理氣通便合劑對便秘型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸、下丘腦組織5-HT、VIP 的影響

陳 芳 施琳琳 王 峻 詹程胹 劉 敏 陶麗媛 陳凍伢

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是臨床常見的功能性胃腸病[1]。研究顯示，IBS 發(fā)病機(jī)制包括內(nèi)臟高敏感、腸道動(dòng)力異常、精神心理因素、腸道感染和腸黏膜屏障功能異常等[2-3]。羅馬Ⅳ指南指出IBS 患者存在腸-腦互動(dòng)異常，腦腸肽在其中扮演了非常重要的角色[4]。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）作為重要的旁分泌信使和神經(jīng)遞質(zhì)，參與IBS 內(nèi)臟高敏感、腸道動(dòng)力異常等多種病理過程的發(fā)生。理氣通便合劑是浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院在長期臨床治療便秘型腸易激綜合征（constipationpredominant irritable bowel syndrome，IBS-C）實(shí)踐中總結(jié)出的有效方劑。本研究組觀察其對IBS-C 模型大鼠5-HT、VIP 的影響，探討理氣通便合劑治療IBS-C 的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SPF 級SD 大鼠24 只，雌雄各半，體質(zhì)量（140±20）g，購于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物合格證號：SYXK（浙）2018-0012，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫21℃、濕度70%、噪音＜50dB，每籠4 只，自由飲水、攝食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批通過（批準(zhǔn)編號：IACUC-20180326-12）。

1.2 藥 物 理氣通便合劑由生白術(shù)12g，黃芪30g，生首烏6g，炒枳實(shí)、檳榔、藿香各10g，炒萊菔子12g 組成，藥物由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)浸泡、2 次煎煮、過濾、濃縮至1g/mL，于4℃冰箱保存，用前加溫至37℃。枸櫞酸莫沙必利片5mg/片，日本制藥株式會社生產(chǎn)，將藥片碾碎后溶于生理鹽水，濃度為0.135%，4℃冰箱保存，用前加溫。

1.3 試劑與儀器 大鼠5-HT、VIP 的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，批號分別為HR3238483-1、HR3452158-1，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；酶標(biāo)分析儀：Rayto RT-6100。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥 24 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，以隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、IBS-C 模型組、理氣通便合劑組、莫沙必利組，每組6 只。采用冰水灌胃法[5]制備大鼠IBS-C 模型，用0～4℃冰水2mL/只每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃21 天；空白組予2mL/只常溫生理鹽水灌胃。通過觀察大鼠糞便Bristol 分型對模型進(jìn)行評價(jià)[4]；即1 型堅(jiān)果狀硬球，2 型硬結(jié)狀臘腸樣，3 型臘腸樣、表面有裂縫，4 型表面光滑、柔軟臘腸樣，5 型軟團(tuán)狀，6 型糊狀便，7 型水樣便。

根據(jù)人與動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量換算法計(jì)算藥物干預(yù)劑量[6]。灌胃第8 天起理氣通便合劑組予加用理氣通便合劑（18.75g·kg-1·d-1）灌胃，莫沙必利組予莫沙必利水溶液（1.35mg·kg-1·d-1）灌胃，空白組及IBS-C 模型組予等量生理鹽水灌胃。

2.2 標(biāo)本取材 藥物干預(yù)治療14 天后，禁食24h，不限水，以10%水合氯醛予腹腔注射麻醉后，開腹，迅速取出各組大鼠距肛門6cm 的結(jié)腸2.0cm，在冰盤上分離大鼠少量下丘腦組織，存放于1.5mL 凍存管內(nèi)，置于液氮，以備酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 大鼠一般情況觀察 食欲、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、大便性狀及體質(zhì)量情況等。

2.3.2 大鼠結(jié)腸HE 染色情況 將石蠟標(biāo)本連續(xù)切片（厚度約4μm），HE 染色后，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)與形態(tài)。

2.3.3 大鼠結(jié)腸、下丘腦5-HT、VIP 蛋白ELISA 檢測 用預(yù)冷的PBS 沖洗組織，將組織剪碎后勻漿，后將勻漿液離心，取上清液進(jìn)行ELISA 檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況 造模期間，無大鼠死亡。空白組大鼠精神狀態(tài)活躍，背毛光澤，Bristol 分型呈3型；IBS-C 模型組大鼠精神狀態(tài)不佳，背毛光澤度差，進(jìn)食量少，糞質(zhì)干硬，Bristol 分型呈1～2 型。14 天給藥治療結(jié)束后，理氣通便合劑組和莫沙必利組大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，背毛光澤，進(jìn)食量多，糞便Bristol分型呈3～4 型。

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理圖片（HE ×200）

3.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 HE 染色顯示，理氣通便合劑組與莫沙必利組大鼠結(jié)腸黏膜腺體排列整齊，黏膜可見少許充血水腫，無明顯黏膜糜爛及潰瘍，炎性細(xì)胞浸潤較少，鏡下表現(xiàn)與空白組較為接近；IBS-C 模型組大鼠結(jié)腸黏膜病理顯示黏膜腺體排列欠整齊，黏膜層可見有中性粒細(xì)胞浸潤，且肌層有斷裂現(xiàn)象，與空白組差異較大。見圖1。

3.3 各組大鼠結(jié)腸、下丘腦組織5-HT、VIP 蛋白表達(dá)量比較 與空白組比較，IBS-C 模型大鼠結(jié)腸、下丘腦組織5-HT、VIP 表達(dá)量增高（P 均＜0.05）；與IBS-C 模型組比較，莫沙必利組、理氣通便合劑組大鼠結(jié)腸、下丘腦組織5-HT 表達(dá)量降低（P 均＜0.05）；理氣通便合劑組大鼠結(jié)腸、下丘腦組織VIP 表達(dá)量低于IBS-C 模型組（P＜0.05），見表1-2。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT、VIP 表達(dá)水平比較（）

表1 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT、VIP 表達(dá)水平比較（）

注：空白組予2mL/只生理鹽水灌胃；IBS-C 模型組予冰水2mL/只灌胃；莫沙必利組在造?；A(chǔ)上予莫沙必利水溶液（1.35mg·kg-1·d-1）灌胃；理氣通便合劑組在造模基礎(chǔ)上予理氣通便合劑（18.75g·kg-1·d-1）灌胃；IBS-C 為便秘型腸易激綜合征；5-HT 為5-羥色胺；VIP 為血管活性腸肽；與空白組比較，aP＜0.05；與IBS-C 模型組比較，bP＜0.05

4 討論

IBS 是一種以排便習(xí)慣改變伴有腹痛為特征的功能性腸道疾病，根據(jù)排便習(xí)慣改變，可表現(xiàn)為便秘型（IBS-C）、腹瀉型（IBS-D），或便秘與腹瀉交替型（IBS-M）。近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）-腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）所構(gòu)成的腦-腸軸互動(dòng)異常在IBS 發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視。腦腸肽由胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌，在神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸均有分布，具有胃腸激素、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)等功能的小分子肽類物質(zhì)，可參與內(nèi)臟感覺、胃腸道運(yùn)動(dòng)和分泌等生理過程的調(diào)控。

表2 各組大鼠下丘腦組織5-HT、VIP 表達(dá)水平比較（）

表2 各組大鼠下丘腦組織5-HT、VIP 表達(dá)水平比較（）

注：空白組予2mL/只生理鹽水灌胃；IBS-C 模型組予冰水2mL/只灌胃；莫沙必利組在造模基礎(chǔ)上予莫沙必利水溶液（1.35mg·kg-1·d-1）灌胃；理氣通便合劑組在造?；A(chǔ)上予理氣通便合劑（18.75g·kg-1·d-1）灌胃；IBS-C 為便秘型腸易激綜合征；5-HT 為5-羥色胺；VIP 為血管活性腸肽；與空白組比較，aP＜0.05；與IBS-C 模型組比較，bP＜0.05

由于腦腸軸的存在，CNS、ENS 可以獨(dú)立或協(xié)同地對腸道運(yùn)動(dòng)、分泌、內(nèi)臟感覺傳導(dǎo)等功能進(jìn)行調(diào)控。其中，5-HT 占有非常重要的地位[7]。由于缺乏內(nèi)在或外在的神經(jīng)纖維到達(dá)黏膜上皮層，而ENS 對胃腸道的調(diào)控作用需要其感受到腸腔內(nèi)壓力和化學(xué)刺激因素，因此，神經(jīng)元感受腸腔內(nèi)刺激是一種經(jīng)過上皮黏膜傳導(dǎo)的機(jī)制[8-9]。腸嗜鉻細(xì)胞感受到腸腔內(nèi)容積或壓力刺激后釋放大量5-HT，隨之激活黏膜下層初級傳入神經(jīng)元，后者在黏膜下層或肌層的肌間神經(jīng)叢中與上行或下行中間神經(jīng)元形成突觸，通過釋放某些神經(jīng)遞質(zhì)，從而調(diào)節(jié)局部的興奮和抑制[8]。上行性中間神經(jīng)元釋放P 物質(zhì)、乙酰膽堿（Ach）等物質(zhì)作用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，引起環(huán)行肌興奮收縮；下行性中間神經(jīng)元釋放5-HT、VIP、NO、Ach 等神經(jīng)遞質(zhì)，引起環(huán)行肌松弛；由此形成了胃腸道由節(jié)律的收縮與松弛，形成蠕動(dòng)反射[10-11]。同時(shí)，CNS 參與的外源性信號通路也共同參與其中，除了調(diào)節(jié)腸蠕動(dòng)，在內(nèi)臟感覺傳導(dǎo)中也發(fā)揮了重要作用。但CNS 對ENS 的調(diào)控，目前仍缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CNS 及ENS 存在5-HT、VIP 等胃腸激素的同步變化，提示這些胃腸激素可能是發(fā)揮調(diào)控作用的效應(yīng)因子。

5-HT 受體存在多種受體亞型。研究表明，參與蠕動(dòng)反射的主要為5-HT4 受體[12]。目前已有多種藥物就是基于5-HT 信號系統(tǒng)而被設(shè)計(jì)出來調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)，分泌和感覺。包括替加色羅，一種5-HT4部分激動(dòng)劑，已被批準(zhǔn)用于治療女性IBS-C 模型組，以及慢性便秘。5-HT3 受體拮抗劑格拉司瓊和昂丹司瓊可用于對抗與癌癥化學(xué)療法相關(guān)的惡心，而阿洛司瓊用于治療IBS-D。本研究結(jié)果顯示，IBS-C 大鼠結(jié)腸及下丘腦組織5-HT、VIP 濃度均較空白組有所升高；理氣通便合劑干預(yù)后，無論結(jié)腸還是下丘腦5-HT、VIP 均有下降（P 均＜0.05）。我們推測5-HT、VIP 可能在CNS、ENS 水平對IBS-C 的運(yùn)動(dòng)及感覺功能進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)也是理氣通便合劑發(fā)揮作用的一個(gè)分子靶標(biāo)，但具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

IBS-C 屬中醫(yī)“便秘”范疇，其主要病機(jī)為大腸傳導(dǎo)失司，同時(shí)又與肝、脾、胃、大腸等臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)，尤其與肝的條達(dá)疏泄息息相關(guān)。因此在治療上以“理氣疏肝，潤腸通便”為治則。我院自行組方研制理氣通便合劑，方中以白術(shù)健脾益氣利水，黃芪補(bǔ)脾益氣，枳實(shí)破氣消積除痞，萊菔子行氣消食除脹，檳榔苦溫行氣，生首烏潤腸通便，藿香芳香化濕，諸藥合用起到理氣健脾、通達(dá)六腑的作用。目前該方在臨床上對功能性便秘及危重患者腹腔高壓等療效確切[13-14]。

綜上所述，理氣通便合劑能改善IBS-C 模型大鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食量和便秘癥狀；5-HT、VIP 可能在CNS、ENS 水平對IBS-C 的運(yùn)動(dòng)及感覺功能進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)也可能是理氣通便合劑發(fā)揮作用的分子靶標(biāo)。