ncomms14668.

Kang I J， Kim S H， Seo Y W， Seo M J， Shim H K， Shin D B， Heu S. 2015. Effective selection of soybean cultivars to wildfire disease pathogen Pseudomonas amygdali pv. tabaci[J]. Journal of Crop Science & Biotechnology，18（4）：279-284. doi： 10.10007/s 12892-015-0104-y.

Knoche K K， Parke J L， Durbin R D. 1994. Relationship of Pseudomonas syringae pv. tabaci races to the rhizosphere of Wisconsin-grown tobacco[J]. Plant and Soil， 158：91-97. doi：10.1007/BF00007921.

Lane D J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing[M]//Stackebrandt E， Goodfellow M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. New York： Wiley：115-175.

Wang T L， Yang Y W， Zhao T C. 2015. Genome sequence of a Pseudomonas syringae pv. tabaci strain， Yuexi-1， causing wildfire disease in tobacco[J]. Genome Announc，3（2）：e00180-15. doi：10.1128/genomeA.00180-15.

收稿日期：2021-06-28

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0201106-02）;中國煙草總公司福建省公司科技計劃項目（KH1702210）

通訊作者：顧鋼（1965-），https：//orcid.org/0000-0003-2347-7912，高級農(nóng)藝師，主要從事烤煙病蟲害綜合防治研究工作，E-mail： gugang318@163.com;蔡學(xué)清（1971-），https：//orcid.org/0000-0002-1900-0540，博士，教授，主要從事植物病原細菌研究工作，E-mail： caixq90@163.com

第一作者： 林可竟（1999-），https：//orcid.org/0000-0002-9269-8930，研究方向為植物病理學(xué)，E-mail： lkj6166@126.com