GA3噴施對川黃柏密植幼林生長及藥用成分含量的影響

陳文強(qiáng)，孫文愷，王雅寒，何功秀，何含杰，張黨權(quán)

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.水土保持與荒漠化防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002）

川黃柏Phellodendron chinenseSchneid 為蕓香科黃檗屬植物，與杜仲、厚樸被稱為三大木本中藥材樹種。川黃柏干燥莖皮等組織中含有生物堿、黃酮類等成分，具有清熱燥濕、解毒療瘡、瀉火除蒸的功效[1-3]。但是黃柏生長緩慢，一般要生長8～10 a 以上才能砍伐剝皮利用。2015 版《中國藥典》中川黃柏質(zhì)量控制及成分含量規(guī)定：小檗堿≥3.0%（30.0 mg/g），黃柏堿≥0.34%（3.4 mg/g）。已有的研究表明，2～3年生川黃柏部分莖皮已經(jīng)達(dá)到入藥標(biāo)準(zhǔn)，但其藥用成分含量與莖皮厚度、地徑密切相關(guān)[4]。川黃柏幼樹期以營養(yǎng)生長為主，是生物量迅速增長與形態(tài)建成的重要階段，而合理密植則可以提高土地利用效率和群體成活率。赤霉素是生物體內(nèi)的一類四環(huán)二萜類化合物，其中GA3是赤霉素家族中生物活性較強(qiáng)的一類植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物細(xì)胞伸長、植物開花、種子萌發(fā)、脅迫應(yīng)答、藥用成分合成等生理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[5-9]。如陳小文等[10]的研究結(jié)果顯示，外施GA3可以促進(jìn)1年生東北紅豆杉扦插苗中紫杉醇的合成與積累。已有的研究主要集中在川黃柏藥用成分提取及分析[2,11]、鑒定[12-13]、功效[14-15]等方面，選擇材料是成熟個(gè)體，但未見有關(guān)以川黃柏密植幼林為整體作為對象的研究與報(bào)道。因此，本研究以川黃柏密植幼林為研究材料，系統(tǒng)地研究和分析外源GA3對其早期生長、生理生化指標(biāo)和藥用成分含量的影響，明確GA3噴施處理的最佳質(zhì)量濃度及時(shí)期，為川黃柏幼苗的合理種植與采收提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)種子來源于湘西自治州吉首市，試驗(yàn)地位于長沙市主城區(qū)的中南林業(yè)科技大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)站，地處湖南省東部偏北、湘江下游和長瀏盆地西緣。土壤類型為紅壤，成土母質(zhì)為第四紀(jì)紅壤及泥質(zhì)粉細(xì)砂巖為主。種子在溫室提前萌發(fā)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)株行距為0.25 m×0.40 m，2018年3月10日將生長情況相近的幼苗移栽至試驗(yàn)地，煉苗至4月20日，開始第1 次噴施。每次噴施處理選擇在晴天無風(fēng)的17:00—19:00 進(jìn)行。每組噴施總量一致，以葉面濕潤不凝聚大水滴為宜，待葉面干后，再噴施一遍清水，共設(shè)置10 個(gè)處理（表1）。

表1 處理組編號及含義Table 1 Number and meaning of treatment

實(shí)驗(yàn)材料為2年生川黃柏苗，每月測定株高、地徑，噴施后12 h 測定相關(guān)生理指標(biāo)。選取生長相近的16 株，按地徑均分和分布相間的原則，分為CK 和GA3-10-100（2018年篩選出的最優(yōu)處理）兩個(gè)處理，每個(gè)處理8 株，由于2年生植株較高，全面噴施困難，僅噴施2.0 m 以下的葉片，其他同2018年。

株高測量地面至葉片最高處，地徑測量為植株地上莖干2.5 cm 處直徑。生理指標(biāo)使用鮮葉測定，每次采集同一層完整葉片。藥用成分按地上、地下采樣，地下部分采集側(cè)根皮和主根皮。地上部分分別采集植株主干距離地面10 cm 莖皮（基部莖皮）、110 cm 莖皮（中部莖皮）和主干頂部莖皮（頂部莖皮）及距主干頂部50 cm 處莖皮（上部莖皮），莖皮采集時(shí)采用環(huán)割法，割取10 cm。

1.2 川黃柏生理指標(biāo)的測定

川黃柏幼苗的株高利用不銹鋼卷尺進(jìn)行測定，精度為0.1 cm；地徑利用數(shù)顯游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，精度為0.01 mm；葉片可溶性糖含量采用蒽酮比色法進(jìn)行測定[16]；葉片可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法進(jìn)行測定[16]；植株含水量采用稱重烘干法進(jìn)行測定。

1.3 川黃柏藥用成分的提取與測定

精密稱取黃柏堿0.007 2 g（7.2 mg）和小檗堿0.012 0 g（12 mg），分別加入50 mL 和25 mL 容量瓶，添加乙腈/0.1%磷酸（體積比為1∶1）溶劑，滴定至刻度，制得0.144 mg/mL 和0.480 mg/mL 對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液各10 mL 并混勻，獲得質(zhì)量濃度為0.072 mg/mL 和0.240 mg/mL的混合對照液。

將收集到的川黃柏各組織樣品于50℃烘箱烘干，研缽研磨成粉過80 目篩，過篩部分為待測樣品。精確稱取0.1 g 樣品粉末，轉(zhuǎn)移至15 mL 玻璃提取瓶中，然后準(zhǔn)確添加57%乙醇10 mL，擰緊瓶蓋，120 W 超聲40 min，冷卻后搖勻，取部分于12 000 r/min離心5 min，上清液為藥用成分測定液。

混合對照液及川黃柏藥用成分含量利用高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography,HPLC）進(jìn)行測定。其中，色譜柱，Aglient ZORBAX SB-c18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相B，乙腈；流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液（每100 mL加0.1 g十二烷基磺酸鈉）；梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速1.0 mL/min；柱溫40℃；檢測波長0～10 min 為284 nm，10～30 min 為265 nm；進(jìn)樣量，5 μL。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Program of gradient elution

依照上述色譜條件，對混合對照液進(jìn)行測定（僅改變參數(shù)進(jìn)樣量），其中進(jìn)樣量分別為1、2、3、5、10、20 μL（n=6），黃柏堿和小檗堿HPLC 測定結(jié)果采用面積歸一化法計(jì)算藥用成分含量。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程分別為：黃柏堿Y=794.96X-1.039 3，R2=1.000 0，線性范圍為0.072～1.44 μg；小檗堿Y=3451.6X+30.071，R2=1.000 0，線性范圍為0.24～4.8 μg。精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)（8 h）、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)、進(jìn)樣條件檢驗(yàn)試驗(yàn)均重復(fù)6 次，均符合進(jìn)樣要求（表3）。

表3 黃柏堿及小檗堿HPLC 進(jìn)樣條件檢驗(yàn)Table 3 Inspection of sampling conditions for phellodendrine and berberine by HPLC

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差及顯著性分析（LSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對川黃柏株高的影響

不同處理對川黃柏密植幼林株高的影響如表4所示。初始測量株高時(shí)，各處理不存在顯著性差異。第2 次測量時(shí)，各處理間株高差異不顯著，從相對增長量來看，CK 處理5月的株高是4月的3.11 倍，9 個(gè)GA3處理相對增長量均大于CK 處理。噴施處理2 個(gè)月后，激素處理平均株高均大于CK 處理，其中GA3-10-200、GA3-30-200 和GA3-60-200 這3個(gè)處理平均株高比CK 分別高了33.28%、39.87%和 43.79%，達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05）。3 個(gè)月后，GA3-10-100、GA3-10-200、GA3-30-200 和GA3-60-200 這4 個(gè)處理平均株高均顯著高于CK（P＜0.05）。至9月20日挖取植株時(shí)，CK 平均株高為111.62 cm，GA3-10-100、GA3-10-200、GA3-30-200、GA3-60-200 這4 個(gè)處理平均株高分別為156.76、152.50、157.53 和146.53 cm，較CK分別高40.44%、36.62%、41.12% 和31.27%，其他處理平均株高較CK 增加了6.04%～15.27%。

表4 不同處理川黃柏株高變化情況?Table 4 Changes of plant height of two-years-old Phellodendron chinense in different treatments

綜合來看，4—5月，株高增加了16.40 cm；株高平均增長量最大值出現(xiàn)在5—6月，為58.39 cm；6—9月株高平均增長量分別為26.25、12.83 和11.39 cm，增長逐步放緩。年生長周期內(nèi)，各處理株高平均增長量呈“S”型曲線變化趨勢。

2.2 不同處理對川黃柏地徑的影響

不同處理對川黃柏密植幼林地徑的影響如表5所示。初始測量時(shí)，平均地徑為1.67 mm，各處理均不存在顯著性差異。處理1 個(gè)月后，CK 地徑增長了1.89 倍，各GA3處理的地徑相對增長量均大于CK，與株高變化趨勢一致。處理5 個(gè)月后，CK 的平均地徑為11.78 mm，GA3-10-100、GA3-10-200、GA3-30-200、GA3-60-200 這4 個(gè) 處理的平均地徑分別達(dá)到了14.33、14.52、14.17 和12.96 mm，比CK 分別高了20.65%、23.27%、20.29%和10.04%，與株高變化趨勢一致。GA3-10-50、GA3-30-100、GA3-60-100 這3 個(gè)處理的平均地徑相對增長量高于CK，GA3-30-50、GA3-60-50 處理的平均地徑相對增長量略低于CK。

表5 不同處理川黃柏地徑變化情況Table 5 Changes of ground diameter of two-years-old Phellodendron chinense in different treatments

綜合來看，4—5月，各處理的平均地徑增長了1.78 mm；5—6月，平均地徑增長量最大，達(dá)到了4.74 mm；6月到9月，地徑增長逐步放緩，分別為1.83、1.47 和1.02 mm。年生長周期內(nèi)，各處理的地徑增長均呈“S”型曲線變化趨勢，與株高變化趨勢一致。

2.3 不同處理對川黃柏葉片可溶性糖、可溶性蛋白及含水量的影響

由圖1可以看出，GA3處理的可溶性糖含量均高于CK 處理，其中10 d 間隔對應(yīng)的3 個(gè)質(zhì)量濃度和30 d 間隔對應(yīng)的3 個(gè)質(zhì)量濃度差異顯著（P＜0.05），200 mg/L 質(zhì)量濃度的GA3-10-200 和GA3-30-200 處理可溶性糖含量最高，分別為2.85%和2.72%，比CK 高55.36%和48.26%，其他處理較CK 高15.78%～36.20%。GA3噴施10 d 間隔及GA3噴施30 d 間隔對應(yīng)的不同噴施質(zhì)量濃度間相比較，其可溶性糖含量隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。在相同質(zhì)量濃度處理?xiàng)l件下，噴施時(shí)間間隔越短，則可溶性糖含量越高。GA3噴施周期10 d間隔、30 d 間隔和60 d 間隔的可溶性糖含量平均值分別為2.61%、2.46%和2.15%，噴施質(zhì)量濃度50、100 和200 mg/L GA3的可溶性糖含量平均值分別為2.32%、2.32%和2.58%，因此，短間隔高質(zhì)量濃度GA3噴施對可溶性糖含量的影響比較顯著。GA3處理的60 d 噴施時(shí)間間隔的3 個(gè)處理可溶性蛋白含量略小于CK 處理，10 d 噴施間隔和30 d 噴施間隔的處理均大于CK 處理，其中GA3-10-200、GA3-10-100 處理的可溶性蛋白含量達(dá)到了12.75、12.59 mg/g，比CK 分別提高了16.21%、14.73%，差異顯著（P＜0.05）。不同處理間，可溶性蛋白與可溶性糖的變化規(guī)律基本一致。

圖1 不同處理川黃柏葉片可溶性糖及可溶性蛋白含量的變化Fig.1 Changes of soluble sugar and protein content of Phellodendron chinense in different treatments

從表6可以看出，不同處理5—7月葉片平均可溶性糖及平均可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先降低再增高的變化趨勢，葉片平均含水量呈現(xiàn)先增高再降低的變化趨勢，表明葉片平均可溶性糖及平均可溶性蛋白含量的變化與葉片平均含水量變化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。并且5月下旬后，株間及行間葉片均相互接觸，林分郁閉度高，群體效應(yīng)明顯。

表6 不同月份各處理川黃柏葉片平均可溶性糖、可溶性蛋白及含水量Table 6 Average of soluble sugar,soluble protein and water content of Phellodendron chinense in different months

2.4 GA3 處理對2年生川黃柏藥用成分的影響

在2018年不同噴施GA3處理的基礎(chǔ)上，于2019年8月15日選擇生長表現(xiàn)最優(yōu)的GA3-10-100處理（以下稱GA3處理），挖取試驗(yàn)植株，測定其藥用成分，并與CK 進(jìn)行對比分析，結(jié)果見表7。從表7可以得知，CK 及GA3處理地上部分單株平均鮮質(zhì)量分別為1 609.62、1 857.95 g，差異顯著（P＜0.05）；并且GA3處理的單株平均葉片鮮質(zhì)量（含葉柄）比CK 高38.07%，差異極顯著（P＜0.01）；GA3處理葉莖比為0.79，高于CK 的0.58，達(dá)到極顯著差異水平（P＜0.01）。這種變化主要是由于GA3噴施植株2 m 以下葉片，促進(jìn)了側(cè)枝和著生葉片的生長，同時(shí)側(cè)枝的快速生長抑制了主干生長，這也是GA3處理株高普遍低于CK、GA3處理的莖葉比高于CK 的原因。

表7 不同處理2年生川黃柏株高、地徑及生物量對比?Table 7 Contrast of plant height,ground diameter and biomass of Phellodendron chinense in different treatments

從表8可以看出，兩個(gè)處理的地上部分的藥用成分含量在主干上從植株頂端（莖頂部）向下到基部是逐漸增加的，藥用成分含量和樹徑變化趨勢一致，GA3處理基部、中部和頂部莖皮的藥用成分均大于CK，其中GA3處理中部莖皮小檗堿含量比CK 高15.64%，分別為39.03、33.75 mg/g，黃柏堿含量比CK高18.07%，分別為4.64、3.93 mg/g，二者差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。CK 上部莖皮處的藥用成分含量和樹徑均大于GA3處理，表明了不同部位藥用成分含量高低與對應(yīng)的樹徑大小具有正相關(guān)關(guān)系。GA3處理地下部分的主根皮和側(cè)根皮的藥用成分含量均高于CK，其中GA3處理側(cè)根皮小檗堿、黃柏堿含量分別為41.02、4.16 mg/g，CK 含量分別為31.92、3.21 mg/g，GA3處理小檗堿、黃柏堿含量分別比CK 高28.51%和29.60%，差異顯著（P＜0.05）。

按照2015 版《中國藥典》中川黃柏質(zhì)量控制及成分含量規(guī)定，小檗堿和黃柏堿含量的最低標(biāo)準(zhǔn)分別為30.0 和3.4 mg/g。由表8可知，2年生川黃柏主莖皮中部（110 cm 處）以下部位小檗堿含量大于30 mg/g，上部以下莖皮黃柏堿含量大于3.4 mg/g，表明了2年生川黃柏中部以下莖皮能夠滿足入藥規(guī)范，因此，通過GA3處理增大樹徑，可以提高其藥用成分含量，縮短川黃柏采收時(shí)限。

表8 不同處理2年生川黃柏不同部位直徑及藥用成分對比Table 8 Contrast of diameter and medicinal components of different parts of Phellodendron chinense in different treatments

3 結(jié)論與討論

可溶性糖和可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們在植物生長過程中起著不可替代的作用[17-19]，葉面噴施GA3可以短時(shí)間內(nèi)提高葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量，噴施時(shí)間間隔和噴施質(zhì)量濃度對葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量具有一定的影響。GA3噴施處理對川黃柏密植幼林株高地徑生長、可溶性糖及可溶性蛋白積累有明顯的促進(jìn)作用，在各GA3處理中，短周期、高質(zhì)量濃度處理效果較好，并且有明顯的交互效應(yīng)。同時(shí)，GA3噴施有利于藥用成分的積累，藥用成分整體分布規(guī)律均是從植株頂端向基部（莖頂部向莖基部，側(cè)根向主根）遞增，與直徑大小在整株植物體表現(xiàn)規(guī)律一致。2年生川黃柏主莖皮110 cm 以下部位可以達(dá)到入藥規(guī)范，因此，采用密植、噴施植物生長調(diào)節(jié)劑等經(jīng)營措施可以提高川黃柏藥用資源利用率，縮短黃柏采收年限。

株高、地徑、生物量等是最直觀的選優(yōu)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過密植幼林，個(gè)體間產(chǎn)生的競爭更為激烈，尤其在林分郁閉后，群體個(gè)體加速分化，這導(dǎo)致部分植株生長受到壓制，株高、地徑、生物量的變異系數(shù)大，分化明顯。噴施GA3對株高、地徑、生物量和側(cè)枝的生長都具有較大的促進(jìn)作用，GA3處理的株高、地徑較CK 大20%以上。在篩選出的4 個(gè)較優(yōu)處理中，GA3-60-200 處理由于噴施間隔長，在實(shí)際生產(chǎn)過程比篩選出的其他處理更有優(yōu)勢。另外，噴施效果較好的質(zhì)量濃度處理有10 d 間隔100 mg/L 和200 mg/L、30 d 間隔200 mg/L 和60 d 間隔200 mg/L，表明了適當(dāng)提高質(zhì)量濃度與縮短噴施間隔可以達(dá)到同樣的效果。

總體看，GA3處理后川黃柏藥用成分在各部位大都高于CK，6 個(gè)位置僅上部莖皮處低于CK，這可能是GA3處理主干下部側(cè)枝發(fā)達(dá)分散了主干上部營養(yǎng)的緣故，從該處兩者直徑和株高對比可以得到驗(yàn)證。2年生川黃柏中部以下絕大部分莖皮滿足入藥規(guī)范，考慮到種源及個(gè)體間差異[20-21]，可以預(yù)測4～5年生川黃柏可以滿足入藥規(guī)范。當(dāng)然，實(shí)際生產(chǎn)中川黃柏地徑生長常常因?yàn)楦珊?、水澇等各種因素不如試驗(yàn)地理想，而且還要考慮到莖皮總產(chǎn)量、品質(zhì)的因素，采收年份需要延長，但是本試驗(yàn)川黃柏密植幼林模式仍然對實(shí)際生產(chǎn)有所啟發(fā)。不同部位的藥用成分存在較大差異，早期根皮及基部莖皮完全符合入藥規(guī)范，上部莖皮則可用作提取小檗堿的原料。早期密植可以提高成活率，避免雜草生長，在各年逐步疏伐時(shí)提早收獲，并不影響最終產(chǎn)量。本研究只測定了1～2年生川黃柏的藥用成分，而要得出經(jīng)濟(jì)合理的具體采收年限，還需結(jié)合產(chǎn)量、品質(zhì)、成本及價(jià)格等因素，測量和測定后續(xù)年份的川黃柏并開展調(diào)查，優(yōu)良的遺傳材料是提高中藥材品質(zhì)的關(guān)鍵，在后期研究中，應(yīng)著重培育川黃柏優(yōu)良品種及篩選優(yōu)良無性系，結(jié)合經(jīng)營措施提高川黃柏中藥材品質(zhì)和產(chǎn)量。