不同種源多穗柯主要生物活性成分與礦質(zhì)元素含量變異分析

何 平，厲月橋，劉 儒，喻龍華，馮 慧，謝健楊

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實驗中心，江西 分宜 336600；2.新余學(xué)院 a.護理與康復(fù)學(xué)院；b.經(jīng)濟管理學(xué)院，江西 新余 338004）

多穗柯Lithocarpus polystachyus又名甜茶，為殼斗科石櫟屬植物，主要分布在我國長江以南亞熱帶丘陵山地區(qū)，江西、湖南、廣西和安徽等省區(qū)資源分布較為集中，廣東、云南、四川、福建等省次之[1]。民間常采集多穗柯的嫩葉食用，其茶甘甜清爽，香氣濃郁，色澤鮮艷，回味持久，風(fēng)味獨特，兼具茶、糖、藥三種功能[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，根皮苷、三葉苷和黃酮類等為多穗柯的主要功能成分[3]，具有抑菌消炎[4]、抗氧化[5]、降低血糖血脂[6]、抑制糖尿病[7]和抗癌防癌[8]等功能。隨著亞熱帶地區(qū)杉木、松類人工林的大面積栽培，多穗柯天然生境遭受嚴重破壞，開展多穗柯的種質(zhì)收集、評價工作，選育藥用成分含量高、生態(tài)適應(yīng)性強的優(yōu)良種質(zhì)進行人工栽培對多穗柯種質(zhì)的保護和利用十分重要。

目前，國內(nèi)外關(guān)于多穗柯研究主要集中在化學(xué)成分分析[9]、有效成分提取[10]、功能驗證[6,11]、葉綠體基因組測序與功能基因克隆[12-13]和人工定向栽培方面[12-14]。許多林木經(jīng)濟生態(tài)性狀與原產(chǎn)地氣候、生態(tài)因子密切相關(guān)，并在長期進化過程中形成特定的地理變異模式[15]，是開展遺傳改良和產(chǎn)地調(diào)撥的依據(jù)。多穗柯種質(zhì)評價是遺傳改良的基礎(chǔ)，曾祥艷等[16]對廣西4 個產(chǎn)地多穗柯葉片性狀變異及幼林生長量的研究表明，不同多穗柯優(yōu)樹在種子形態(tài)和子代生長方面變異較大。黃曉露等[17]研究表明不同產(chǎn)地多穗柯幼樹生長、葉片形態(tài)和光合生理性狀方面存在明顯差異。王坤等[18]對6 省30 個多穗柯種源苗木成熟葉片根皮苷和幼嫩葉片的三葉苷含量進行了測定，證實不同種源多穗柯根皮苷和三葉苷含量亦存在差異。

多穗柯葉片三葉苷、根皮苷、總黃酮和碳氮磷鉀等大量礦質(zhì)元素含量，是經(jīng)濟有效性和環(huán)境適宜性的重要性狀指標(biāo)。但現(xiàn)有研究還未能揭示多穗柯葉片三葉苷、根皮苷、總黃酮和主要礦質(zhì)元素的地理種源變異模式及其與原產(chǎn)地地理、氣候、生態(tài)因子和內(nèi)部性狀指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。

本研究在對我國多穗柯天然分布區(qū)進行種源收集的基礎(chǔ)上，開展了不同種源葉片根皮苷、三葉苷、總黃酮及全氮、全磷、全鉀和有機碳含量特征的地理變異規(guī)律研究，旨在為多穗柯經(jīng)濟生態(tài)型優(yōu)良種質(zhì)選擇和遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集與處理

多穗柯種源選擇與氣象信息收集見表1。在查閱多穗柯地理分布資料的基礎(chǔ)上，選擇江西、廣西、重慶、四川和湖南5 ?。▍^(qū)）5 個種源地作為多穗柯樣品收集地，采種源樣本基本覆蓋了多穗柯在中國的主要地理分布區(qū)，與溫度相關(guān)的氣象因子計算時，以當(dāng)?shù)貧庀笈_站數(shù)據(jù)為依據(jù)，海拔每上升100 m 氣溫降低0.55℃進行修正[19]。

多穗柯種源無性系測定林的建立。在選擇的采樣植株上，外圍中部采集當(dāng)年生枝條，在中國林科院亞熱帶林業(yè)實驗中心苗圃扦插擴繁，獲得了江西分宜、四川米易、廣西田林、重慶北碚和湖南溆浦5 個種源無性系，每種源無性系擴繁數(shù)量均在50株以上，將擴繁的無性系栽植在容積為直徑10 cm和高15 cm 的輕基質(zhì)育苗容器袋內(nèi)，容器基質(zhì)是體積比為3∶6∶1 的泥炭、鋸末樹皮混合物和黃心土混合物，然后進行多穗柯種源無性系測定試驗。

多穗柯無性系測定試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，以擴繁的種源無性系作為處理，每個處理選擇生長一致的多穗柯植株10 株，重復(fù)4 次，然后條件一致的育苗蔭棚內(nèi)進行培育。生長1 a 后，在不同種源各無性系植株上分別采集發(fā)育完好的葉片10 片左右，進行有效成分、表型和礦質(zhì)元素含量的測定。

1.2 樣品檢測與分析

1.2.1 總黃酮、根皮苷和三葉苷的測定

將多穗柯葉片樣品取回后用清水洗凈，放入110℃烘箱殺青30 min，然后45℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。將烘干后的多穗柯樣品分單株粉碎過100目篩，作為待測樣品。

總黃酮的測定采用三氯化鋁法[20]。稱取粉碎樣品0.2 g，3 mL 95% 乙醇，50 ℃水浴超聲30 min，收集至10 mL 容量瓶，重提3 次，合并上清液，冷卻至刻度，備用。取7 mL 上清液于25 mL 的比色管中，加入1.5% AlCl38 mL 和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH 值5.5）4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h，于415 nm下測試吸光度值。配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述樣品溶液的顯色方法同步顯色，于415 nm下測試吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，顯色液中蘆丁的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計算樣品的總黃酮含量。

采用高效液相色譜法測定根皮苷和三葉苷[21]。稱取0.1 g 左右樣品，加入50 mL 甲醇，超聲提取30 min（500 W，40 kHz），0.22 有機濾膜過濾，進樣。色譜柱為Waters C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣量20 μL。根皮苷和三葉苷標(biāo)準(zhǔn)品和多穗柯樣品根皮苷和三葉苷的HPLC 色譜見圖1～2。

1.2.2 有機碳、全氮、全磷和全鉀含量的測定

多穗柯樣品有機碳采用重鉻酸鉀容量法（硫酸亞鐵滴定法），即用K2Cr2O7-H2SO4進行待測樣外加熱，再用FeSO4進行滴定；將多穗柯樣品用濃H2SO4混合試劑消煮法制備待測液，再用靛酚藍比色法測定其全氮，用鉬銻抗比色法測定其全磷；利用原子吸收分光光度計（Zeenit700，德國Analytik Jena AG）測定其K 濃度[22]。每個樣品測定重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

表1 多穗柯種源地理位置及主要氣象因子?Table 1 Geographical locations and meteorological factors of the sampled provenances of Lithocarpus polystachyus

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 軟件進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的整理、統(tǒng)計，利用SPSS 17.0軟件進行種源間的方差分析、多重比較、相關(guān)分析和聚類分析。

圖1 根皮苷和三葉苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜Fig.1 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin standard

圖2 多穗柯樣品根皮苷和三葉苷的HPLC 色譜Fig.2 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin in Lithocarpus polystachyus sample

2 結(jié)果與分析

2.1 多穗柯葉主要藥用活性成分與礦質(zhì)元素含量的差異

不同種源多穗柯葉表型與主要藥用成分含量間差異見表2。從表2可以看出，在葉部藥用活性成分含量方面，多穗柯葉部根皮苷的變異范圍為16.03～64.35 mg·g-1，重慶北碚種源根皮苷含量最高，達64.35 mg·g-1，是根皮苷含量最低的四川米易種源的4.01 倍。三葉苷含量的變異范圍為4.76～29.97 mg·g-1，含量最高的四川米易種源與最低的重慶北碚種源間相差了6.29 倍。不同種源總黃酮含量的變異幅度為61.59～81.05 mg·g-1，其中江西分宜種源含量最高，四川米易種源含量最低。

表2 不同種源多穗柯主要藥用活性成分與礦質(zhì)元素含量的種源差異?Table 2 Provenance difference of main medicinal active constituents and mineral element contents of Lithocarpuspolystachyus from different provenances (mg·g-1)

在多穗柯葉主要礦質(zhì)元素含量方面，有機碳含量的變異范圍為45.82～44.12 mg·g-1，氮元素含量的變異范圍為13.64～17.05 mg·g-1，磷元素含量的變異范圍為1.25～3.37 mg·g-1，鉀元素含量的變異范圍為6.70～7.31 mg·g-1。不同種源各礦質(zhì)元素間分別相差了1.04、1.25、2.69 和1.09 倍。方差分析表明，除鉀元素含量外，不同種源多穗柯葉根皮苷、三葉苷、總黃酮、有機碳、氮、磷元素含量方面均存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.2 多穗柯葉表型與主要活性成分含量與氣候生態(tài)因子相關(guān)性分析

從表3可以看出，根皮苷與日照時數(shù)呈顯著負相關(guān)關(guān)系，三葉苷與無霜期呈顯著正相關(guān)關(guān)系，總黃酮含量與年均降水量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可達0.999。多穗柯其它活性成分、有機碳、全氮、全磷和全鉀含量與氣候生態(tài)因子間無顯著相關(guān)性。說明，隨著原產(chǎn)地日照時數(shù)的增加，多穗柯根皮苷呈顯著降低的趨勢；隨著無霜期的增加，三葉苷含量呈逐漸增加的趨勢；隨著經(jīng)度和年均降水量的增加，多穗柯總黃酮含量分別呈極顯著或顯著增加的趨勢。

表3 多穗柯葉主要藥物活性成分、礦質(zhì)元素與產(chǎn)地氣候生態(tài)因子相關(guān)性分析?Table 3 Correlation analysis of main medicinal active constituent,mineral elements and climatic and ecological factors of Lithocarpus polystachyus leaves

2.3 多穗柯葉主要藥物活性成分與礦質(zhì)元素含量的相關(guān)分析

從表4可以看出，多穗柯葉部根皮苷與全氮呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；有機碳與全鉀含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。隨著鉀元素的增加，有機碳含量呈顯著降低的趨勢，多穗柯葉片其它性狀間相關(guān)性未達到顯著差異水平（P≥0.05）。說明，隨著全氮含量的增加，根皮苷呈極顯著增加的趨勢。

表4 多穗柯葉表型與主要活性成分的相關(guān)性分析Table 4 Analysis of correlation between leaf phenotype and main medicinal active constituent of Lithocarpus polystachyus

2.4 不同種源多穗柯藥用成分含量聚類分析

以多穗柯葉部根皮苷、三葉苷、總黃酮含量為特征指標(biāo)，對5 個多穗柯種源進行聚類分析，結(jié)果（圖3）表明，以歐式距離15 為分界閾值，可將多穗柯種源聚類為高根皮苷、高總黃酮、低三葉苷類群，低根皮苷、低總黃酮和高三葉苷類群，其中重慶北碚、江西分宜和湖南溆浦屬高根皮苷、總黃酮和低三葉苷類群，而廣西田林、四川米易為低根皮苷、低黃銅和高三葉苷類群。從地理位置分布來看，前者主要分布在多穗柯分布區(qū)的中部，而后者主要分布在其分布區(qū)的西南部。

圖3 不同種源多穗柯葉根皮苷、三葉苷和總黃酮含量聚類分析Fig.3 Cluster analysis of phloridzin and trilobatin and flavonoids contents in Lithocarpus polystachyus-leaf of different provenances

3 結(jié)論與討論

1）本研究報道了我國優(yōu)良藥食兼用樹種多穗柯葉部主要生物活性成分和礦質(zhì)元素特征的種源變異研究結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，來自5 省區(qū)5 個產(chǎn)地多穗柯秋季成齡葉部根皮苷、三葉苷、總黃酮、全氮、全磷和有機碳含量差異極顯著。其中重慶北碚、江西分宜和湖南溆浦種源屬高根皮苷、總黃酮和低三葉苷類群，分布在廣西田林和四川米易種源屬低根皮苷、低黃酮和高三葉苷類群。各種源中，重慶北碚根皮苷含量最高，為64.35 mg·g-1；四川米易三葉苷含量最高，達29.97 mg·g-1；江西分宜總黃酮含量最高，達81.05 mg·g-1，屬多穗柯優(yōu)良種源。今后應(yīng)當(dāng)加強優(yōu)良種源在生產(chǎn)中的利用。

2）王坤等[18]證實了不同種源多穗柯老葉根皮苷含量、嫩葉三葉苷含量種源間存在差異，但未開展主要經(jīng)濟性狀種源變異與原產(chǎn)地地理氣候因子間關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，多穗柯葉部主要生物活性成分和礦質(zhì)元素含量間及其與原產(chǎn)地氣候生態(tài)因子間具有一定相關(guān)性。其葉部根皮苷含量與原產(chǎn)地日照時數(shù)呈顯著負相關(guān)，三葉苷含量與無霜期呈顯著正相關(guān)關(guān)系，總黃酮與降水量和經(jīng)度分別呈顯著和極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，今后在多穗柯分布區(qū)內(nèi)短日照地區(qū)開展高根皮苷優(yōu)良種質(zhì)選擇，在其東部或高降水量地區(qū)開展高黃酮優(yōu)良種質(zhì)篩選，在無霜期較長的地區(qū)開展高三葉苷含量優(yōu)良種質(zhì)選擇，有望取得較好的效果。

3）在進行多穗柯種質(zhì)資源評價時，總黃酮指標(biāo)含量的測定需利用液相色譜設(shè)備檢測分析，測定費時費力，而葉片氮含量相對容易檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，多穗柯根皮苷與氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，在今后多穗柯種質(zhì)評價時，可以用葉全氮含量進行三葉苷含量的初步評價，有利于提高種質(zhì)資源評價效率和降低成本。

4）市場上，多穗柯成齡葉和春季嫩葉具有不同加工利用方向。多穗柯嫩葉主要用于制作茶葉，而成熟葉主要用于根皮苷、三葉苷等生物活性成分和甜味劑的提取。已有研究表明，多穗柯成熟葉中根皮苷含量高于嫩葉，但三葉苷含量低于嫩葉[24]。本研究開展了多穗柯秋季成熟葉中根皮苷、三葉苷和總黃酮含量的檢測和地理變異規(guī)律研究，尚未對春季嫩葉中相關(guān)成分含量進行分析。因此，春季嫩葉中根皮苷、三葉苷等特征指標(biāo)的種源變異規(guī)律有待進一步開展研究，以便為多穗柯茶用型優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

5）林木的遺傳變異是來源于群體間和群體內(nèi)多層次上的，揭示遺傳變異的來源能夠為樹種的良種選育提供科學(xué)的指導(dǎo)。林木種源與地點往往存在明顯的交互作用，往往需進行多點聯(lián)合種源試驗，才能揭示在不同地區(qū)的生長表現(xiàn)[25]。本研究僅在江西分宜進行多穗柯種源試驗研究，明確了其主要生物活性成分和礦質(zhì)元素的種源間差異，但尚未對種源內(nèi)部群體間差異情況開展分析。同時，也因未開展全分布區(qū)種源試驗，尚不能明確各種源在全分布區(qū)的表現(xiàn)。因此，開展多穗柯全分布區(qū)種源試驗和開展群體內(nèi)變異研究，以系統(tǒng)揭示多穗柯重要經(jīng)濟性狀的種源變異規(guī)律，為多穗柯優(yōu)良種源的篩選和推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。