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    Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化陽(yáng)離子交換色譜分離牛初乳中乳鐵蛋白的工藝研究

    2021-03-04 03:13:10劉佳欣賀夢(mèng)瑤湯興楠欒凱雯
    遼寧化工 2021年2期
    關(guān)鍵詞:牛初乳鐵蛋白緩沖液

    劉佳欣,賀夢(mèng)瑤 ,湯興楠,欒凱雯

    (沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110142)

    乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)是一種鐵結(jié)合性糖蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約為 80 kDa[1],最早是由Sorensen(1939)在牛乳中一個(gè)未知的“紅色組分”中發(fā)現(xiàn)[2]。乳鐵蛋白在乳中的含量最為豐富,特別是在初乳中含量較高,人初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度可達(dá)到7 mg·mL-1,牛初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度平均為1 mg·mL-1[3]。

    乳鐵蛋白作為多功能糖蛋白具有多種生物活性,抗病毒、抗癌[4]、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[5],還具有抑菌功能[6-7],對(duì)腸道菌群的有一定調(diào)節(jié)作用。目前分離乳鐵蛋白的方法有很多種,如凝膠過(guò)濾層析法、膜分離法,親和色譜法[8-10]等。凝膠過(guò)濾層析操作簡(jiǎn)便所需設(shè)備簡(jiǎn)單,并且層析所用的凝膠屬于惰性載體,不會(huì)影響分離物。但凝膠過(guò)濾層析對(duì)流速要求較高,且對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離效果[11]。由于LF 的熱穩(wěn)定性差,而膜分離法是一個(gè)不需要加熱,并且不需要化學(xué)試劑的分離方法,因此可以最大限度地保持LF 的生物活性,但膜容易堵塞,不易清洗,分離成本高[12-13]。親和色譜法是一種新興的分離技術(shù),該技術(shù)通過(guò)利用固定相的結(jié)合特性實(shí)現(xiàn)對(duì)分子的分離,抗體與抗原作用專一性高、親和力強(qiáng),可實(shí)現(xiàn)一步分離.但操作費(fèi)用昂貴,不能用于工業(yè)化[14]。本試驗(yàn)試驗(yàn)采用陽(yáng)離子交換色譜CM-Sepharose fast flow 分離牛初乳中的乳鐵蛋白,并對(duì)其分離條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳的分離條件。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    95%乳鐵蛋白,biotopped 公司;牛初乳,木蘭花乳業(yè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng);CM-Sepharose fast flow 5 mL,通用電氣公司;鹽酸,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,均為分析純,西隴化工股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    AKTA purifier,通用電氣公司;高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司;Synergy2 多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司;HH4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 金壇市天瑞儀器有限公司;GB1302 型電子精密天平,梅特勒托利多儀器公司;SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器責(zé)任公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 樣品預(yù)處理

    將牛初乳裝入100 mL 離心管中,以10 000 r·min-14 ℃離心30 min,除去上層脂肪;加入1 mol·L-1的稀鹽酸,緩慢添加調(diào)至牛初乳溶液pH 為4.6,水浴加熱40 ℃,保溫30 min,然后放入高速冷凍離心機(jī)中,以10 000 r·min-140 ℃離心30 min,保留上層乳清蛋白,將得到乳清蛋白溶液;

    進(jìn)行抽濾,得到的粗樣品,用0.45μm 的微孔濾膜過(guò)濾,得到純凈的樣品。

    1.3.2 色譜條件

    色譜柱:CM-sepharose fast flow 預(yù)裝柱5 mL;流動(dòng)相:A 溶液(pH 值為7.0,濃度為0.02 mol·L-1的磷酸緩沖鹽溶液);B 溶液(pH 值為7.0,濃度為1 mol·L-1NaCl 混合溶液);洗脫速度1 mL·min-1;進(jìn)樣量: 1 mL,上樣速度1 mL·L-1;紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm、475 nm。

    1.4 單因素試驗(yàn)

    以起始緩沖液pH7、洗脫液濃度1 mol·L-1、洗脫速度1 mL·min-1、上樣速度1 mL·min-1為基本條件,通過(guò)改變單一因素來(lái)探討其對(duì)乳鐵蛋白得率的影響。起始緩沖液分別為6.0、6.5、7、7.5、8.0;洗脫液濃度0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1、洗脫速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1; 上樣速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1。

    1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 軟件,以乳鐵蛋白的得率為影響值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,響應(yīng)面因素和水平見(jiàn)表1。

    表1 響應(yīng)面因素和水平表

    1.6 乳鐵蛋白得率的測(cè)定方法

    乳鐵蛋白得率(%)=乳鐵蛋白峰面積÷總蛋白峰面積×100%。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    所有試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù),并通過(guò)SPSS17.0 軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析,p<0.01 差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,試驗(yàn)結(jié)果用作圖軟件origin9.0 繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 穿透曲線的繪制

    標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白的在CM-Sepharose fast flow 離子交換色譜上的穿透曲線如圖 1。試驗(yàn)在流速1 mL·min-1下進(jìn)樣, 由圖1 可見(jiàn)上樣體積達(dá)到1 mL時(shí)達(dá)到穿透點(diǎn), 2 mL 左右CM-Sepharose fast flow 離子交換色譜吸附基本達(dá)到飽和,之后吸附作用開(kāi)始減弱,由此計(jì)算得到, 進(jìn)樣2 mL 左右可以使預(yù)裝柱充分吸附, 因此確定最大上樣量為100 μg·mL-1。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 起始緩沖液pH 對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    圖1 CM-Sepharose fast flow 穿透曲線

    圖2 起始緩沖液對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    當(dāng)起始緩沖液pH 在6.0~6.5 時(shí),乳鐵蛋白得率降低,見(jiàn)圖2,這是因?yàn)楫?dāng)起始緩沖液pH 值為6.5時(shí),洗脫時(shí)需要高濃度的鹽溶液才可以將乳鐵蛋白洗脫下來(lái),因此乳鐵蛋白得率降低。當(dāng)起始緩沖液的 pH 為 8.0 時(shí), 乳鐵蛋白基本無(wú)法吸附在CM-Sepharose fast flow 色譜柱上,乳鐵蛋白會(huì)與部分雜蛋白等組分一起率先被洗脫下來(lái),此時(shí)的乳鐵蛋白得率不高[15-16]。

    2.2.2 洗脫液濃度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    洗脫液NaCl 濃度在0.6~1.0 mol·L-1時(shí),洗脫液濃度越大,乳鐵蛋白得率越高,當(dāng)洗脫液濃度為 0.8 mol·L-1時(shí)乳鐵蛋白得率最高,見(jiàn)圖3。當(dāng)洗脫液濃度繼續(xù)升高,乳鐵蛋白得率下降,這可能是因?yàn)樯俨糠秩檫^(guò)氧化物酶被洗脫下來(lái)。乳過(guò)氧化物酶等電點(diǎn)9.0,高于乳鐵蛋白的等電點(diǎn),與離子交換介質(zhì)的相互作用力強(qiáng)于乳鐵蛋白。洗脫液濃度過(guò)大,乳過(guò)氧化物酶的相互作用力減弱,也被洗脫下來(lái),導(dǎo)致乳鐵蛋白得率降低[17-19]。

    2.2.3 洗脫速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    由圖4 可以發(fā)現(xiàn),洗脫速率為 1.0 mL·min-1的情況下,得到乳鐵蛋白得率最高,而低于或高于此濃度的洗脫流速情況下,CM-Sephadrose fast flow 色譜柱吸附乳鐵蛋白的未能及時(shí)被洗脫下來(lái),使得乳鐵蛋白得率低。

    圖3 洗脫液濃度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    圖4 洗脫速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    2.2.4 上樣速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    上樣速率在 0.4~0.8 mL·min-1時(shí),上樣速率對(duì)乳鐵蛋白得率無(wú)明顯影響,上樣液中的乳鐵蛋白可以充分?jǐn)U散到CM-Sepharose fast flow 色譜柱表面。上樣速率超過(guò)0.8 mL·min-1后,乳鐵蛋白的得率開(kāi)始下降,這是因?yàn)樯蠘铀俾蔬^(guò)快,樣品中的乳鐵蛋白未及時(shí)被離子交換劑表面吸附就從層析柱中沖出,造成乳鐵蛋白流失[20-22]。

    圖5 上樣速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

    2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1 回歸模型的構(gòu)建及方差分析

    乳鐵蛋白分離試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案以及結(jié)果見(jiàn)表2,回歸方差分析見(jiàn)表3,擬合所得多元二次回歸方程Y=84.94+0.33A+0.36B+0.23C+0.14D+0.29AB-0.49A C+0.32AD+0.39CD-2.62A2-2.50B2-1.51C2-0.98D2。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果

    由表3 數(shù)據(jù)可知,該回歸模型達(dá)到極顯著水平(p<0.01),說(shuō)明該方法是可靠的;失擬項(xiàng)不顯著,R2=0.987 9,表明此模型的擬合程度良好,乳鐵蛋白得率可以用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)對(duì)比表3中的F值可以看出,影響乳鐵蛋白得率的主次順序?yàn)椋築>A>C>D,即洗脫速度>起始緩沖液pH>洗脫液濃度>上樣濃度。

    表3 回歸模型方差分析表

    2.3.2 各因素之間的交互作用

    根據(jù)回歸方程做出的各兩因素交互作用的響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖6。起始緩沖液pH(A)和洗脫速度(B)交互作用對(duì)乳鐵蛋白得率的影響顯著。起始緩沖液pH(A)和洗脫液濃度(C)交互作用對(duì)乳鐵蛋白的得率的影響顯著。洗脫液濃度(C)和上樣速度(D)交互作用對(duì)乳鐵蛋白得率的影響顯著。

    2.3.3 最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    用Design-Expert8.06 軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算,得到陽(yáng)離子交換色譜法分離乳鐵蛋白的最優(yōu)制備工藝條件為:起始緩沖液pH7.03,洗脫速度1.01 mL·min-1, 洗脫液濃度1.01 mol·mL-1, 上樣速度0.82 mL·min-1, 乳鐵蛋白得率的理論最優(yōu)值為84.98%。參照此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到乳鐵蛋白得率為84.43%,理論值的相對(duì)誤差為0.55%,說(shuō)明該方法具有一定的實(shí)際可操作性。

    3 討論

    乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

    圖6 各兩因素交互作用的響應(yīng)面

    近年來(lái),乳鐵蛋白的分離純化工藝不斷提高,已成功應(yīng)用于酸奶、嬰幼兒配方奶粉等產(chǎn)品中[23]。楊安樹(shù)[24]等采用 CM-Sepharose fast flow 陽(yáng)離子交換柱對(duì)經(jīng)脫脂、酪蛋白沉淀及超濾后的預(yù)處理樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離,得到純度為95%的乳鐵蛋白。任璐等[25]對(duì)流動(dòng)相不同pH 值對(duì)分離效果的影響作了分析并得出相似結(jié)論,pH 值在7.0~7.3 之間的流動(dòng)相較為適宜,能夠較好地分離LF 與其他雜蛋白??梢?jiàn)通過(guò)此方法能很好地分離牛初乳中的乳鐵蛋白,為乳鐵蛋白的純化奠定了基礎(chǔ)。

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