減壓耦合超聲法提取桑葉脫氧野尻霉素及降血糖活性研究

劉 榮，李曉東，畢文玥

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

我國有著豐富的桑Morus albaL.資源，憑借4 000 多年的桑樹栽培史和近百萬公頃的桑園，成為了世界上最大的桑樹種植國[1]。桑葉，又名鐵扇子，品種繁多，包括蒙桑、雞桑、川桑、華桑等10 多個品種[2]。據(jù)報道目前桑葉被許多國家的人們用來制作成菜肴、飲品等[3]。桑葉是一種重要的林下食品資源，營養(yǎng)十分豐富，具有多種生物活性[4]?，F(xiàn)如今，很多企業(yè)因其營養(yǎng)價值，將其開發(fā)成桑葉飲料、桑葉泡菜、桑葉咀嚼片等產(chǎn)品，在帶給人們健康的同時，減少了桑資源的浪費。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑葉中含有的一種多羥基生物堿—脫氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）[5]，結(jié)構(gòu)與葡萄糖類似，它以自身NH 基團(tuán)取代了吡喃糖環(huán)上的氧原子[6]，可通過抑制α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶等達(dá)到降血糖效果，是降血糖的主要活性成分[7]。Hansawasdi 等[8]通過研究桑葉水提取液對α-葡萄糖苷酶抑制作用，測定Caco-2 細(xì)胞單層頂端和基底側(cè)細(xì)胞外釋放的葡萄糖濃度，表明其具有良好的降血糖功能。

桑葉作為我國林下資源的重要組成部分，早在20世紀(jì)80年代我國學(xué)者就對桑葉進(jìn)行了研究，內(nèi)容集中在種植培育、生長環(huán)境和營養(yǎng)成分分析等方面[9]，對桑葉DNJ 提取新技術(shù)層面的研究甚少。目前，DNJ 提取常用方法主要包括：微波提取法[10]、超聲提取法[11]、水提法[12]、酶提取法[13]等。胡瑞君等[10]利用微波萃取技術(shù)提取桑葉DNJ，最終測得DNJ 提取率僅為0.024%；花俊麗等[11]采用超聲波輔助醇法提取桑葉DNJ，并對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終測得DNJ 得率為0.091%；Vichasilp 等[12]為使桑葉茶中DNJ 最大限度的發(fā)揮作用，采用響應(yīng)面優(yōu)化熱水浸提法提取桑葉DNJ，最終得到DNJ 含量為0.3%；趙翔[13]對比了傳統(tǒng)酸提法與纖維素酶法對桑葉DNJ 提取率的影響，發(fā)現(xiàn)纖維素酶法對DNJ 提取效果更好，又在纖維素酶法的基礎(chǔ)上采用超聲輔助技術(shù)對DNJ進(jìn)行提取，最終得到DNJ 提取率為0.106 6%。在上述方法中，超聲波法在DNJ 提取方面應(yīng)用較為廣泛。超聲波法可將自身的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)3者結(jié)合起來，促使細(xì)胞內(nèi)容物快速溶出[14]，且在提取過程中無明顯的加熱現(xiàn)象，有利于活性物質(zhì)的保留[15]。而減壓法是通過真空泵抽取提取容器中的空氣，使容器內(nèi)壓力減小，提取液沸點降低，從而縮短提取時間[16]。據(jù)文獻(xiàn)報道，有學(xué)者將兩種方法聯(lián)合用來提取薇菜黃酮[16]、杏鮑菇多糖[17]等物質(zhì)，提取效果較好。減壓耦合超聲法正在向各個領(lǐng)域蔓延，但其在提取桑葉DNJ 方面的研究尚無報道。本研究采用減壓耦合超聲法對桑葉中的DNJ 進(jìn)行提取，在單因素的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對其降血糖活性進(jìn)行了研究，以期為建立桑葉DNJ 提取新技術(shù)及其營養(yǎng)價值的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桑葉，品種為云桑2 號，購于四川省涼山州德昌縣。

1.2 試劑與儀器

試劑：DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品（Deoxynojirimycin，純度≥98%），購于美國Sigma 公司；氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOCCl，純度≥99%，色譜純），購于美國Sigma 公司；甘氨酸（純度≥99%）、乙腈、醋酸（均為色譜純）、α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，pNPG）、蔗糖酶、蔗糖、阿卡波糖，購于上海源葉生物有限公司；其他試劑均為分析純。

儀器：分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，BioTek Instruments,Inc.美國；SHB-IIIG減壓耦合超聲設(shè)備為實驗室自制；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；美國Waters1525高效液相色譜儀（Waters2487 雙通道紫外可見檢測器，Waters1525 二元泵，717 自動進(jìn)樣器）；KQ-300DE 超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 原料預(yù)處理

將新鮮的桑葉清洗干凈，放置于40℃左右的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)粉碎過40 目篩，置于-20℃冰箱中冷凍備用。

1.3.2 減壓耦合超聲波設(shè)備的設(shè)計

取一定量凍藏的桑葉粉末，將其倒入圓底燒瓶中，加入一定比例65%的乙醇溶液，按圖1所示，連接裝置，并使圓底燒瓶內(nèi)液體液面浸沒在超聲儀中水液面以下，打開真空泵，此時提取容器內(nèi)氣壓迅速下降，再啟動超聲設(shè)備，在一定超聲條件下進(jìn)行提取，收集提取液。

圖1 減壓耦合超聲裝置Fig.1 Decompression coupled ultrasound device

1.3.3 DNJ 衍生化與HPLC 分析

參照Kim 等[18]的方法，稍作修改。用移液槍吸取DNJ 提取液或DNJ 標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 于離心管中，加入0.4 mol/L 硼酸鉀緩沖液100 μL（pH值為8.5），震蕩搖勻，加入5 mmol/L 的FMOCCl 溶液150 μL，25℃水浴20 min 后，加入1 mol/L甘氨酸溶液50 μL 終止反應(yīng)，加入0.1%的醋酸溶液100 μL 使衍生物（FMOC-DNJ）穩(wěn)定，400 μL超純水稀釋，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，即得待測液。

DNJ 的HPLC 色譜條件為：色譜柱：HiQSiLC18 分析柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測波長為254 nm；流動相：乙腈-0.5%醋酸（體積比為65:35）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：3 μL，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次。

1.3.4 DNJ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取5 mg DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，加入少量65%乙醇溶解，移入10 mL 容量瓶中定容，將其配制成（5、10、20、40、80 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3 方法衍生化后，對其含量檢測。以DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

求得DNJ 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=911.32x-123，R2=0.999 4。式中：y為峰面積；x為DNJ 質(zhì)量濃度，μg/mL。相關(guān)系數(shù)為R2為0.999 4，得出DNJ 濃度在5～80 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.3.5 FMOC-DNJ 穩(wěn)定性及HPLC 方法學(xué)考察試驗

參照文獻(xiàn)[13]，對FMOC-DNJ 的穩(wěn)定性，HPLC 檢測方法精密度、重復(fù)性及加樣回收率進(jìn)行測定。

1.3.6 單因素試驗

準(zhǔn)確稱取干燥桑葉粉5.00 g，在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選出最佳單因素范圍，分別為料液比(1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL))；超聲溫度(45、55、65、75、85℃)；超聲時間(20、30、40、50、60 min)；超聲功率(320、400、480、560、640 W)；乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%、55%、65%、75%、85%)；真空度(0.00～0.02、0.02～0.04、0.04～0.06、0.06～0.08、0.08～0.10 MPa)。研究6 種因素不同水平對DNJ 得率的影響，為減小誤差每組試驗做3 組平行試驗。

1.3.7 DNJ 的制備與得率的計算

將5 g 處理好的桑葉粉末置于圓底燒瓶中，按照一定料液比加入65%乙醇溶液，經(jīng)減壓耦合超聲波法制備后，抽濾兩次，保留濾液，4 000 r/min離心15 min，取一定量上清液按1.3.3 方法進(jìn)行衍生化后進(jìn)行測定，代入回歸方程，按公式計算：

式（1）中：Yi為得率（mg·g-1）；c為DNJ 質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；n為稀釋倍數(shù)；v為提取液體積（mL）；m為桑葉粉總質(zhì)量（g）。

1.3.8 減壓耦合超聲波法提取DNJ 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman (PB)試驗篩選出對DNJ 得率影響最顯著的3 個因素（P＜0.05），分別為超聲功率、超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。其它非顯著因素的試驗條件按照單因素試驗的最優(yōu)條件進(jìn)行，以超聲功率(A)、超聲時間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)為自變量，DNJ 得率（Y）為響應(yīng)值，運用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 8.0.5 建立的Box-Benhnken Design(BBD)，設(shè)計3 因素3 水平響應(yīng)面試驗。試驗設(shè)計的因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素和水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.3.9 DNJ 體外降血糖活性

1.3.9.1 α-葡萄糖苷酶抑制率試驗

參照Kim 等[18]的方法，稍作修改。精密量取0.5 mg/mL 桑葉DNJ 提取液50 μL 于96 孔板中，加入3 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，用移液槍頭吹打混勻，37℃條件下水浴15 min，加入10 mg/mL的pNPG溶液50 μL，37℃水浴10 min后，加入1 mol/L 的Na2CO3溶液80 μL 終止反應(yīng)，震蕩使之混合均勻。以阿卡波糖為陽性對照，用酶標(biāo)儀在405 nm 波長處測定吸光值。本試驗共設(shè)置6 組分別為：A0，酶液+底物；A1，樣品+底物；A2，酶液+樣品+底物；A3，樣品。每組做3 次平行試驗，按公式（2）計算抑制率。

式（2）中：RI為抑制率；A0為空白組吸光度；A1為樣品背景組吸光度；A2為樣品組吸光度；A3為樣品對照組吸光度。

1.3.9.2 蔗糖酶抑制率的測定方法

參照Kim 等[19]的方法，稍作修改。精密量取0.5 mg/mL 桑葉DNJ 提取液50 μL 于96 孔板中，加入蔗糖酶溶液50 μL，37℃下水浴10 min，加入1 mol/L 蔗糖溶液50 μL，37℃水浴30 min 后，加入0.05 mol/L 的Tris-HCl (pH 值為8.8)緩沖液100 μL 終止反應(yīng)，震蕩使二者混合均勻，以阿卡波糖為陽性對照，用酶標(biāo)儀在540 nm 波長處測定吸光值。本試驗共設(shè)置5 組分別為：A0，酶液+底物；A1，樣品+底物；A2，酶液+樣品+底物；A3，樣品。每組做3 次平行試驗，按照公式（2）計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMOC-DNJ 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一樣品溶液100 μL，按1.3.3 方法進(jìn)行衍生化處理，使DNJ 與FMOC-Cl 反應(yīng)生成衍生物FMOC-DNJ，將衍生化后的DNJ 提取液置于4℃冰箱中，設(shè)置3 個平行樣，分別放置0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h 后，依次檢測DNJ含量。如表2所示，F(xiàn)MOC-DNJ衍生物在4℃條件下放置5 h，含量改變較小，而到了6 h 含量開始大幅度下降，說明DNJ 衍生化后的產(chǎn)物在5 h內(nèi)十分穩(wěn)定，故在試驗過程中數(shù)據(jù)應(yīng)盡量在5 h 之內(nèi)測定。

表2 穩(wěn)定性試驗Table 2 Stability test

2.2 精密度試驗

精密吸取同一樣品溶液100 μL，按1.3.3 方法進(jìn)行衍生化處理后，重復(fù)6 次進(jìn)樣，分別測定DNJ 含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD 值）。如表3所示，通過計算得RSD 值為0.480 0%（n=6），表明該檢測方法精密度良好。

表3 精密度試驗Table 3 Precision test

2.3 重復(fù)性試驗

取同一桑葉樣品平行制備6 份，分別精密吸取100 μL，衍生化處理后，分別測定6 份提取液中DNJ 含量，計算RSD 值。如表4所示，6 份平行樣品的含量平均值為0.645 1 mg/g，RSD 值為1.370 0%（n=6），表明該檢測方法具有良好重復(fù)性。

表4 重復(fù)性試驗Table 4 Repeatability test

2.4 加樣回收率試驗

取同一桑葉粉末6 份，各1 g，按1.3.7 方法進(jìn)行制備，分別測定DNJ 含量，再向6 份桑葉提取液中加入0.502 3 mg/mL DNJ 標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，混勻后按1.3.3 方法進(jìn)行衍生化處理并測定DNJ 含量，計算回收率及RSD 值。如表5所示，6 份樣品的DNJ 平均回收率為94.7%，RSD 值為1.460 0%（n=6）。

表5 加樣回收率試驗Table 5 Sample recovery rate test

2.5 單因素試驗結(jié)果

2.5.1 料液比對DNJ 得率的影響

從圖2可以看出，在提取過程中，當(dāng)料液比在1∶10～1∶40（g:mL）范圍內(nèi)，隨著提取溶劑量的增加DNJ 得率呈明顯增大趨勢，且曲線較陡，DNJ 得率最高為0.73 mg·g-1；而當(dāng)料液比在1∶40～1∶50（g:mL）范圍內(nèi)時，DNJ 得率有下降趨勢。在桑葉組織中，DNJ 以氫鍵的形式與蛋白質(zhì)，多糖和其他物質(zhì)結(jié)合，而有機(jī)溶劑和水的混合物可以有效地抑制這種結(jié)合，并且料液比增加，體系傳質(zhì)動力增加，DNJ 更易溶出[20]；固相和液相之間不僅存在擴(kuò)散—溶解平衡，還存在吸附平衡。低溫有利于吸附，由于溶劑量的增加，提取液的溫度在產(chǎn)生相同熱量的條件下降低，致使吸附作用增強(qiáng)[21]，DNJ 得率下降，因此選擇最佳料液比為1:40（g:mL）。

圖2 料液比對DNJ 得率的影響Fig.2 Effect of feed-to-liquid ratio on DNJ yield

2.5.2 超聲溫度對DNJ 得率的影響

從圖3可以看出，當(dāng)超聲溫度在45～65℃范圍內(nèi)時，DNJ 得率隨超聲溫度的升高而顯著增加，當(dāng)超聲溫度達(dá)到65℃時，DNJ 得率最高達(dá)到0.87 mg·g-1，這是由于乙醇沸點低，并且易于在低壓條件下達(dá)到沸騰狀態(tài)，能迅速減小溶液的濃度差。同時，由于沸騰是通過液體內(nèi)部溶液的汽化形成的，即由于存在從浸潤的植物細(xì)胞內(nèi)的溶液液體分子的汽化產(chǎn)生微小汽泡并迅速長大和膨脹的作用，加快有效成分向溶液中的擴(kuò)散速度[22]。在65～85℃范圍內(nèi)，DNJ 得率隨超聲溫度的升高而降低，這是由于溫度過高破壞DNJ 的活性[23]，從而使DNJ 得率下降。Mantegna 等[24]認(rèn)為過高的溫度會引起表面張力的降低和空化泡內(nèi)蒸汽壓力的增加，造成超聲波的阻尼。因此選擇最佳超聲溫度為65℃。

圖3 超聲溫度對DNJ 得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on DNJ yield

2.5.3 超聲時間對DNJ 得率的影響

從圖4中可以看出，當(dāng)超聲時間在20～30 min范圍內(nèi)，DNJ 得率呈顯著上升趨勢，這是由于環(huán)境處于負(fù)壓狀態(tài)，可促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)DNJ 短時間內(nèi)最大效率溶出[25]；當(dāng)超聲時間為30 min 時，DNJ提取率最大為0.93 mg·g-1。當(dāng)超聲時間在30～60 min 時，DNJ 得率呈顯著下降趨勢，此現(xiàn)象說明，超聲時間過長會破壞DNJ 的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[26]，影響最終測定結(jié)果。因此選擇最佳超聲時間為30 min。

圖4 超聲時間對DNJ 得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound time on DNJ yield

2.5.4 超聲功率對DNJ 得率的影響

觀察圖5可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲功率在320～480 W范圍內(nèi)，DNJ 得率呈顯著上升趨勢，當(dāng)其達(dá)到480 W時，DNJ 得率最大為1.01 mg·g-1，這說明隨著超聲功率的增強(qiáng)桑葉細(xì)胞破碎程度也更劇烈，易形成空化泡，且空化泡的崩解也更加劇烈[27]，DNJ得率隨之增大；當(dāng)超聲功率480～640 W 范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大DNJ 得率呈下降趨勢，這是由于超聲功率持續(xù)增大，體系內(nèi)部產(chǎn)生的空化泡過大，導(dǎo)致空化泡崩解困難，故空化作用降低[28]，DNJ 得率出現(xiàn)遞減趨勢。Boudries 等[29]認(rèn)為超過一定能量后反而會破壞提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，同時會使空化趨于飽和，產(chǎn)生大量無用的氣泡，這會增加散射衰減并降低空化強(qiáng)度，從而導(dǎo)致提取速率迅速降低。因此選擇最佳超聲功率為480 W。

圖5 超聲功率對DNJ 得率的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on DNJ yield

2.5.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對DNJ 得率的影響

分析圖6可以發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在45%～65%范圍內(nèi)，DNJ 得率顯著增大，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%時，DNJ 得率最大可達(dá)0.69 mg·g-1；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在65%～85%范圍內(nèi)，DNJ 得率呈下降趨勢，此現(xiàn)象說明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，其它更易與乙醇結(jié)合的物質(zhì)大量溶出，與DNJ 形成競爭關(guān)系，故此時的DNJ 得率有下降趨勢[30]。因此選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對DNJ 得率的影響Fig.6 Effects of ethanol volume fraction on DNJ yield

2.5.6 真空度對DNJ 得率的影響

從圖7中可以看出，當(dāng)真空度在0.00～0.02 MPa時，由于此時提取容器內(nèi)的氣壓接近常壓，因此DNJ 得率較低為0.61 mg·g-1，但隨著真空度的增加，DNJ 得率顯著增大，當(dāng)真空度在0.08～0.10 MPa 范圍內(nèi)，DNJ 得率達(dá)到最大1.23 mg·g-1，此現(xiàn)象說明：低壓時提取容器內(nèi)空氣稀薄，提取溶劑內(nèi)的提取物受到的外力減小，分子鏈變大，需要打破分子鏈的能量降低[31]，因此，DNJ 更易溶出。因此選擇最佳真空度為0.08～0.10 MPa。

圖7 真空度對DNJ 得率的影響Fig.7 Effects of vacuum on DNJ yield

2.5.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

為了進(jìn)一步確定減壓耦合超聲法提取桑葉DNJ 的最佳工藝條件，選擇了超聲功率，超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)3 個因素，并通過響應(yīng)面法對DNJ 的得率進(jìn)行了分析。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，方差分析見表7。

利用Design-Expert 8.0.5對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。試驗結(jié)果見表6，將試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合得到DNJ 得率Yi與超聲功率(A)、超聲時間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)的二次多項式回歸方程為：由表7可知，該模型因變量與自變量之間線性關(guān)系良好，并且該模型R2=97.94%，R2adj=95.29 %，整體模型F=36.93，P＜0.000 1，表明該模型極顯著，即該試驗方法是可靠的。由表7還可以看出，失擬項F=4.81，P=0.081 6，失擬項不顯著，表示該模型選擇正確，其中調(diào)整系數(shù)為R2adj=95.29%，表明95.29%的響應(yīng)面值變化可以通過模型表達(dá)，相關(guān)系數(shù)R2=97.94%，說明該模型與試驗擬合度良好。根據(jù)F值可知，各因素對DNJ 得率的影響順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞超聲時間（B）＞超聲功率（A）。根據(jù)回歸方程獲得響應(yīng)面圖和等高線圖。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Response surface test design and results

分析圖8～10 可以得出超聲功率（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）對DNJ 得率的影響。如圖8所示，超聲功率（A）與超聲時間（B）之間的相互作用具有曲面陡峭和曲率較大的特點，因此二者的交互作用極顯著；從圖9可以看出，超聲功率（A）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）之間的相互作用曲面較平緩，等高線圖呈圓形，故交互作用不顯著；從圖10可以看出，超聲時間（B）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）交互作用曲面趨于平滑，故交互作用顯著。當(dāng)?shù)雀呔€呈現(xiàn)密集的橢圓形或馬鞍形時說明兩者交互作用顯著；當(dāng)呈現(xiàn)圓形時表明交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果相符[32]。

2.6 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

采用減壓耦合超聲提取桑葉DNJ 的最佳工藝條件為：料液比1:40（g:mL）、超聲溫度65℃、超聲時間24.25 min、超聲功率464.10%、乙醇體積分?jǐn)?shù)69.05%、真空度0.08～0.10 MPa，此條件下DNJ 得率為（1.07±0.03）mg·g-1。為 增強(qiáng)實際生產(chǎn)中的可控制性，調(diào)整工藝為：料液比1∶40（g:mL）、超聲溫度65℃、超聲時間24 min、超聲功率480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)69%、真空度0.08～0.10 MPa，在此條件下DNJ 得率為（1.10±0.02）mg·g-1，與理論值接近。同時，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有良好的可行性。

2.7 與單一超聲波法提取效果比較

在料液比1∶40（g:mL）、超聲溫度65℃、超聲時間24 min、超聲功率480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)69%條件下，比較單一超聲波法與減壓耦合超聲法（真空度0.08～0.1 MPa）對桑葉DNJ 的提取效果，結(jié)果表明：單一超聲提取法的DNJ 得率為（0.67±0.04）mg·g-1。而減壓耦合超聲波法的DNJ 得率為（1.10±0.02）mg·g-1，較單一超聲波法提高了64.18%（P＜0.01），說明減壓耦合超聲波法提取效果優(yōu)于單一超聲法，在桑葉DNJ 提取方面具有一定的應(yīng)用前景。

表7 方差分析?Table 7 Variance analysis

圖8 超聲功率與超聲時間交互作用與等高線Fig.8 Ultrasonic time and ultrasonic power interaction and contour line

圖9 超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用與等高線Fig.9 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic power and contour

2.8 DNJ 得率與體外降血糖活性相關(guān)性分析

為了考察DNJ 得率與降血糖活性的相關(guān)性，分別對響應(yīng)面17 組試驗進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制率和蔗糖酶抑制率試驗，結(jié)果見表8。

圖10 超聲時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用與等高線Fig.10 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic time and contour line

表8 不同DNJ 得率下的酶綜合抑制率?Table 8 Comprehensive inhibition rate of enzymes under different DNJ yields

使用IBM SPSS 軟件對DNJ 得率與酶綜合抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，DNJ 得率與酶綜合抑制率的相關(guān)系數(shù)r=0.719（P＜0.05），表明兩者之間呈顯著正相關(guān)。

2.9 DNJ、阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶抑制率IC50 的測定

圖11 不同質(zhì)量濃度DNJ、阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.11 Effects of different concentrations of DNJ and acarbose on the inhibition rate of α-glucosidase

圖12 不同質(zhì)量濃度DNJ、阿卡波糖對蔗糖酶抑制率的影響Fig.12 Effects of different concentrations of DNJ and acarbose on the inhibition rate of invertase

由圖11～12 可知，在一定濃度范圍內(nèi)，DNJ 和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶抑制率走勢基本相同，均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。其中DNJ、阿卡波糖對蔗糖酶抑制率整體趨勢低于其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。通過IBM SPSS計算得DNJ、阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用 的IC50分別為0.770、0.505 mg·mL-1；DNJ、阿卡波糖對蔗糖酶抑制作用的IC50分別為1.772、0.609 mg·mL-1，結(jié)果表明，阿卡波糖降血糖效果略高于DNJ，這與一些已有研究報道的結(jié)果有一定的差異，這可能是由于DNJ 提取方法、品種產(chǎn)地等諸多因素的不同導(dǎo)致的。

3 結(jié)論與討論

α-葡萄糖苷酶和蔗糖酶是評估降血糖活性的常見指標(biāo)，酶的抑制率越高，降血糖活性越強(qiáng)。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以DNJ 得率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗確定最佳工藝條件為：料液比1∶40（g:mL）、超聲溫度65℃、超聲時間24 min、超聲功率480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)69%、真空度0.08～0.10 MPa，此條件下DNJ 得率為（1.10±0.02）mg·g-1。參照Kim 等[18]的方法使用HPLC法測定DNJ 含量，在其基礎(chǔ)上對衍生化產(chǎn)物FMOC-DNJ 進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗，得出FMOC-DNJ在4℃的環(huán)境中放置5 h，穩(wěn)定性較好，在放置6 h 后其含量發(fā)生大幅度下降。并對HPLC 法測定DNJ 含量進(jìn)行了方法學(xué)考察，得出將密度、重復(fù)性、加樣回收率試驗的RSD 值分別為0.48%、1.37%、1.46%，表明該方法精準(zhǔn)可靠，可以應(yīng)用于桑葉DNJ 的檢測?？疾霥NJ 得率與降血糖活性之間相關(guān)性，結(jié)果表明，DNJ 得率與降血糖活性之間存在良好的相關(guān)性r=0.738（P＜0.05）。測得DNJ對α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶抑制作用的IC50值分別為：0.770、1.772 mg·mL-1。研究表明，在一定條件下，減壓耦合超聲波法對DNJ 的提取效果高于單一的超聲波提取法，且兩種方法聯(lián)合提取可有效保持桑葉DNJ 的降血糖活性。

隨著果汁飲料的普及和以桑葚為原材料的功能性食品的開發(fā)，DNJ 作為此類產(chǎn)品的主要功能成分，直接影響了產(chǎn)品的質(zhì)量[33]，所以將桑葉中DNJ 最大限度的提取出來變得至關(guān)重要。目前，國內(nèi)外學(xué)者對桑葉DNJ 的研究主要集中在活性成分等方面，對其提取新技術(shù)方面的研究較少，因此本研究將一種新型提取方法應(yīng)用在DNJ 提取方面，以期為建立桑葉DNJ 提取新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

減壓與超聲波法的結(jié)合，綜合了兩種方法的優(yōu)點，提高了DNJ 的提取效率，降低生產(chǎn)成本，且良好保留桑葉DNJ 的降血糖活性，但本研究僅研究了減壓耦合超聲法這一種提取方法對DNJ 得率及其降血糖功能的影響，其他新型的提取方法能否更高效率的提取桑葉DNJ還有待進(jìn)一步探究。劉穎坤等[34]采用超聲耦合雙水相萃取技術(shù)對葉百部生物堿進(jìn)行提取，并與傳統(tǒng)加熱回流法進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)超聲耦合雙水相萃取技術(shù)提取效果更好，這是因為在提取過程中，生物堿轉(zhuǎn)移至上層有機(jī)相，從而改變了提取過程中的化學(xué)平衡，有利于生物堿的溶出。沈紅等[35]分別對比分析了半仿生提取法、水煎煮法、溫浸法、酸性乙醇回流提取法、水蒸氣蒸餾5 種方法對麻黃堿的提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)半仿生的提取效果最好，半仿生提取法生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低，且能保留物質(zhì)原有的活性成分，被認(rèn)為是有希望替代傳統(tǒng)提取方法的新技術(shù)。此外，生物堿的新型提取技術(shù)還包括：離子液體輔助法、高剪切聯(lián)合超聲波法、微波-光波-超聲波聯(lián)合法以及低共熔溶劑萃取法等。因桑葉DNJ 是一種多羥基生物堿，所以大多數(shù)生物堿的提取方法均可應(yīng)用到桑葉DNJ 的提取中。此外由于該提取方法僅在實驗室進(jìn)行了初步的探究，由于工廠設(shè)備、儀器以及環(huán)境等各方面因素都可能會影響DNJ 的提取效果及降血糖活性，小劑量試制階段、中試階段及工業(yè)級別的影響還有待進(jìn)一步考究[36]。在桑葉DNJ 提取過程中會有很多非目標(biāo)性物質(zhì)溶出，導(dǎo)致DNJ 的純度較低，傳統(tǒng)的分離純化方法很難大幅提升其純度，所以了解、掌握、尋求新的桑葉DNJ 分離純化技術(shù)依然是今后的研究重點。