混合解烴菌群對石油污染土壤生物修復(fù)的研究

張晨　楊松　王思瑤　王乙羽　杜孟哲　李玉璽　王君

摘 要：為在實驗室條件下模擬混合解烴菌群對石油污染土壤的修復(fù)過程，將實驗室保藏的3株解烴菌XB、JH、LJ-5活化，采用稱重法測定土壤含油率，并對菌株的形態(tài)特征、乳化結(jié)果、石油降解率進行分析。結(jié)果表明，分別接種3種菌株LJ-5、XB、JH的錐形瓶中液蠟被乳化，且乳化程度較高;接入解烴菌XB、JH、LJ-5混合菌液的污染土壤菌落數(shù)在第20天達到最大值，為3.31×104cuf/g土壤;石油降解率從第15天至第25天變化最顯著，到第35天趨于穩(wěn)定，高達75%。試驗結(jié)果為生物降解石油、利用混合菌株降低環(huán)境中的石油類污染物含量提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：解烴菌;石油污染土壤;生物修復(fù)

中圖分類號 X172;X741 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）03-0017-03

Bioremediation of Petroleum Contaminated Soil by Mixed Hydrocarbon Decomposing Bacteria

ZHANG Chen et al.

（College of Biological and Environmental Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， China）

Abstract： In order to study the remediation process of petroleum contaminated soil with mixed hydrocarbon decomposing bacteria under laboratory conditions. Three hydrocarbon decomposing bacteria XB， JH and LJ-5 stored in the laboratory were activated and the oil content of soil was determined by weighing method. The morphological characteristics， emulsification results and oil degradation rate of the strains were further studied and analyzed. The results showed that the liquid wax was emulsified in the conical flasks inoculated with three strains LJ-5， XB and JH respectively， and the emulsification degree was high. When the mixed liquid of hydrocarbon decomposing bacteria XB， JH and LJ-5 was added into the contaminated soil， the colony number reached the maximum value of 3.31×104cuf/g soil at the 20th day， and the oil degradation rate changed most significantly from the 15th day to the 25th day， and the oil degradation rate tended to be stable at the 35th day The hydrolysis rate is as high as 75%， which provides a theoretical basis for biodegradation of petroleum and the use of mixed strains to reduce the content of petroleum pollutants in the environment.

Key words： Hydrocarbon decomposing bacteria; Petroleum contaminated soil; Bioremediation

石油能夠給人們帶來巨大的經(jīng)濟利益，但同時也對生態(tài)環(huán)境造成了巨大的破壞。在石油的開采、冶煉、運輸、使用以及處理過程中，遺漏、井噴和輸油管道泄漏等事故時常發(fā)生，造成嚴重的土壤污染，對環(huán)境和人類健康構(gòu)成極大的威脅[1]。因此，石油工業(yè)發(fā)展所帶來的環(huán)境問題日益受到重視[2]。對石油污染土壤的處理方法主要有生物法、化學(xué)法和物理法3種。化學(xué)法和物理法費用昂貴，且可能導(dǎo)致二次污染，一般僅作為生物方法的輔助手段[3]。生物修復(fù)是指利用微生物及其他生物，將土壤中的石油污染物降解成CO2和H2O，或轉(zhuǎn)化成無害物質(zhì)的工程技術(shù)[4]，具有處理效果好、處理費用低并能避免二次污染等優(yōu)勢。利用微生物修復(fù)石油污染土壤在環(huán)境科學(xué)界被廣泛認可，并認為具有很大的發(fā)展前景[5]。利用多元細菌培養(yǎng)技術(shù)，以序列信息為指導(dǎo)，用富集培養(yǎng)、直接培養(yǎng)和特殊培養(yǎng)3種方法，從水樣中分離出3株高溫解烴菌，對原油的降解率、降粘率較高，能有效降低原油的凝固點，具備提高石油采收率的潛力[6]。筆者應(yīng)用實驗室篩選保藏的解烴菌XB、JH和LJ-5對石油污染土壤進行生物修復(fù)，培養(yǎng)過程中定期取樣，用稱重法測定土壤含油率，研究實驗室條件下混合解烴菌群對石油污染土壤的修復(fù)過程，以期為利用微生物進行石油污染土壤修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 取濱州學(xué)院黃河三角洲生態(tài)中心溫室附近的表層土壤為土壤樣品。原油由濱州油田提供。LB培養(yǎng)基：酵母浸出膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸餾水1000mL，pH7.2。MSM培養(yǎng)基：Na2HPO4 1.5g，K2HPO4 3.48g，MgSO4 0.7g，（NH4）2SO4 4g，酵母粉0.01g，液蠟2%，蒸餾水1000mL，pH 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 石油污染土壤樣品的制備 將采集的土壤樣品過100目篩，按2%原油添加量稱取原油溶于石油醚中，將石油醚溶液均勻灑在已過篩的土壤樣品中，攪拌混勻后置于通風(fēng)櫥中，待石油醚完全揮發(fā)干凈后備用。

1.2.2 解烴菌的馴化 將實驗室保藏的解烴菌XB、JH和LJ-5活化后，在100mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，以10%的接種量接種到100mL MSM培養(yǎng)基中，37℃條件下往復(fù)振蕩，培養(yǎng)5d，反復(fù)馴化3次。

1.2.3 解烴菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將3株解烴菌XB、JH和LJ-5用劃線平板法分別接種到LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察單菌落的菌體形態(tài)和顏色特征。

1.2.4 解烴菌的乳化實驗 將XB、JH和LJ-5菌液分別取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基中，10h后取10mL接種到含2%液蠟的100mL MSM培養(yǎng)基中，37℃條件下往復(fù)振蕩。3d后吸取10mL再次接種到含2%液蠟的100mL MSM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d，觀察乳化情況。

1.2.5 土壤中菌落計數(shù) 稱取待測土樣各10g，放入盛有90mL無菌水并帶玻璃珠的三角燒瓶中，高速振搖約20min使土樣與水充分混合，使細胞分散。用1000μL移液槍吸取1mL土壤懸液加入裝有9mL無菌水的試管（規(guī)格15mm×150mm）中，充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推制10-2、10-3、10-4、10-5土壤懸液，以此達到對土壤樣品進行梯度稀釋的目的。取100μL土壤稀釋液涂布到LB固體平板上，將涂布好的平板倒置于生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)。

1.2.6 石油降解率的測定 （1）菌液的制備：先用LB培養(yǎng)基制備XB、JH和LJ-5菌株的菌懸液，然后按照1%的接種量將菌懸液分別倒入MSM培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置為37℃，轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)24h。（2）混合菌液的制備：從擴大培養(yǎng)的MSM培養(yǎng)基中分別量取XB、JH和LJ-5菌液液各100mL，加入到500mL的錐形瓶中充分混勻，得到3株解烴菌的混合菌液，制備3份，分別標記為1、2、3。（3）石油污染土壤的處理：分別稱取1kg石油污染土樣分裝在編號為A、B、C、D、E的5個花盆中，再從1、2、3號錐形瓶中各量取200mL XB、JH和LJ-5的混合菌液，對應(yīng)加入到A、B、C 3個花盆中，向D和E花盆中各加入200mL無菌水。A、B、C花盆為實驗組，C和D花盆為對照組。將處理好的A、B、C、D、E 5個花盆置于室溫下進行培養(yǎng)實驗，每隔2d翻動土壤1次并補充水分，充分攪拌，使樣品濕度保持在20%左右。每隔5d取樣1次，所取樣品保藏于4℃冰箱中備用。

1.2.7 土壤含油率的測定 稱取A、B、C、D、E 5個花盆中的土樣各10g，分別加入到5個100mL的錐形瓶中，再加入10mL石油醚，使土壤充分溶解于石油醚中。靜置后將上清液吸出，轉(zhuǎn)入到已烘至恒重的100mL小燒杯中，即可得到溶有石油的石油醚溶液。將小燒杯放入65℃烘箱中烘干稱重。帶有已烘干石油的小燒杯重量記為Ma，烘至恒重的小燒杯重量為Mb，依據(jù)公式計算石油降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 解烴菌的形態(tài)特征 對解烴菌XB、JH和LJ-5的菌落特征進行觀察，如圖1所示。由圖1可知，菌株XB菌落較小，表面干燥，圓形，扁平，不透明，邊緣整齊，顏色為白色;菌株JH菌落中等，表面濕潤，圓形，凸起，不透明，邊緣整齊，顏色為橘黃色;菌株LJ-5菌落中等，表面濕潤，圓形，扁平，半透明，邊緣整齊，顏色為乳白色。

2.2 菌株的乳化程度 將菌株XB、JH和LJ-5分別接種到相同含量的液蠟培養(yǎng)基中，根據(jù)液蠟的乳化程度來評價解烴菌的馴化結(jié)果。由圖2可知，接種了菌株的3個錐形瓶中的液蠟被乳化，且乳化程度較高，說明3株解烴菌的馴化結(jié)果較好。

2.3 土壤中的菌落數(shù) 由圖3可知，在微生物處理石油污染土壤過程中，土樣中微生物總菌數(shù)在第20天達到最高值，為3.31×104cuf/g土壤。

2.4 解烴菌株對石油降解率的影響 由圖4可知，在石油污染土壤的生物修復(fù)過程中，接入解烴菌XB、JH和LJ-5混合菌液的實驗組中石油降解率從第15天至第25天變化最為顯著，到第35天趨于穩(wěn)定，土樣中石油降解率高達75%。由此可見，解烴菌XB、JH和LJ-5混合菌群解烴效果較好，可進一步用于石油污染土壤生物修復(fù)的現(xiàn)場試驗。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，解烴菌XB、JH和LJ-5在液蠟中馴化時對液蠟乳化程度較高，具有優(yōu)良的解烴能力;接入解烴菌XB、JH和LJ-5混合菌液的污染土壤中，菌落數(shù)在第20天達到最大值，為3.31×104cuf/g土壤;石油降解效果從第15天至第25天變化最顯著，到第35天趨于穩(wěn)定，高達75%;對菌落進行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，接入的外源菌XB、JH和LJ-5在該修復(fù)過程中一直屬優(yōu)勢菌，在石油污染土壤的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。本試驗在實驗室條件下模擬混合解烴菌群對石油污染土壤的修復(fù)并取得了良好的效果，但在實際應(yīng)用中還需考慮天氣以及N、P等營養(yǎng)物質(zhì)的補充等對石油降解的影響。

參考文獻

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[8]Marx MC，Wood M，Jarvis SC.A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils[J]. Soil Biology & Biochemistry，2001，33（12-13）：1633-1640. （責(zé)編：徐世紅）

基金項目：全國大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃（201810449019）。

作者簡介：張晨（2000—），女，山東濱州人，在讀本科，研究方向：微生物的分離與應(yīng)用。 *通訊作者? 收稿日期：2021-01-06