食品中γ-谷氨酰肽的研究進展

辛世華，韓小珍，賀曉光*

（1.寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院旅游管理系，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué)學(xué)術(shù)期刊中心，寧夏銀川 750021；3.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021）

“民以食為天，食以安為本，食以味為先”的中國傳統(tǒng)飲食理念涵蓋了食物的三大屬性（基本屬性、生理屬性和修飾屬性），滋味是主要的修飾屬性，也是食物的基本特征[1]。滋味是由食物中的氨基酸、糖類、肽類等一些親水性的小分子或離子溶于唾液并刺激口腔內(nèi)特定的味覺受體，通過神經(jīng)傳導(dǎo)最終產(chǎn)生味感[2]。酸、甜、苦、咸、鮮是人們廣泛熟知的五種基本滋味[3]，厚味（kokumi）是繼酸、甜、苦、咸、鮮之后的第6種滋味，主要代表食物的濃厚感（thickness）、持續(xù)性（continuity）、飽滿感（mouthfulness）和協(xié)調(diào)性（har mony of taste）。Kokumi物質(zhì)的特點是，當(dāng)添加到基本的味道溶液或食物中，它能夠提升5種基本口味的協(xié)調(diào)性和呈味強度（尤其是鮮味），使食品產(chǎn)生整體味感、增加味的持續(xù)性和延滲性[4-5]。目前已報道的kokumi物質(zhì)多數(shù)為短肽類，其中γ-谷氨酰肽是厚味的主要貢獻者，所以，γ-谷氨酰肽也稱為γ-kokumi肽[6]。γ-谷氨酰肽憑借其良好的味覺特性，不僅影響食品的營養(yǎng)和感官評價，還能與糖、核苷酸等呈味分子組合使用提升鮮味強度并增強濃厚味，所以γ-谷氨酰肽具有極大的開發(fā)價值和市場前景[7]。

隨著研究的深入，γ-谷氨酰肽參與人體生理活性的機制以及呈味機制逐漸明晰，在醫(yī)療領(lǐng)域和食品領(lǐng)域具有巨大的潛力，已成為近年來國內(nèi)外的食品鮮味科學(xué)的研究熱點。基于此，本文對γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)特征、呈味機制、制備方法及檢測方法進行了綜述，旨在為γ-谷氨酰肽的深入研究和新型鮮味劑的開發(fā)提供理論參考。

1 γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)特征

γ-谷氨酰肽廣泛分布于自然界中[8]。γ-谷氨酰肽是由谷氨酸的γ-COO-與γ-谷氨?；荏w（R基團）的NH3+脫水縮合而成，其中R基團可以為多肽或者游離氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，γ-谷氨酰肽分子質(zhì)量大小和其特有的N末端的γ-谷氨?；瞧滟x予食物濃厚味的關(guān)鍵因素[7，9]。具有Kokumi活性的γ-谷氨酰肽一般具有以下特征：①當(dāng)γ-谷氨酰肽的分子質(zhì)量低于1 000 Da時能夠使食物產(chǎn)生濃厚、飽滿感且連續(xù)性的口感[10]；②具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽類物質(zhì)幾乎都是二肽和三肽類物質(zhì)；③γ-谷氨酰肽的氨基酸組成也會明顯影響其呈味效果，C-末端殘基、中間殘基和含硫基團對其濃厚味具有重要影響[11]。當(dāng)C-末端殘基為無側(cè)鏈的甘氨酸（glycine，Gly）時，可進一步增強γ-谷氨酰肽的濃厚味活性[12]；當(dāng)其第2個殘基處為L-構(gòu)型的中小型脂肪族、中性或非極性取代基時，γ-谷氨酰肽與受體的結(jié)合增強，呈味活性提高[13]；進一步的，γ-谷氨酰肽殘基側(cè)鏈中有含硫基團（-SH）時，濃厚味強度會增強，原因是-SH在舌尖上產(chǎn)生的輕微收斂感引起的[13]；④研究發(fā)現(xiàn)，部分kokumi肽中存在如纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸等疏水性苦味氨基酸時，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)不僅能夠降低這些苦味氨基酸帶來的苦味強度，還能產(chǎn)生更加飽滿、豐富的kokumi風(fēng)味[5，14]。

2 γ-谷氨酰肽的呈味機制

國內(nèi)外關(guān)于γ-谷氨酰肽的呈味機理及其風(fēng)味特點的描述逐漸趨同，即當(dāng)其溶于水溶液時基本沒有味道或味道很淡，當(dāng)添加到含有基本味覺物質(zhì)的食品體系中時，他們能夠與食品中的基本味覺物質(zhì)相互協(xié)同增效，使得食物的咸鮮味明顯增加，賦予食品明顯的厚味或者增強的厚味，同時，此類γ-谷氨酰肽在水溶液中的呈味閾值明顯高于食品體系中的閾值[15]。

2.1 γ-谷氨酰肽的呈味機理

關(guān)于5種滋味（酸、甜、苦、咸、鮮）的特異性受體早有報道[16]。對于厚味γ-kokumi肽的受體研究報道稍晚一些，而對厚味味覺受體的發(fā)現(xiàn)是厚味研究的突破性進展。2009年，SAN G A等[17]發(fā)現(xiàn)小鼠的味感細胞中存在鈣離子敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR），并首次證實了CaSR是引起哺乳動物濃厚味感的潛在味覺組織。2010年，OHSU T等[18]將鈣離子敏感受體在卵母細胞和HEK-293細胞中成功表達，并發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽的厚味特性與其對鈣離子敏感受體的激活強度呈正相關(guān)關(guān)系；隨后KURODA M等[8]的研究不僅證實了這一點，還證實了CaSR參與了γ-谷氨酰肽的呈味反應(yīng)，因為當(dāng)他們向反應(yīng)液中加入CaSR特異性拮抗劑NPS-2143后，γ-谷氨酰肽的味覺強度顯著降低。因此，γ-谷氨酰肽厚味與CaSR之間存在較好的關(guān)聯(lián)性。AMINO Y等[10]測試了100種已知氨基酸序列的γ-谷氨酰二肽和三肽對CaSR的激活作用，發(fā)現(xiàn)N端為γ-谷氨酰殘基，中間連接中等大小、脂肪族、中性取代基的γ-谷氨酰二肽或者三肽不僅具有厚味，還具有很強的激活鈣離子敏感受體的能力，證明了γ-谷氨酰肽的呈味機理，即鈣離子敏感受體是濃厚味產(chǎn)生的重要原因。

2.2 γ-谷氨酰肽對鈣離子敏感受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用

鈣離子敏感受體（CaSR）是一種存在于細胞膜表面的細胞表面蛋白，能夠在細胞和組織中表達，如味覺細胞、骨、腎臟、甲狀旁腺、小腸等[19]。CaSR具有促進細胞生長、繁殖以及刺激胃腸激素分泌和腸道蠕動等功能[20]。CaSR由1 078個氨基酸殘基組成，屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein coupled receptors，GPCR）C家族的第二組成員[21]。CaSR可分為3個獨立的區(qū)域，包括細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、細胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。其中，細胞外結(jié)構(gòu)域主要包含了二裂片狀的捕蟲夾（venus-flytrap，VFTD）結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合多種識別配體以激活CaSR，進而啟動下游信號通路，實現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞生理活動的功能[11-22]。CaSR胞外氨基（-NH2）末端結(jié)構(gòu)域是配體結(jié)合區(qū)[23]。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域約含有5個蛋白激酶C和2個蛋白激酶A的磷酸化作用位點[24]。跨膜結(jié)構(gòu)域中的2個半胱氨酸殘基（cysteine 677和765）對維持CaSR構(gòu)象很關(guān)鍵，次結(jié)構(gòu)域包含Ca2+結(jié)合位點[23-24]。

每個味蕾由50～150個特殊味覺受體細胞（taste receptor cell，TRC）組成，TRC則分為4種類型：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ型（見圖1）[11]，其中接收鮮、甜、苦味的GPCR受體在Ⅱ型TRC通路中，甜味受體是異二聚體T1R2/T1R3，苦味受體為T2Rs受體家族，鮮味受體是異二聚體T1R1/T1R3[23]；而CaSR在Ⅱ、Ⅲ型TRC中都有表達，且主要在Ⅲ型中表達[25]。相同的是Ⅱ和Ⅲ型都是首先通過CaSR激活的信號通路以增強Ca2+的釋放。如厚味物質(zhì)（谷胱甘肽，谷氨酸）結(jié)合特異性受體CaSR通過磷脂酶（phospholipase，PLC）依賴性途徑提高胞內(nèi)Ca2+濃度[26]。不同的是Ⅱ型TRC通路增強Ca2+的釋放，進而提高細胞動作電位并加強ATP的釋放，從而增強厚味；而Ⅲ型TRC中胞內(nèi)Ca2+濃度的增加與神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的釋放有關(guān)，5-HT通過對Ⅱ型TRC有負反饋調(diào)節(jié)，會抑制其三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的釋放，但5-HT是否以CaSR依賴性方式釋放目前尚不清楚。同時CaSR在Ⅱ、Ⅲ型TRC中都能表達，但具體它們之間的信號傳導(dǎo)是否有疊加效應(yīng)，能否增強滋味的濃厚感還有待研究。

圖1 CaSR在味覺細胞中的信號傳導(dǎo)途徑[11]Fig. 1 Signal transmission pathway of CaSR in taste cells[11]

3 γ-谷氨酰肽的制備

由于γ-谷氨酰肽獨特的呈味特點和增味功能，含有γ-谷氨酰肽的食用調(diào)味品生產(chǎn)日益受到人們關(guān)注，因為γ-kokumi肽大規(guī)模生產(chǎn)能力較低，目前市場上γ-kokumi肽類食物增味劑非常少，僅有谷胱甘肽（glutathione，GSH）或富含GSH的酵母提取物[27]。目前自然提取法、化學(xué)合成法和生物合成法是制備γ-谷氨酰肽的主要方法，其中生物合成法又分為微生物發(fā)酵法和酶合成法[10]。

3.1 自然提取法

自然提取法主要應(yīng)用于谷胱甘肽和茶氨酸的提取。因為這兩種物質(zhì)是人們最早發(fā)現(xiàn)具有獨特呈味特性的γ-谷氨酰肽。但由于提取工序繁瑣且需要使用有機試劑，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)而逐漸被淘汰[28]。

3.2 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是以產(chǎn)物氨基酸為原料，經(jīng)過肽鍵縮合等化學(xué)反應(yīng)來合成γ-谷氨酰肽的方法?；瘜W(xué)合成法多用于純度要求極高的γ-谷氨酰肽的制備，且主要集中在二肽和三肽的合成，如谷胱甘肽。其特點是純度高、穩(wěn)定性好，是許多試劑公司制備γ-谷氨酰肽的首選方法。如HAMMERL R等[29]學(xué)者以樹脂為原料，在實驗室成功制備出純度99%的γ-Glu-Thr，γ-Glu-Asp和γ-Glu-Lys。但化學(xué)合成法通過對活性基團進行保護或者屏蔽，在制備過程中需要使用過量的偶聯(lián)劑和?；噭嬖诓僮鞣爆?、反應(yīng)復(fù)雜，成本高，產(chǎn)率低，化學(xué)物毒性等問題，其產(chǎn)物主要應(yīng)用于實驗室的分析檢測，不適用于γ-谷氨酰肽的工業(yè)化水平大規(guī)模生產(chǎn)[10，14，30]。

3.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用特定微生物代謝活動產(chǎn)生的多種酶類，將廉價的原料在特定的培養(yǎng)環(huán)境下催化為γ-谷氨酰肽的方法。代表性的如谷胱甘肽（GSH）是利用酵母菌發(fā)酵實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的γ-谷氨酰肽[31]。VALERIO F等[32]利用植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)品制備低鹽酵母發(fā)酵法面包，將植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物（Bio21B）作為增味劑應(yīng)用于面包發(fā)酵過程，得到了含鹽量降低20%和50%的酵母發(fā)酵法面包，同時含Bio21B的酵母發(fā)酵面包增加了幾種鮮味和厚味γ-谷氨酰肽味道相關(guān)分子的存在。SOFYANOVICH O A等[33]證明釀酒酵母通過2種代謝途徑合成了γ-Glu-Val-Gly。PHEWPAN A等[34]從泰國淡水魚發(fā)酵樣品檢測出了以四球菌、葡萄球菌、乳酸菌為主的4種細菌，并發(fā)現(xiàn)了17種谷氨酰肽。研究表明，發(fā)酵食品中的微生物代謝活動與γ-谷氨酰肽的形成有密切的關(guān)系。

利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-谷氨酰肽的原料來源廣泛，成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的前景。然而存在的問題也較突出，如常見的發(fā)酵食品都是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵，用料成分復(fù)雜，微生物細胞內(nèi)的酶體系復(fù)雜，無法獲得單一的目標γ-谷氨酰肽，分離純化具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽較困難，其次發(fā)酵菌株和工藝流程需要優(yōu)化以提高產(chǎn)率。所以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-谷氨酰肽存在時間久、產(chǎn)能低效、提純難、產(chǎn)業(yè)化難度較高等問題。

3.4 酶合成法

酶合成法是特定酶在適宜條件下將底物催化合成γ-谷氨酰肽的方法。γ-谷氨酰肽在生物體內(nèi)的代謝合成途徑見圖2。γ-谷氨酰肽參與生物體的多種生命活動，可由谷胱甘肽合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等催化合成。目前文獻報道的具有合成γ-谷氨酰肽能力的酶制劑主要有：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamyl cysteine synthetase，CSASE）、谷氨酰胺酶（glutaminase）EC3.5.1.2和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GGT）。谷氨酰半胱氨酸合成酶催化合成γ-谷氨酰肽多見于動物體，反應(yīng)需要消耗ATP，酶活力受到ADP和產(chǎn)物的反饋抑制，需要連續(xù)的能量供應(yīng)才能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[35]。下面重點介紹下合成γ-谷氨酰肽最常用谷氨酰胺酶（glutaminase）EC3.5.1.2和γ-GGT。

圖2 γ-谷氨酰肽的生物合成途徑Fig. 2 Biosynthetic pathway of γ-glutamyl peptides

3.4.1 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶廣泛存在于細菌、真菌和酵母菌等微生物中[36-37]。不同來源的谷氨酰胺酶專一性不同，根據(jù)底物的特異性將其分為兩大類，一類僅能以谷氨酰胺為底物水解為谷氨酸；另一類谷氨酰胺和天冬酰胺均可作為底物，在催化谷氨酰胺水解為谷氨酸的同時也可以催化天冬酰胺水解為天冬氨酸。除了水解活性，部分來源的谷氨酰胺酶也具有轉(zhuǎn)肽活性，如硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）源的谷氨酰胺酶，可催化谷氨酰胺中的γ-谷氨酰部分轉(zhuǎn)移到甲基或者乙基上，進而合成了茶氨酸[35]。

在工業(yè)生產(chǎn)中，谷氨酰胺酶主要應(yīng)用于醬油發(fā)酵，能夠?qū)⑨u油發(fā)酵過程中產(chǎn)生的谷氨酰胺水解為具有鮮味的谷氨酸。YANG J等[36]將解淀粉芽孢桿菌源的谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)肽合成的γ-谷氨酰肽（γ-[Glu]（n≤5）-Phe/Val/Met）添加到雞湯和醬油中，能夠增加雞湯和醬油的kokumi味；并且YANG J等[30]將其添加腐乳發(fā)酵過程中，不僅成功消除了腐乳表面的白色顆粒（酪氨酸和苯丙氨酸），其合成的γ-谷氨酰肽還改善了腐乳的kokumi風(fēng)味。SUZUKI H等[38]的研究也證明了解淀粉芽孢桿菌源的谷氨酰胺酶能夠顯著增加谷蛋白和大豆蛋白水解產(chǎn)物的kokumi味。相信隨著更多產(chǎn)谷氨酰胺酶的微生物的發(fā)現(xiàn)，也會有更多微生物源谷氨酰胺酶可用于催化γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽反應(yīng)進而合成γ-谷氨酰肽。

3.4.2γ-氨酰轉(zhuǎn)肽酶

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GGT）能夠水解γ-谷氨?；衔锊⑵洇?谷氨?；糠洲D(zhuǎn)移至氨基酸和肽上形成新的γ-谷氨酰肽，所以GGT屬于轉(zhuǎn)移酶而不是合成酶。GGT酶活力較高，對γ-谷氨?；荏w的特異性要求不高，反應(yīng)不需要消耗能量，所以是目前用來制備γ-谷氨酰肽最常用的一種生物酶制劑，具有大規(guī)模生產(chǎn)γ-kokumi肽的應(yīng)用前景[14]。

TOELSTEDE S等[39]研究指出，藍色脈紋奶酪中的青霉菌通過γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成了其具有濃厚味的γ-谷氨酰肽；VAN H T等[40]將枯草芽孢桿菌來源的GGT添加至發(fā)酵豆醬中，γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Val的濃度顯著提高，使豆醬的鮮味和濃厚味增加，改善了豆醬的風(fēng)味。

目前利用發(fā)酵法制備γ-谷氨酰肽的主要困難是需篩選出優(yōu)良菌株，改進發(fā)酵工藝和發(fā)展分離純化技術(shù)。已有大量學(xué)者將從地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）或大腸桿菌（Escherichia coli）中分離純化得到的GGT酶應(yīng)用于γ-谷氨酰肽的生產(chǎn)[41]。運用谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶制備γ-谷氨酰肽的過程中，GGT相較于谷氨酰胺酶具有更加強大的轉(zhuǎn)肽活性，而谷氨酰胺酶受體的底物特異性較差，γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移活性較低，難以用于γ-kokumi肽的工業(yè)化生產(chǎn)。所以使用GGT生產(chǎn)γ-谷氨酰肽將為kokumi肽的食用調(diào)味品生產(chǎn)提供良好的發(fā)展前景。

4 γ-谷氨酰肽的檢測

γ-谷氨酰肽的檢測方法可分為感官評價法、生物學(xué)方法和化學(xué)法這3種方法[7]。感官評價法是根據(jù)γ-谷氨酰肽的呈味特性進行評定。生物檢測法即鈣敏感受體（CaSR）法是基于γ-谷氨酰肽能夠結(jié)合特異性受體CaSR，激活信號通路釋放Ca2+，進而激活細胞內(nèi)源性依賴Ca2+的氯離子通道產(chǎn)生可檢測性電流，通過測定電流響應(yīng)值即可測得γ-谷氨酰肽的含量[42]。化學(xué)法是根據(jù)γ-谷氨酰肽的生物學(xué)特性，進而對其進行定性及定量分析。不同的方法各有利弊，對γ-谷氨酰肽檢測方法的研究是目前γ-谷氨酰肽研究的重要部分，對于推動呈味肽的發(fā)展具有重要的意義。

4.1 感官評價法

γ-谷氨酰肽單獨溶于水溶液時基本沒有味道或味道很淡，當(dāng)其添加到含有五種味覺體系（酸、甜、苦、咸、鮮味）或其混合味溶液的食品體系中時，能夠與食品中的基本味覺物質(zhì)相互協(xié)同增效，賦予食品明顯的厚味或者增強濃厚感。依據(jù)這一特性，再借助人的味覺器官對食品體系進行描述，最后經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得出的最終感官評價結(jié)果即γ-谷氨酰肽的感官評價法[43]。MIYAKI T等[6]將微量的γ-Glu-Val-Gly添加至雞湯中，通過感官評價法與對照組（未添加γ-Glu-Val-Gly）相比發(fā)現(xiàn)，在99%的置信水平上微量的γ-Glu-Val-Gly可以顯著增加雞湯的鮮味和滿口感；MIYAMURA N等[44]將γ-Glu-Val-Gly添加到低脂花生醬，通過感官評價發(fā)現(xiàn)其顯著增強低脂花生醬的濃厚感。感官評價法雖然能夠快速對食物的風(fēng)味作出判定但判定結(jié)果存在一定的主觀性，同時由于kokumi味描述的復(fù)雜性，所以運用感官評價法判定kokumi風(fēng)味存在一定的局限性，難以滿足物質(zhì)kokumi強度的定量檢測。

4.2 生物檢測法

γ-谷氨酰肽的生物檢測法又稱為鈣敏感受體法，CaSR法，是基于kokumi肽可激活CaSR釋放Ca2+流而啟動一系列味覺信號傳遞，通過味覺系統(tǒng)使人體感知到食品體系的濃厚感、復(fù)雜感和持久感。CaSR法主要通過檢測CaSR激動劑進而檢測食品體系的濃厚感。CaSR激動劑是一種微小的有機分子物，對CaSR產(chǎn)生變構(gòu)激活作用，從而降低受體活化的閾值，因而產(chǎn)生濃厚感[2]。日本學(xué)者OHSU T等[18]首次用鈣敏感受體法（CaSR法）檢測一系列合成的γ-谷氨酰肽的kokumi滋味，結(jié)合感官分析發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽包括GSH（γ-Glu-Cys-Gly）和γ-Glu-Val-Gly均具有CaSR激動劑活性，可以增強甜味、咸味和鮮味，而加入CaSR特異性拮抗劑NPS-2143則顯著抑制厚味。這也是第一個研究表明CaSR在人類味覺感知中具有獨特功能的報道。KURODA M等[45]的研究也證明了這一點，同時CaSR活性與厚味強度相關(guān)。但并不是所有的CaSR激動劑都是濃厚感物質(zhì)，CaSR激動劑還包括γ-谷氨酰肽、部分陽離子、氨基酸藥劑、多胺類和堿性肽類。所以γ-谷氨酰肽的生物檢測法存在誤差大的缺陷，適合于γ-谷氨酰肽的初步篩選，能夠縮小人工篩選的范圍，進而降低成本。

4.3 化學(xué)法

化學(xué)法主要包括超濾法、色譜法如凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和反相高效液相色譜（reversed-high performance liquid chromatography，RPHPLC）、質(zhì)譜分析法如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法、毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜（capillary electrophoresis tandem mass spectrometry，CE-MS/MS）法和電噴霧飛行時間質(zhì)譜（electrospray timeof-flight mass spectrometry，ESI-TOF-MS）法以及核磁共振波譜（nuclearmgnetic resonance spectroscopy，NMR）法。為了能夠更加準確地對γ-谷氨酰肽定性和定量檢測，常將色譜法、質(zhì)譜法和核磁共振波譜法聯(lián)合使用。

4.3.1 超濾

超濾是一種以壓力差為推動力的膜分離方法，通過膜組件的膜孔徑將原料液分離和純化，是一種快速、有效獲得并濃縮目標分子質(zhì)量的方法。FENG T等[46]通過超濾、凝膠滲透色譜和反相高效液相色譜對新鮮雙孢菇中的部分肽進行了分離。從雙孢菇中分離到的kokumi肽，將其添加至雞湯中能夠提高雞湯的復(fù)雜性、厚味和適口性，經(jīng)過超高效液相色譜耦合四倍飛行時間質(zhì)譜法鑒定，其中的Gly-Leu-Pro-Asp和Gly-His-Gly-Asp是厚味產(chǎn)生的關(guān)鍵物質(zhì)。

4.3.2 色譜法

（1）凝膠滲透色譜

凝膠滲透色譜是利用凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同分子質(zhì)量的被分離物在凝膠色譜柱內(nèi)的通過路徑不同，最終以不同的時間段被洗脫下來而達到將樣品分離的目的。SHIBATA M等[47]運用超濾和凝膠滲透色譜（GPC）結(jié)合超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法分離鑒定大豆種子水提液厚味的關(guān)鍵物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰-酪氨酸和γ-谷氨酰-苯丙氨酸是被鑒定為“厚味”的關(guān)鍵物質(zhì)。大豆種子中的棉子糖和水蘇糖對增強γ-谷氨酰肽的“厚味”感覺有協(xié)同作用。這是首次報道γ-谷氨肽類和寡糖的聯(lián)合使用可以增加“厚味”強度，這表明大豆提取物可以用來增強食品中的“厚味”口感。超濾、凝膠滲透色譜是根據(jù)分子質(zhì)量大小來對原料液中的物質(zhì)進行初步篩選，還需要通過液相色譜對所得組分進一步分離純化得到單一純化的γ-谷氨酰肽。

（2）高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）屬于分配色譜，利用被分離組分在流動相和固定相中的分配特性差異從而實現(xiàn)分離。NAKAMOTO M等[48]采用高效液相色譜（HPLC）法、核磁共振和液相色譜儀-質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）法對陳蒜提取物進行了研究，分離得到3種γ-谷氨酰三肽（γ-glutamyl-γ-glutamyl-S-allylcysteine，γ-glutamyl-γ-glutamyl-S-methylcysteine和γ-glutamyl-γ-glutamyl-S-1-propenyl-cysteine）；KURODA M等[49]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定各類奶酪中γ-Glu-Val-Gly的含量。結(jié)果表明，奶牛和羊奶制作的奶酪中γ-Glu-Val-Gly濃度的不同是由于酪蛋白氨基酸序列的不同造成。

（3）反相高效液相色譜

食物中γ-谷氨酰肽的檢測多通過反相高效液相色譜對樣品進行分離。ZHU X P等[50]采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法分離全黃豆和脫脂黃豆發(fā)酵生產(chǎn)的兩種醬油的美味肽，并通過超高效液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，從2種醬油中分別分離出16和14個美味肽，其中3個γ-谷氨酰二肽（γ-Glu-Glu、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Leu）。反相高效液相色譜具有靈敏、快速準確，重復(fù)性好，高效的特點，已被應(yīng)用于多種食品的檢測中，如酵母提取物、火腿、雙孢菇、蠶豆中[47]。

4.3.3 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜分析法利用電場和磁場的作用將運動的帶有不同質(zhì)荷比的離子進行分離，通過測定離子的準確質(zhì)量確定物質(zhì)化學(xué)組成的方法[44]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜分析也由簡單的二級串聯(lián)質(zhì)譜發(fā)展到毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和電噴霧飛行時間質(zhì)譜等。

（1）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

ZHAO J[51]在MRM模式下使用LC-MS/MS測定不同羅伊氏乳桿菌的γ-谷氨酰二肽（γ-glu、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met、γ-Glu-Val）在不同發(fā)酵時間（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）含量。結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的面團中γ-谷氨酰二肽的含量總體高于化學(xué)酸化的面團，延長發(fā)酵時間有利于γ-谷氨酰二肽的積累。在相同時間，不同菌株所產(chǎn)生的γ-谷氨酰二肽含量不同，說明菌株的特異性也決定了γ-谷氨酰肽的合成。

（2）毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

HIRAYAMA A等[41]應(yīng)用MRM模式，對比了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）和毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜（CE-MS/MS）方法檢測肝臟和血清樣品中γ-谷氨酰二肽和三肽含量。結(jié)果表明，CE-MS/MS更能控制基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的影響。除此之外，CE-MS/MS還具有分離度好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，回收率高等優(yōu)勢。

（3）電噴霧飛行時間質(zhì)譜

SHAO S等[52]利用待測肽分子中含有金屬元素的特點，將電噴霧飛行時間質(zhì)譜（electrospray time-of-flight mass spec trometry，ESI-TOF-MS）和電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）相結(jié)合對天然富硒綠豆蛋白酶解樣品中的硒進行鑒定和定量。通過檢測肽分子中金屬元素的含量間接得出待測肽分子的含量，最終γ-glutamyl-Se-methylselenocysteine的含量為1.2 mg/kg，使硒的總回收率達到72%。該方法具有檢出限低、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點。

4.3.4 核磁共振波譜法

核磁共振波譜法是將核磁共振現(xiàn)象應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)中，通過圖譜中提供的化學(xué)官能團的種類和數(shù)目進而確定化合物的化學(xué)組成。AMINO Y等[13]從分離的大蒜中鑒定了γ-L-glu-tamyl-S-（2-丙烯基）- l-半胱氨酸和γ-L-glu-yl-S-（2-丙烯基）-l-半胱氨酸亞砜的結(jié)構(gòu)，通過與其合成的α-和γ-同分異構(gòu)體的核磁共振波譜比較，對α-和γ-谷氨?；奶卣髌蔚蔫b定，證明質(zhì)譜分析是一種有效的檢測谷氨酰二肽連接方式的方法。

隨著科學(xué)的發(fā)展，γ-谷氨酰肽的分離、純化技術(shù)更趨向于高效、省時和多樣化的方向發(fā)展。根據(jù)不同的原料特性選擇不同的分離鑒定方法，應(yīng)就具體研究對象選取合適的方法，將各種方法聯(lián)合使用取長補短，最終才能夠達到理想的分離純化效果。

5 結(jié)語

γ-谷氨酰肽廣泛存在于植物、動物和發(fā)酵制品中。關(guān)于γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)特征、呈味機制、制備工藝、分離和鑒定方法的研究已有了較多的報道。但仍然有許多科學(xué)問題需要進一步探究：①γ-谷氨酰肽的分子呈味機制。厚味產(chǎn)生機制并不是簡單地通過厚味物質(zhì)激活CaSR而產(chǎn)生的，可通過研究γ-谷氨酰肽的三維構(gòu)象特征，從分子層面理解γ-谷氨酰肽的呈味機制和味感物質(zhì)的相互作用，更深入的理解γ-谷氨酰肽的構(gòu)效關(guān)系。②γ-谷氨酰肽在人體內(nèi)的代謝機制。γ-谷氨酰肽作為正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，通過激活CaSR促進功能釋放，CaSR受體在細胞外鈣穩(wěn)態(tài)中起中心作用，能夠在甲狀旁腺、腎臟和腸道在內(nèi)的許多組織中表達，參與人體的各種生物學(xué)功能。③γ-谷氨酰用于肥胖病人健康膳食產(chǎn)品的開發(fā)。γ-谷氨酰肽能夠增加食物的口感、延長回味，提升食物的豐富性和飽腹感，可以將其添加至低熱量食品中，用于肥胖病人健康膳食產(chǎn)品的開發(fā)，為生產(chǎn)健康食品提供指導(dǎo)。

國外對于γ-谷氨酰肽的研究已有幾十年，國內(nèi)的研究起步較晚，但仍有多個優(yōu)秀團隊致力于γ-谷氨酰肽的研究，關(guān)于γ-谷氨酰肽還有多個科學(xué)問題需要進一步探究，所以加快γ-谷氨酰肽研發(fā)是未來值得深入研究的課題，對于推動調(diào)味品行業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。