櫻桃葉斑病生防菌株萎縮芽孢桿菌菌株QH-588的篩選鑒定

朱杰 程亮 張綱 陳紅雨 付麗穎 姚強(qiáng) 郭青云

摘要：【目的】從枸杞根際土壤中分離可拮抗櫻桃葉斑病菌的細(xì)菌菌株，為櫻桃葉斑病防治提供生防資源。【方法】利用稀釋平板法從枸杞根際土壤中分離可培養(yǎng)細(xì)菌，以平板對(duì)峙法測(cè)定分離菌株對(duì)櫻桃葉斑病菌楊柳刺盤孢菌（Colletotrichum salicis）、鏈格孢菌（Alternaria alternaria）和細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima）的拮抗效果，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性和基于16S rDNA、GyrA和GyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)拮抗菌株進(jìn)行鑒定;通過顯微鏡觀察拮抗菌株對(duì)靶標(biāo)病原菌菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)的影響，選用櫻桃離體葉片培養(yǎng)測(cè)定其對(duì)櫻桃葉斑病的預(yù)防和防治效果?！窘Y(jié)果】從枸杞根際土壤中共分離獲得660株細(xì)菌，有10株細(xì)菌對(duì)供試靶標(biāo)病原菌具有較強(qiáng)的拮抗效果，其中有4株細(xì)菌（QH-588、QH-668、QH-667和QH-664）的發(fā)酵液對(duì)靶標(biāo)病原菌的抑制率超過50.00%，經(jīng)鑒定，菌株QH-588為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），菌株QH-664、QH-667和QH-668為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，萎縮芽孢桿菌菌株QH-588可明顯抑制靶標(biāo)病原菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā);生防效果測(cè)定結(jié)果表明，菌株QH-588發(fā)酵液在櫻桃離體葉片上對(duì)靶標(biāo)病原菌具有預(yù)防和防治作用?！窘Y(jié)論】萎縮芽孢桿菌菌株QH-588具有防治櫻桃葉斑病的生防潛力。

關(guān)鍵詞： 櫻桃;葉斑病;萎縮芽孢桿菌;篩選;鑒定;生物防治

中圖分類號(hào)： S436.629?; ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）11-3022-12

Screening and identification of Bacillus atrophaeus QH-588 for biological control of cherry leaf spot

ZHU Jie1， CHENG Liang1，? ZHANG Gang2， CHEN Hong-yu1，? FU Li-ying1，

YAO Qiang1*， GUO Qing-yun1*

（1Academy of Agriculture and Forestry Science in Qinghai University/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management of Qinghai Province/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest of Ministry of

Agriculture and Rural Affairs in Xining， Xining? 810016， China; 2Agricultural Technology Extension

Center of Ledu District， Haidong， Qinghai? 810700， China）

Abstract：【Objective】Bacterial strains that could antagonize cherry leaf spot were isolated from the rhizosphere soil of Lycium barbarum， so as to provide biocontrol resources for the control of cherry leaf spot. 【Method】The culturable bacteria were isolated from the rhizosphere soil of L. barbarum by dilution plate method. The antagonistic effect of the isolated strains against Colletotrichum salicis， Alternaria alternaria， A. tenuissima was determined by plate confrontation method. Combined with morphological， physiological and biochemical characteristics and phylogenetic analysis based on 16S rDNA， GyrA and GyrB genes sequences，antagonistic bacteriawere identified; the effects of antagonistic bacteria on the mycelial morphology and spores of target fungi were observed under microscope， and the in vitro leaf culture of cherry was selected to determine its prevention and control effect on cherry leaf spot. 【Result】A total of 660 strains of bacteria were isolated from the rhizosphere soil of L. barbarum， of which 10 strains had strong antagonistic effect on the tested pathogens. Among them， the inhibition rate of fermentation broth of 4 strains of bacteria （QH-588， QH-668， QH-667 and QH-664） on the target pathogens exceeded 50.00%. After identification， strain QH-588 was Bacillus atrophaeus， strains QH-664， QH-667 and QH-668 were B. subtilis. Microscopic observation showed that B. atrophaeus strain QH-588 could inhibit the mycelial growth and spore germination of the target pathogen.The results of biological control showed that the fermentation broth of strain QH-588 could prevent and control the target pathogens on the isolated leaves of cherry. 【Conclusion】B. atrophaeus strain QH-588 has the potential of biocontrol against cherry leaf spot.

Key words： cherry; leaf spot; Bacillus atrophaeus; screening; identification; biological control

Foundation item： National Natural Science Foundation of China （31760539）; Key Laboratory Project of Comprehensive Management of Agricultural Pests in Qinghai （2021-ZJ-Y08）

0 引言

【研究意義】枸杞（Lycium barbarum）屬茄科植物，是我國珍貴的中藥材，可藥食兩用（杜津昊，2017），還可制酒、制化妝品和作飼料等（姜枚辰等，2020）。同為木本植物的櫻桃近年來種植面積不斷擴(kuò)大，就青海省而言，全省的櫻桃栽培面積已達(dá)800 ha（王海等，2016），但櫻桃葉斑病也在逐年加重，據(jù)調(diào)查，2017—2019年的7—8月，青海省的櫻桃葉斑病發(fā)病率可高達(dá)100%，不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅櫻桃種植業(yè)的發(fā)展（劉俏等，2020）。櫻桃葉斑病可由細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、鏈格孢菌（A. alternaria）和楊柳刺盤孢菌（Colletotrichum salicis）引起（劉俏，2020），其中細(xì)極鏈格孢菌還能引起枸杞葉斑病（嚴(yán)林等，2017）。目前，防治由鏈格孢屬和刺盤孢屬引起的病害以培育種植抗病品種和使用化學(xué)藥劑為主（王婧等，2017;王興紅等，2019）。使用化學(xué)農(nóng)藥防治植物病害不僅污染環(huán)境，還威脅人類健康（張瑞福，2020），而生物防治可有效解決長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的病原菌抗性、農(nóng)藥殘留以及有害生物再猖獗等問題，還能促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展（張志春等，2020）。因此，利用綠色健康的生物防治手段防治櫻桃葉斑病對(duì)櫻桃種植業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鏈格孢屬真菌除能引起枸杞葉斑病和櫻桃葉斑病外，還可引起蘋果樹腐爛?。ê顚毢甑?，2017）、冬棗黑斑?。ɡ自缇甑?，2020）、香梨黑斑?。ㄈ蚊兰训龋?020）、蘋果黑點(diǎn)?。舷辇埖?，2021）和石榴褐斑?。ㄋ螘员?，2021）等;刺盤孢屬真菌可引起核桃炭疽?。ㄍ跖d紅等，2019）、梨樹炭疽?。钚×值?，2021）和四季秋海棠炭疽?。◤垖毲宓?，2021）等，危害范圍極廣。目前為止，對(duì)細(xì)極鏈格孢菌具有抑制效果的有多粘芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等（李夢(mèng)嬌，2017）;對(duì)鏈格孢菌具有抑制作用的有多粘類芽孢桿菌等（李建嫄等，2013）;對(duì)楊柳刺盤孢菌的生防菌篩選尚未見報(bào)道。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等是主要的生防細(xì)菌種類（李俊州和文才藝，2015）。芽孢桿菌具有較強(qiáng)的定殖能力，對(duì)病原菌有穩(wěn)定且顯著的拮抗作用，能促進(jìn)植株生長(zhǎng)。張翠綿等（2019）篩選出1株枯草芽孢桿菌G81不僅可抑制番茄灰霉菌和辣椒腐霉菌等病原，還能促進(jìn)番茄幼苗生長(zhǎng)。陳爽（2021）通過貝萊斯芽孢桿菌HM3-3對(duì)大豆根腐防御酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌不僅對(duì)大豆根腐病病原具有拮抗作用，還對(duì)大豆具有促生效果。在我國，已利用芽孢桿菌制成多種微生物農(nóng)藥產(chǎn)品并投入植物病害防治，如百抗和依天得等（陳羽嬌和余朝閣，2020）。馮時(shí)等（2021）在室內(nèi)篩選出枯草芽孢桿菌（科諾）和復(fù)合內(nèi)生芽孢桿菌（京青）對(duì)人參菌核病抑制效果最好?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】土壤不僅是微生物的“天然培養(yǎng)基”，還是最豐富的菌種資源庫，而藥用植物根際有益微生物種類更是繁多，很容易從藥用植物土壤環(huán)境中分離、篩選出生防細(xì)菌（李俊州和文才藝，2015;劉慧娟等，2019）。目前，對(duì)于枸杞根際土壤中是否存在對(duì)楊柳刺盤孢菌、鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌均具有抑制效果的生防細(xì)菌鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用稀釋平板法從枸杞根際土壤中分離可培養(yǎng)細(xì)菌，以平板對(duì)峙法測(cè)定分離菌株對(duì)櫻桃葉斑病菌的拮抗效果，進(jìn)一步對(duì)拮抗菌株進(jìn)行分類鑒定;通過顯微鏡觀察拮抗菌株對(duì)靶標(biāo)菌菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)的影響，選用櫻桃離體葉片培養(yǎng)測(cè)定其對(duì)櫻桃葉斑病的預(yù)防和防治效果，以期從枸杞根際土壤中分離可拮抗櫻桃葉斑病菌的細(xì)菌菌株，為櫻桃葉斑病防治提供生防資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試病原菌 細(xì)極鏈格孢菌、鏈格孢菌和楊柳刺盤孢菌，均為青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，加水1 L;NA培養(yǎng)基：牛肉浸粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加水1 L;NYD培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，酵母膏5 g，加水1 L。以上培養(yǎng)基滅菌備用。

1. 2 細(xì)菌分離

2019年8月19日在青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣采集枸杞根際土壤，采用稀釋平板法對(duì)土壤樣品中的細(xì)菌進(jìn)行分離純化。

1. 3 生防菌株活性測(cè)定

1. 3. 1 生防菌株發(fā)酵液制備 將拮抗菌株接種到NA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，隨后用無菌接種環(huán)移取1環(huán)至滅菌的NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃下160 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在10000 r/min條件下離心5 min去除菌體，上清液用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾，得到細(xì)菌發(fā)酵液備用。

1. 3. 2 生防菌初篩 采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)靶標(biāo)菌具有拮抗作用的細(xì)菌。具體方法：在PDA培養(yǎng)基中央接種靶標(biāo)菌，在距離靶標(biāo)菌2～3 cm處點(diǎn)接細(xì)菌，以不接細(xì)菌的平板為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)5 d后觀察記錄細(xì)菌菌株對(duì)靶標(biāo)菌的抑制效果。

1. 3. 3 生防菌復(fù)篩 對(duì)初篩有拮抗效果的細(xì)菌菌株進(jìn)行發(fā)酵液和菌體復(fù)篩。抑菌圈法：將靶標(biāo)菌接種在PDA培養(yǎng)基中央，在距離靶標(biāo)菌3 cm處對(duì)稱打孔2個(gè)（0.5 cm打孔器），每孔加入50 μL拮抗菌發(fā)酵液，28 ℃下培養(yǎng)7 d，記錄靶標(biāo)菌直徑。對(duì)峙法：將靶標(biāo)菌菌餅接種在PDA固體培養(yǎng)基中央，在距離靶標(biāo)菌2.5 cm處平行劃線接種拮抗細(xì)菌，培養(yǎng)7 d后觀察并記錄拮抗菌對(duì)靶標(biāo)菌的抑制效果。

病原菌生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100

1. 4 優(yōu)勢(shì)生防菌株鑒定

1. 4. 1 菌體形態(tài)特征觀察及生理生化特性測(cè)定

生防菌株在NA培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落形態(tài)特征，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（布坎南和吉本斯，1984）測(cè)定拮抗菌株的淀粉水解和碳源利用等生理生化特性。

1. 4. 2 生防菌分子生物學(xué)鑒定 拮抗菌的DNA用生工細(xì)菌DNA提取試劑盒提取，用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S rDNA、GyrA和GyrB基因序列引物對(duì)分別為27F/1492R、P-gyrA-1S/P-gyrA-2SR和UP1-F/UP-2R。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：正、反向引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板1 μL，2×PCR Mix 25 μL，dd H2O 20 μL。反應(yīng)程序：（1）16S rDNA：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。（2）UP1-F+UP-2R：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。（3）P-gyrA-1S+P-gyrA-2SR：退火溫度57 ℃，其他條件與UP1-F+UP-2R引物對(duì)的相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送楊凌天潤奧科生物科技有限公司測(cè)序。將所測(cè)得的16S rDNA、GyrA和GyrB基因序列通過NCBI中的BLAST進(jìn)行相似性比對(duì)，利用MEGA 5.0進(jìn)行DNA多序列同源性分析，采用鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定菌株的分類地位。

1. 5 優(yōu)勢(shì)生防菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

挑取單菌落接種于50 mL NA培養(yǎng)液中，28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后獲得種子液。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定種子液濃度，將菌株種子液按2%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)至250 mL NA培養(yǎng)液中，28 ℃下200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取出100 μL菌液檢測(cè)OD600吸光度，設(shè)3個(gè)重復(fù)。利用Excel 2010繪制生防菌株生長(zhǎng)曲線。

1. 6 優(yōu)勢(shì)生防菌株對(duì)櫻桃葉斑病菌的抑菌機(jī)理

1. 6. 1 優(yōu)勢(shì)生防菌株對(duì)櫻桃葉斑病病原菌菌絲形態(tài)的影響 于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)將生防菌株與3株靶標(biāo)菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，15 d 后分別挑取抑菌圈邊緣菌絲進(jìn)行顯微觀察（100倍）（張新杰等，2020）。每處理3個(gè)重復(fù)。

1. 6. 2 優(yōu)勢(shì)生防菌株對(duì)櫻桃葉斑病病原菌分生孢子形態(tài)及萌發(fā)的影響 病原菌培養(yǎng)15 d后，加入適量無菌水，用滅菌槍頭刮取其分生孢子，用紗布過濾，獲取病原菌孢子懸液備用。生防菌28 ℃培養(yǎng)72 h，取滅菌離心管，1∶1等體積加入靶標(biāo)菌孢子懸液和生防菌發(fā)酵液，制備混合液，以只加靶標(biāo)菌懸液為對(duì)照，25 ℃孵育，顯微鏡下（100倍）觀察病原菌分生孢子形態(tài)變化情況，并于孵育4、14和24 h記錄其萌發(fā)數(shù)。

孢子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)的孢子數(shù)/總的孢子數(shù)×100

孢子萌發(fā)抑制率（%）=[（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率]×100

1. 7 優(yōu)勢(shì)生防菌株在櫻桃離體葉片上對(duì)3種櫻桃葉斑病病原菌的生防效果測(cè)定

選用櫻桃感病品種薩米脫葉片，消毒洗凈備用。參照李軍營等（2021）的方法制備病原菌孢子懸浮液（106 CFU/mL）。預(yù)防效果測(cè)定：先接優(yōu)勢(shì)生防菌發(fā)酵液20 μL，3 d后接病原菌孢子懸浮液20 μL;防治效果測(cè)定：先接病原菌20 μL，待葉片出現(xiàn)病斑后再接生防菌20 μL;分別設(shè)清水對(duì)照、單獨(dú)接生防菌對(duì)照和單獨(dú)接病原菌對(duì)照。觀察測(cè)定櫻桃葉片上發(fā)病情況及病斑大小。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)用 DPS軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。將處理的數(shù)據(jù)用Excel 2010、Origin 2019b制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2. 1 初篩結(jié)果

從枸杞根際土壤中分離到660株細(xì)菌，通過平板對(duì)峙法檢測(cè)每株細(xì)菌對(duì)3株靶標(biāo)病原菌（細(xì)極鏈格孢菌、鏈格孢菌和楊柳刺盤孢菌）的拮抗作用，結(jié)果從660株細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)10株（QH-001、QH-468、QH-577、QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、 QH-666、QH-667和QH-668）對(duì)楊柳刺盤孢菌有拮抗作用，16株（QH-001、QH-070、QH-348、QH-386、QH-389、QH-390、QH-400、QH-468、QH-577、QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、QH-666、QH-667和QH-668）對(duì)鏈格孢菌有拮抗作用，15株（QH-001、QH-070、 QH-348、 QH-386、QH-390、QH-400、QH-468、QH-577、 QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、QH-666、QH-667和QH-668）對(duì)細(xì)極鏈格孢菌有拮抗作用（圖1），其中有10株菌（QH-001、QH-468、QH-577、QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、QH-666、QH-667和QH-668）對(duì)3株靶標(biāo)病原菌均有拮抗作用。

2. 2 復(fù)篩結(jié)果

利用3株靶標(biāo)病原菌對(duì)初篩獲得的10株拮抗菌進(jìn)行發(fā)酵濾液復(fù)篩，從中得到7株抑菌效果顯著且穩(wěn)定的拮抗菌（表1）。對(duì)7株拮抗效果較好的菌株中抑制率在50.00%以上的4株拮抗菌進(jìn)行菌體復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株QH-588對(duì)3株靶標(biāo)病原菌的抑制率最高，達(dá)54.45%，其次為菌株QH-668、QH-667和QH-664，表明拮抗菌QH-588、QH-668、QH-667和QH-664菌體及其分泌物均能顯著抑制櫻桃葉斑病的3種病原。

2. 3 生防菌株鑒定結(jié)果

2. 3. 1 生防菌株形態(tài)特征與生理生化特性 菌株QH-588菌落在NA固體培養(yǎng)基上前期呈乳白色，后期呈乳黃色逐漸產(chǎn)生黑色素，菌落不透明，邊緣不規(guī)則，呈波狀，菌落表面不平滑，微微凸起，革蘭氏染色為紫色，表明其為革蘭氏陽性菌（圖2-A）。菌株QH-664、QH-667和QH-668在NA培養(yǎng)基上菌落均呈乳白色，微黃，不透明，邊緣不整齊，有黏性，革蘭氏染色均為陽性（圖2-B、圖2-C和圖2-D），桿狀細(xì)菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株QH-588、QH-664、QH-667和QH-668為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。4株生防菌的生理生化特性見表3，4株生防細(xì)菌均能利用葡萄糖、蔗糖和果糖，V-P測(cè)定均為陽性，好氧，能使淀粉水解，明膠液化等。

2. 3. 2 生防菌株分子生物學(xué)鑒定 將菌株QH-588、QH-664、QH-667和QH-668的16S rDNA、GyrA和GyrB基因測(cè)序結(jié)果提交到GenBank，獲取登錄號(hào)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)其基因序列進(jìn)行BLASTn比對(duì)，比對(duì)后獲得4株拮抗菌的確定屬。將拮抗菌的3條基因序列按照16S rDNA、GyrA和GyrB的順序合并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，菌株QH-588以100%與B. atrophaeus聚為同一支，菌株QH-664、QH-667和QH-668以100%與B. subtilis聚為同一支，結(jié)合4株生防菌株的形態(tài)和生理生化特征，將菌株QH-588鑒定為萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus），菌株QH-664、QH-667和QH-668為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）（圖3）。

2. 4 菌株QH-588生長(zhǎng)曲線

選取拮抗效果最好的菌株QH-588進(jìn)行后續(xù)研究。由圖4可看出，菌株QH-588在搖床振蕩培養(yǎng)0～4 h為延遲期、10～20 h為菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、36～50 h為穩(wěn)定期，52 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，因此取12 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)酵濾液作為種子液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。種子液濃度采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)得1.95×108 CFU/mL。

2. 5 菌株QH-588對(duì)3株靶標(biāo)病原菌的抑菌機(jī)制

2. 5. 1 菌株QH-588對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株QH-588發(fā)酵液使楊柳刺盤孢菌的菌絲彎曲，節(jié)間縮短，部分還出現(xiàn)凹凸現(xiàn)象（圖5-A1和圖5-B1）;使鏈格孢菌菌絲細(xì)胞壁加厚，節(jié)間縮短，膨大，呈串珠狀排列（圖5-A2和圖5-B2）;使細(xì)極鏈格孢菌部分菌絲細(xì)胞異常膨大，部分呈串珠狀排列（圖5-A3和圖5-B3）。

2. 5. 2 菌株QH-588對(duì)病原菌分生孢子形態(tài)及萌發(fā)的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株QH-588發(fā)酵液對(duì)楊柳刺盤孢菌、細(xì)極鏈格孢菌和鏈格孢菌的分生孢子形態(tài)無明顯影響。病原菌分生孢子懸浮液與菌株QH-588發(fā)酵液共同孵育14 h時(shí)，菌株QH-588發(fā)酵液對(duì)楊柳刺盤孢菌孢子的萌發(fā)抑制率達(dá)最大值，為67.07%;孵育24 h時(shí)，菌株QH-588發(fā)酵液對(duì)鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌孢子的萌發(fā)抑制率達(dá)最大值，分別為41.08%和60.81%（圖6）。

2. 6 菌株QH-588在離體櫻桃葉片上對(duì)3株靶標(biāo)病原菌的生防效果

2. 6. 1 預(yù)防效果 采用針刺接種法在櫻桃葉片上接種菌株QH-588，3 d后接種相應(yīng)病原菌，測(cè)定菌株QH-588對(duì)櫻桃葉斑病的預(yù)防效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用菌株QH-588和靶標(biāo)病原菌處理后，在櫻桃葉片上均可明顯觀察到病斑變成深褐色，無輪紋（圖7-A、圖7-B和圖7-C）;而僅接種病原菌的葉片病斑顏色正常，輪紋清晰（圖7-D、圖7-E和圖7-F）。接種楊柳刺盤孢菌3 d后，菌株QH-588對(duì)其抑制率達(dá)最大值，為17.21%（圖9-A）;接種鏈格孢菌5 d后，菌株QH-588對(duì)其抑制率達(dá)大值，為44.96%（圖9-B）;接種細(xì)極鏈格孢菌3 d后，菌株QH-588對(duì)其抑制率達(dá)最大值，為14.14%（圖9-C）。表明菌株QH-588對(duì)櫻桃葉斑病有預(yù)防作用。

2. 6. 2 防治效果 待接種靶標(biāo)病原菌的櫻桃葉片出現(xiàn)病斑后，針刺接種菌株QH-588，測(cè)定菌株QH-588對(duì)櫻桃葉斑病的防治效果，結(jié)果（圖8）發(fā)現(xiàn)，接種菌株QH-588后第5 d，櫻桃葉片上的病斑變?yōu)樯詈稚?，輪紋較淺;而僅接種病原菌的葉片病斑顏色棕黃，輪紋清晰;第6 d時(shí)，菌株QH-588對(duì)楊柳刺盤孢菌、鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌的抑制率達(dá)最大值，分別為6.47%、47.08%和36.06%（圖9）。表明菌株QH-588對(duì)櫻桃葉斑病具有防治作用。

3 討論

本研究從枸杞根際土壤中分離獲得660株細(xì)菌菌株，并從中篩選獲得4株（QH-588、QH-664、QH-667和QH-668）對(duì)櫻桃葉斑病病原菌楊柳刺盤孢菌、鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌的抑制率均超過50.00%的拮抗菌株，經(jīng)鑒定，菌株QH-588為萎縮芽孢桿菌，菌株QH-664、QH-667和QH-668為枯草芽孢桿菌。目前，用于防治農(nóng)業(yè)植物病害的生防菌最多的是芽孢桿菌屬。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中最常見的一種，是一類好氧、產(chǎn)芽孢、無莢膜、能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽性桿狀菌，其具有較強(qiáng)的耐鹽性和抗逆性，無耐藥性，且不具備致病性（巴翠玉等，2017;杜漢宇等，2020）。萎縮芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的黑色變種（楊雪等，2020），分布于土壤、深海海泥、藻類植物及農(nóng)作物中（劉思靖，2019）。迄今國內(nèi)外對(duì)萎縮芽孢桿菌的研究已涉及多個(gè)領(lǐng)域，因其無致病性，具有較強(qiáng)的低溫適生性和耐鹽性（薛鵬琦等，2011;孫崇思等，2014），具有一定的降解纖維素活性，可應(yīng)用于飼料加工及低溫地區(qū)秸稈還田;因萎縮芽孢桿菌對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，近年來成為植物病害生物防治的研究熱點(diǎn)（孫崇思等，2014）。目前已報(bào)道萎縮芽孢桿菌可抑制的病害有23種左右，如生姜根腐?。╒eerubommu et al.，2013）、黃瓜白粉?。╖hang et al.，2013）、楊樹炭疽?。S華毅等，2017）、草莓枯萎?。▌⑧]洲等，2017）、墨蘭炭疽?。ㄗ纣惼喣尽つ旧碃柕?，2018）、刺果番荔枝炭疽病和鱷梨炭疽病（Guardado-Valdivia et al.，2018）、黃芪根腐?。ǜ叻业?，2019）、瓜果早疫病和腐霉病（劉思靖，2019）、蘋果樹腐爛?。R榮等，2020），以及茄子黃萎病、番茄立枯病、番茄瘡痂病、辣椒疫霉和棉花立枯病等（李春等，2015）。尚未見其對(duì)櫻桃葉斑病防治作用的報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，菌株QH-588發(fā)酵液使供試櫻桃葉斑病病原菌細(xì)極鏈格孢菌、鏈格孢菌和楊柳刺盤孢菌菌絲細(xì)胞節(jié)間縮短、彎曲、膨大，并且抑制分生孢子萌發(fā)，與黃華毅等（2017）研究發(fā)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌XW2可使楊樹炭疽病菌菌絲發(fā)生萎縮、局部膨大等畸形，且明顯抑制分生孢子萌發(fā)的結(jié)果一致，推測(cè)菌株QH-588通過分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)櫻桃葉斑病病原進(jìn)行抑制。萎縮芽孢桿菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物途徑有3類：核糖體合成途徑、非核糖體合成途徑及其他，而這些次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有一定抗菌活性的有核糖體途徑中合成的黑色素和活性蛋白，非核糖體途徑中合成的脂肽類物質(zhì)（Veerubommu et al.，2013）。劉郵洲等（2017）發(fā)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌YL3發(fā)酵液中脂肽類粗提物對(duì)草莓枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，且檢測(cè)到菌株YL3脂肽類粗提物中含有表面活性素和泛革素。陳欣欣（2015）研究發(fā)現(xiàn)，萎縮芽孢桿菌SF1中具有抑制尖孢鐮刀菌胡麻專化型的抗菌活性蛋白質(zhì)。對(duì)于本研究中萎縮芽孢桿菌菌株QH-588對(duì)櫻桃葉斑病病原具有抑制作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑還需進(jìn)一步探究。

生防菌生防效果的穩(wěn)定性是目前的研究熱點(diǎn)之一（王博，2020）。本研究中，菌株QH-588在離體櫻桃葉片上對(duì)葉斑病的防治效果遠(yuǎn)沒有在培養(yǎng)皿上的好，可能的原因有：一是生物防治中最關(guān)鍵的步驟是定殖，而萎縮芽孢桿菌菌株QH-588未能很好地在葉片上定殖，因而未能完全發(fā)揮其預(yù)防作用;二是在接種拮抗菌QH-588前大部分病斑直徑已達(dá)2～3 mm，病原菌基數(shù)已到達(dá)一定的量，導(dǎo)致防治效果降低，后續(xù)將針對(duì)提高該生防菌在實(shí)際應(yīng)用上的防效進(jìn)行探索。另外，本研究發(fā)現(xiàn)單接拮抗菌QH-588時(shí)，葉片與接種無菌水效果無差別，可見萎縮芽孢桿菌菌株QH-588對(duì)櫻桃葉片無毒害作用，表明菌株QH-588可應(yīng)用于生產(chǎn)中防治櫻桃葉斑病。

4 結(jié)論

從枸杞根際土壤中分離獲得的萎縮芽孢桿菌菌株QH-588不僅在培養(yǎng)基上對(duì)細(xì)極鏈格孢菌、鏈格孢菌和楊柳刺盤孢菌具有穩(wěn)定且顯著的拮抗作用，在櫻桃離體葉片上也展示出一定的預(yù)防和防治效果，具有防治櫻桃葉斑病的生防潛力。

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收稿日期：2021-06-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760539）;青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2021-ZJ-Y08）

通訊作者：姚強(qiáng)（1978-），https：//orcid.org/0000-0001-8873-1737，博士，副研究員，主要從事植物病害研究工作，E-mail：yaoqiang 2010@126.com;郭青云（1965-），https：//orcid.org/0000-0002-0829-7641，研究員，主要從事生物防治研究工作，E-mail：guoqingyunqh@163.com

第一作者：朱杰（1997-），https：//orcid.org/0000-0002-7164-2145，研究方向?yàn)橹参锊『ι锓乐危珽-mail：863238253@qq.com