白蠟多年臥孔菌多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

魯 鐵，李 登，謝文凱，余傳東，陳懷中，3，尚浩樂，楊柳杰，劉 宇，謝朝暉*

（1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025；3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

白蠟多年臥孔菌（Perenniporia fraxinea）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycets），蘑菇綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），多年臥孔菌屬（Perenniporia）[1-3]。其菌絲體是由絲狀真菌菌絲連結(jié)在一起組成的營養(yǎng)體類型；子實體是其產(chǎn)孢構(gòu)造，由已組織化的菌絲體組成。目前主要分布于我國安徽、北京、福建、廣東、江蘇、江西、四川、云南、浙江等地。白蠟多年臥孔菌作為一種常見的白色真菌，是重要的生物資源，其多糖提取物可通過激活機體的免疫系統(tǒng)達(dá)到抑制腫瘤、抗氧化活性的目的[4-5]。

真菌多糖提取的常用方法有復(fù)合酶解法[6]、酸堿提取法[7]、超聲提取法[8-9]。目前對于多糖的提取方法研究較為成熟，但是不同的原料對提取方法有所要求，原料的結(jié)構(gòu)與來源均會導(dǎo)致多糖的水溶性和極性不同。傳統(tǒng)的熱水浸提法用時長，復(fù)合酶解法必須嚴(yán)格控制提取條件，操作難度大，酸堿提取法容易破壞多糖結(jié)構(gòu)。而超聲波輔助水提醇沉法可在保證多糖結(jié)構(gòu)不被破壞的同時加快提取的速度，且操作簡單，提取率高。目前白蠟多年臥孔菌活性物質(zhì)在國內(nèi)外研究較少，研究表明，白蠟多年臥孔菌的其粗多糖提取物有一定的體外抗氧化活性。子實體的乙醇提取物具有較強的抑制宮頸癌Hela細(xì)胞株的能力[10]。目前，未對白蠟多年臥孔菌多糖的提取物進(jìn)行系統(tǒng)化工藝優(yōu)化以及抗氧化評估。

本研究以多糖提取率為評價指標(biāo)，采用超聲輔助水提醇沉法提取白蠟多年臥孔菌子實體及菌絲體多糖，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化白蠟多年臥孔菌子實體、菌絲體的粗多糖提取工藝，并測定其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基的清除能力，以及對油脂的抗氧化能力。以期為白蠟多年臥孔菌多糖的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

白蠟多年臥孔菌（Perenniporia fraxinea）990715經(jīng)野外采集，組織分離保存于平頂山健康食品協(xié)同創(chuàng)新中心菌種庫。

1.1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；DPPH：北京索萊寶科技有限公司；ABTS（純度≥98%）、水楊酸（純度≥98%）：宜興市申光醫(yī)藥化工有限公司；金龍魚菜籽油：益海嘉里公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型水浴鍋：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；KQ-50B型超聲儀：昆山市超聲波儀器有限公司；PE Eenspire型酶標(biāo)儀：美國PE公司；KDC-1044型低速離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司；GFL-125型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津萊玻特瑞儀器有限公司；MJ-78A型高壓蒸汽滅菌鍋：上海施都凱儀器設(shè)備有限公司；JP-100A-2型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體的粗多糖提取工藝

流程及操作要點

操作要點：

白蠟多年臥孔菌原料預(yù)處理：子實體按照文獻(xiàn)[3]的方法栽培獲得，菌絲體按照文獻(xiàn)[11]的方法培養(yǎng)獲得，菌絲體和子實體經(jīng)過65 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥處理，粉碎機粉碎過40目篩，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

加水?dāng)嚢瑁悍Q取0.1 g白蠟多年臥孔菌子實體（菌絲體），按照一定的液料比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g∶mL））加水。

超聲提?。涸诔暪β?00 W、提取溫度70 ℃條件下，超聲提取（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）。

水浸提、離心：水浸提溫度為80 ℃，提?。?0 min、60 min、80 min、100 min、120 min）后，于4 500 r/min離心10 min，取其上清液。

濃縮：在101 kPa，50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至原體積的四分之一左右。

除蛋白：采用Sevage法除蛋白，加入等體積Sevage溶液，振蕩10 min，4 000 r/min離心10 min，得上清液[12]。

醇沉：粗子實體和菌絲體上清液按照1∶3的比例加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇于4 ℃醇沉過夜，上清液在4 000 r/min室溫（25 ℃）下離心5 min，將沉淀用無水乙醇洗滌3次，將沉淀溶于1 mL蒸餾水中，得到白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體粗多糖溶液。

1.3.2 白蠟多年臥孔菌子實體（菌絲體）粗多糖提取工藝優(yōu)化

單因素試驗：分別考察不同的料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g∶mL））、超聲時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）和提取時間（40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）對白蠟多年臥孔菌多糖提取率的影響。

響應(yīng)面試驗：根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，利用Box-Benhnken試驗設(shè)計[13-14]，選取料液比（A）、提取時間（B）和超聲時間（C）3個因素為自變量，分別以白蠟多年臥孔菌子實體多糖提取率（Y1）、菌絲體多糖提取率（Y2）為響應(yīng)值，每個因素設(shè)置3個水平，分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，采用Box-Benhnken試驗設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 子實體和菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for extraction process optimization of fruiting bodies and mycelium polysaccharides

1.3.3 分析檢測

（1）白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖體外抗氧化活性的測定

以同質(zhì)量濃度維生素C（vitamin C，VC）溶液為陽性對照，采用二倍稀釋法配制成質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖溶液。DPPH·清除率的測定參考文獻(xiàn)[15-17]；ABTS+·清除率的測定參考文獻(xiàn)[18]。

（2）白蠟多年臥孔菌多糖抗植物油脂氧化能力的測定

采用Schaal烘箱法[19]，分別稱取50 mg的白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖，添加至100 mL菜籽油中，攪拌均勻后，將其放置于60 ℃烘箱中，每隔12 h對油脂樣品利用玻璃棒攪拌1次，分別在第0、2、4、6和8天測定過氧化值（peroxide value，POV），同時以未添加白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖的植物油為對照組。參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》，測定其過氧化值（POV），以評價白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖抗油脂氧化效果。

（3）多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[20-22]，在波長490 nm處測定吸光度值[23]。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.059 7x+0.024 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中多糖含量。

多糖提取率的計算：將樣品溶液稀釋10倍后得到待測液。取100 μL待測液于5 mL的試管中。多糖提取率（Y）計算公式如下：

式中：C為粗多糖的含量，g/mL；V為白蠟多年臥孔菌溶液的體積，mL；N為稀釋的倍數(shù)；M為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Design Expert11.0進(jìn)行響應(yīng)面分析，使用軟件Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 料液比的確定

料液比對白蠟多年臥孔菌子實體、菌絲體多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對子實體及菌絲體多糖提取率的影響Fig. 1 Effect of solid and liquid ratio on extraction rates of fruiting bodies and mycelium polysaccharides

由圖1可知，當(dāng)料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）時，子實體多糖提取率隨著液體比例的增加而逐漸提高；當(dāng)料液比為1∶60（g∶mL）時，子實體多糖提取率最高，為3.38%；當(dāng)料液比在1∶70（g∶mL）時，子實體多糖提取率下降。當(dāng)料液比為1∶20、1∶30（g∶mL）時，菌絲體多糖的提取率逐漸增加；當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時，菌絲體多糖提取率最高，為5.25%，隨著液體占比繼續(xù)增加，菌絲體多糖提取率逐漸下降。原因可能是，溶劑越多，多糖更易溶出，從而多糖提取率提高，當(dāng)多糖溶解達(dá)到平衡時，再增加溶劑的量時，使得水溶性物質(zhì)析出量增加，從而導(dǎo)致多糖提取率相對減少[13，24]。因此，最佳提取子實體多糖和菌絲體多糖的料液比分別為1∶60（g∶mL）和1∶30（g∶mL）。

2.1.2 提取時間的確定

提取時間對白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取時間對子實體及菌絲體多糖提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on extraction rates of fruiting bodies and mycelium polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)提取時間為40～80 min時，子實體多糖逐漸增加；提取時間為80 min時，子實體多糖提取率達(dá)到最大值3.42%；提取時間從80 min增加至120 min時，多糖提取率逐漸下降。隨著提取時間在40～100 min范圍內(nèi)的增加，菌絲體多糖提取率逐漸增加，提取時間為100 min時；菌絲體多糖提取率值最大，為5.65%；提取時間＞100 min之后，菌絲體多糖提取率下降。其原因可能是，在提取物與提取料液未達(dá)到擴散平衡前，提取時間越長意味提取物與提取液相互作用時間越長，因此提取率越高[25]。但提取時間太長會導(dǎo)致多糖的提取率下降，可能是由于多糖在水中浸提時間過長，結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致多糖含量減少[26]。因此，最佳的子實體、菌絲體多糖提取時間分別為80 min、100 min。

2.1.3 超聲時間的確定

超聲時間對白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖提取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著超聲時間在5～15 min范圍內(nèi)的增加，子實體多糖和菌絲體多糖的提取率均逐漸增加；超聲時間為15 min時，多糖提取率均達(dá)到最大值，子實體多糖提取率為2.56%，菌絲體多糖提取率為5.06%；當(dāng)提取時間＞15 min之后，子實體多糖和菌絲體多糖的提取率均逐漸下降。其原因可能為較短的超聲時間不能使多糖完全溶出。當(dāng)超過最佳超聲時間時，雜質(zhì)溶出會抑制多糖溶出，同時由于機械波和熱效應(yīng)作用會破壞多糖結(jié)構(gòu)，使多糖提取率降低[27-28]。因此，最佳子實體多糖與菌絲體多糖超聲時間均為15 min。

圖3 超聲時間對子實體及菌絲體多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic time on extraction rates of fruiting bodies and mycelium polysaccharides

2.2 白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比（A）、提取時間（B）和超聲時間（C）為主要影響因素，以白蠟多年臥孔菌子實體（Y1）和菌絲體多糖提取率（Y2）為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗。子實體和菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化Box-Benhnken響應(yīng)面試驗設(shè)計[29-30]結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 子實體和菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments design for extraction process optimization of fruiting bodies and mycelium polysaccharides

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用統(tǒng)計軟件Design-Expert V8.0.6對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析并進(jìn)行多元擬合，得到白蠟多年臥孔菌子實體（Y1）、菌絲體多糖提取率（Y2）的二次多項回歸方程：

由表3可知，子實體多糖提取工藝優(yōu)化模型回歸極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.055 0＞0.05），說明構(gòu)建的模型合理。模型決定系數(shù)R2為0.981 9、調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.958 7，在該模型中，一次項A、B、C對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，根據(jù)影響子實體多糖提取率的程度，對因素排序為：提取時間（B）＞料液比（A）＞超聲時間（C）。

菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化模型回歸極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.503 8＞0.05），說明構(gòu)建的模型合理。模型決定系數(shù)R2為0.993 7、調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.985 6，在該模型中，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可知，根據(jù)影響菌絲體多糖提取率的程度，對因素排序為：超聲時間（C）＞提取時間（B）＞料液比（A）。各因素交互作用對子實體和菌絲體多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖4。

圖4 各因素交互作用對子實體（a）和菌絲體（b）多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on extraction rates of fruiting bodies (a) and mycelium (b) polysaccharides

由圖4（a）可知，各因素交互作用對子實體多糖提取率影響的響應(yīng)面曲線呈現(xiàn)出拋物線狀，說明所擬合的回歸模型有極大值點。料液比與超聲時間的交互作用對子實體多糖提取率影響極顯著（P＜0.01），而其余兩兩因素的交互作用影響較小，與方差分析的結(jié)果一致。子實體粗多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶61.146（g∶mL）、提取時間76.151 min和超聲時間16.277 min。在此條件下，白蠟多年臥孔菌子實體粗多糖提取率的預(yù)測值為4.388%?？紤]到實際操作情況，將最佳提取工藝條件設(shè)為料液比1∶60（g∶mL）、提取時間76 min和超聲時間16 min。為驗證回歸模型的有效性，采用優(yōu)化后的提取工藝條件進(jìn)行3次驗證試驗，子實體多糖提取率平均實際值為4.38%，和預(yù)測值接近，表明該模型能較準(zhǔn)確反應(yīng)各因素對子實體多糖提取率的影響。

由圖4（b）可知，各因素交互作用對菌絲體多糖提取率影響的響應(yīng)面曲線呈拋物線狀，說明所擬合的回歸模型有極大值。提取時間與超聲時間的交互作用對菌絲體多糖提取率的影響較大，而其余兩兩因素的交互作用影響較小，這與方差分析的結(jié)果一致。菌絲體粗多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶29.832（g∶mL）、提取時間100.888 min和超聲時間15.997 min。在此優(yōu)化條件下，白蠟多年臥孔菌菌絲體多糖提取率的預(yù)測值為6.325%。考慮到實際操作情況，將最佳提取工藝條件設(shè)為料液比1∶30（g∶mL）、提取時間101 min和超聲時間16 min。在此條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，所得菌絲體多糖提取率平均實際值為6.33%，與預(yù)測值接近，表明該模型能較準(zhǔn)確反應(yīng)各因素對菌絲體多糖提取率的影響。

2.3 白蠟多年臥孔菌多糖體外抗氧化能力

子實體和菌絲體多糖對DPPH·（a）、ABTS+·（b）清除率的影響見圖5。

圖5 子實體和菌絲體多糖對DPPH·（a）、ABTS+·（b）的清除率Fig. 5 Scavenging rates of fruiting bodies and mycelium polysaccharides on DPPH·(a) and ABTS+·(b)

由圖5（a）可知，隨著多糖質(zhì)量濃度在0.5～2.0 mg/mL范圍內(nèi)的上升，子實體與菌絲體多糖對DPPH·的清除率逐漸增加，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時，子實體和菌絲體多糖對DPPH·的清除率達(dá)到最大值，分別為45.67%和51.67%，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，對DPPH·的清除率逐漸降低。子實體和菌絲體多糖對DPPH·有較高的抗氧化活性，前期的研究多糖的制備沒有經(jīng)過除蛋白處理，糖蛋白的形式相對于多糖表現(xiàn)出較好的清除DPPH·的能力[31]。

由圖5（b）可知，隨著多糖質(zhì)量濃度在0.5～2.0 mg/mL范圍內(nèi)增加，子實體與菌絲體多糖對ABTS+·清除作用逐漸增強，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時，子實體和菌絲體多糖的清除率達(dá)到最大值，分別為72.89%和75.83%，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，對ABTS+·的清除率逐漸降低。

2.4 白蠟多年臥孔菌多糖的油脂抗氧化能力

將白蠟多年臥孔菌多糖添加至植物菜籽油中，通過加速氧化方法研究隨著時間的延長白蠟多年臥孔菌多糖對于植物油抗氧化的效果，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著時間的延長，陽性對照組的油脂POV幾乎隨著時間變化而成線性增加，而白蠟多年臥孔菌子實體和菌絲體多糖組POV僅僅隨著時間的延長緩慢增加。加熱至第8天，白蠟多年臥孔菌菌絲體多糖組POV僅為對照組的49%，與初始值相比較，POV增加了142%，而對照組POV增加量為211%。菌絲體的抗油脂氧化能力略大于子實體的抗油脂氧化能力，可能是因為菌絲體的多糖純度較高。說明了提取的白蠟多年臥孔菌多糖具有明顯的抗油脂氧化效果，可嘗試用于開發(fā)天然的植物油脂抗氧化劑，但是白蠟多年臥孔菌多糖的得率較低，且在植物油中的溶解度比較小，尚不能大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。

圖6 子實體和菌絲體多糖抗油脂氧化能力Fig. 6 Anti-lipid oxidation ability of fruiting bodies and mycelium polysaccharides

3 結(jié)論與討論

白蠟多年臥孔菌子實體多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶60（g∶mL）、提取時間76 min和超聲時間16 min。在此優(yōu)化條件下，子實體多糖提取率為4.39%。菌絲體多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶30（g∶mL）、提取時間101 min和超聲時間16min，在此優(yōu)化條件下，菌絲體多糖提取率為6.33%?？寡趸囼灲Y(jié)果表明，當(dāng)多糖溶液的質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，子實體多糖對DPPH·、ABTS+·的清除率分別為45.67%、72.89%；菌絲體多糖對DPPH·、ABTS+的清除率分別為51.67%、75.83%。子實體、菌絲體多糖均對ABTS+·有較好的清除能力，對DPPH·的清除能力次之。在白蠟多年臥孔菌多糖抗油脂氧化能力的實驗中，白蠟多年臥孔菌菌絲體、子實體多糖能顯著降低植物油的POV，表明白蠟多年臥孔菌多糖具有一定的抗油脂氧化效果。本研究可為白蠟多年臥孔菌多糖作為天然的抗氧化劑的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。后續(xù)可從多糖及其蛋白的結(jié)合機制上解析抗氧化活性的方向進(jìn)行研究。