殼寡糖對奶牛外周血單個核細(xì)胞抗氧化功能的促進(jìn)作用

鄭亞光 齊敬宇 張博綦 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

自由基是正常呼吸、新陳代謝和異種生物自氧化的副產(chǎn)物[1]。處于不同泌乳階段的奶牛經(jīng)常暴露在活性氧(ROS)自由基中，由于高產(chǎn)奶牛具有較高的營養(yǎng)和生理代謝水平，引起一氧化氮(NO)等自由基在體內(nèi)的過量積累，當(dāng)機(jī)體內(nèi)抗氧化劑對自由基清除不足時，多余的自由基會對細(xì)胞膜造成損害，使細(xì)胞功能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致組織和器官的功能紊亂與氧化應(yīng)激，并伴隨一系列疾病的產(chǎn)生，在奶牛中會導(dǎo)致乳腺炎和生殖障礙、乳房水腫、胎盤殘留、乳腺炎等，對奶牛的生產(chǎn)周期產(chǎn)生不利影響，降低產(chǎn)奶量和經(jīng)濟(jì)價值[2]。因此，為動物補(bǔ)充抗氧化劑是調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)、降低氧化應(yīng)激的有效途徑[3]。殼聚糖通過酸水解和酶降解方法可得到殼寡糖(COS)，它是一種由β-1,4-糖苷鍵連接的二氨基葡萄糖的低聚物，具有水溶性、無細(xì)胞毒性、容易通過腸道吸收等特點(diǎn)[4]。COS還被證明具有多種生物活性，包括抗炎、免疫刺激、抗氧化[5]，其理化性質(zhì)與殼聚糖非常相似[6]。COS可提高細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)含量，表明COS在活細(xì)胞中可以作為有效的抗氧化劑[7]。一些報(bào)道指出殼聚糖及其衍生物可以提高奶牛的抗氧化功能和免疫功能[4-5]，但其影響機(jī)理尚不清楚。NO是一種通過一氧化氮合酶將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸的具有信號調(diào)節(jié)功能的自由基，然而，長期過量的NO生成與許多疾病有關(guān)[8]。過量的NO對奶牛乳腺上皮細(xì)胞造成了氧化損傷，并誘導(dǎo)了炎癥因子的產(chǎn)生[9]。以小鼠胰腺β細(xì)胞系MIN6為模型的研究指出，COS對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制與其顯著抑制了NO的產(chǎn)生有關(guān)[10]。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠264.7巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究表明，COS可以通過調(diào)節(jié)核因子-κB(NF-κB)信號通路和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)抑制NO的生成，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激[11]。這些結(jié)果提示COS可以調(diào)節(jié)奶牛的抗氧化功能，其機(jī)制可能與COS通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)NO的生成有關(guān)。

外周血單個核細(xì)胞(PBMC)是一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠反映機(jī)體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應(yīng)激能力與奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相關(guān)。PBMC是抵御病原體入侵的第1道免疫防線，它通過產(chǎn)生炎性介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子，通過吸引其他免疫細(xì)胞到炎癥部位而有效地調(diào)節(jié)炎癥過程[12]。在奶牛上的研究表明，疾病(如口蹄疫)發(fā)生時，由PBMC釋放的NO使血清中NO含量上升[13]。本試驗(yàn)以奶牛PBMC為模型，通過體外試驗(yàn)研究COS對PBMC的細(xì)胞活力、抗氧化酶活性及炎癥因子含量及其基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步從體外驗(yàn)證COS對奶牛PBMC抗氧化功能的調(diào)節(jié)作用，并通過檢測NO合成相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)以及NF-κB信號通路相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)一步探討COS對奶牛PBMC抗氧化功能的調(diào)節(jié)是否與降低了NO的生成有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PBMC采用Ficoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)制備。COS，食品級，脫乙酰度≥85%，相對分子質(zhì)量≤3 000，粒度≥140目，水分含量≤10%，購自濟(jì)南某生物工程有限公司。

1.2 試劑配制

COS工作液配制:準(zhǔn)確稱取0.32 g COS，溶解在10 mL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為32 mg/mL的COS一級母液。取1 mL一級COS母液溶解于9 mL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為3.2 mg/mL的COS二級母液。取COS二級母液繼續(xù)溶解于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，依次進(jìn)行稀釋，獲得終濃度為320、160、80、40 μg/mL的工作液，母液和工作液均通過0.22 μm濾器過濾除菌。

1.3 PBMC的分離培養(yǎng)

本試驗(yàn)所用到的血樣是從沙梁牧場(呼和浩特市)采集的，來自3頭健康荷斯坦奶牛[泌乳天數(shù)(200±15)d，產(chǎn)奶量(34.80±4.95)kg/d，胎次為3胎]，于晨飼前空腹尾靜脈采血，使用含EDTA抗凝劑的抗凝血采血管采集血液并于12 h內(nèi)完成細(xì)胞的分離。PBMC分離方法根據(jù)English等[14]和Ferrante等[15]的研究進(jìn)行，簡要步驟如下：使用牛PBMC分離液KIT中的稀釋液按1∶1比例對混合后的血液進(jìn)行稀釋，在15 mL離心管中將稀釋后的血液按照與分離液1∶1的比例小心地加于牛PBMC分離液上方，在水平離心機(jī)(Beckman，美國)中400～500×g分離30 min，離心后由上至下分為4層，第1層為血漿層，第2層為環(huán)狀乳白色PBMC層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細(xì)胞層。吸取第2層的細(xì)胞層并用PBS重懸清洗細(xì)胞，250×g離心10 min后棄上清，重復(fù)清洗細(xì)胞2次后，將細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將分離得到的PBMC隨機(jī)分為5組，進(jìn)行如下處理：對照組(CON組)細(xì)胞培養(yǎng)液中不添加COS(0 μg/mL COS)；COS40、COS80、COS160和COS320組在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加40、80、160和320 μg/mL的COS，每個處理6個重復(fù)。即將細(xì)胞接種于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)瓶中的COS的終濃度達(dá)到上述5個濃度，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的細(xì)胞一部分接種于96孔培養(yǎng)皿中，用于細(xì)胞活力的檢測，每個孔的接種密度為1×106個/mL；另一部分細(xì)胞直接收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 樣品采集

細(xì)胞上清液：將每個重復(fù)的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打混勻后，吸取1 mL于1.5 mL無菌無酶的離心管中，水平離心機(jī)中250×g離心10 min，將細(xì)胞上清液吸取轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管內(nèi)，用于抗氧化相關(guān)酶活性和炎癥因子含量的檢測。

細(xì)胞樣品的制備：繼上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞250×g離心10 min后，棄掉多余的上清液，在1.5 mL離心管內(nèi)加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，250×g離心10 min后棄除PBS，清洗細(xì)胞2次后，加入1 mL Trizol Plus于冰上反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，用于后續(xù)RNA的提取。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 細(xì)胞活力與抗氧化指標(biāo)

采用CCK-8法測定奶牛PBMC的細(xì)胞活力。將根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)處理后的細(xì)胞懸液加于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞密度1×106個/mL，每個孔加入CCK-8 10 μL，用槍頭與細(xì)胞混勻后孵育細(xì)胞1 h左右，使用全自動酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H1，美國)測定450 nm處的吸光度(OD)值，孵育時間的長短以使對照組的OD值接近于1為宜(OD值控制在1時較為穩(wěn)定，本試驗(yàn)的孵育時間為1 h)。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：

細(xì)胞活力=試驗(yàn)組OD值/對照組OD值。

細(xì)胞上清液中CAT、SOD、GPx、TrxR的活性根據(jù)試劑盒說明書，使用全自動分光光度計(jì)(UN2CO-WFT2100，Aoyi，中國)進(jìn)行檢測。

1.6.2 ROS、iNOS活性以及NO與炎癥因子含量

細(xì)胞上清液中ROS、iNOS活性以及NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，使用全自動分光光度計(jì)或全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.6.3iNOS、炎癥因子和NF-κB信號通路相關(guān)基因表達(dá)

表1 引物信息

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)通過Excel 2013整理計(jì)算，使用SAS 9.4軟件的GLM程序和回歸分析(線性和二次效應(yīng))程序進(jìn)行分析，并采用Duncan氏多重比較法評估組間差異顯著性。當(dāng)P<0.05時，表明差異具有顯著性，而當(dāng)0.05≤P<0.10時表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的趨勢，P≥0.10時表明差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活力、抗氧化酶活性和炎癥因子含量

由表2可知，各COS組的細(xì)胞活力在數(shù)值上均高于CON組，但組間差異不顯著(P≥0.10)。與CON組相比，COS80、COS160、COS320組的TrxR活性顯著升高(P<0.05)，其中以COS80組的活性最高，并顯著高于COS40組(P<0.05)；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，TrxR活性呈顯著的二次曲線升高(P=0.043)。SOD的活性以C160和C320組較高，趨于顯著地高于CON組(P=0.095)；回歸分析得出，SOD的活性隨COS劑量的增加呈顯著的線性升高(P=0.032)?；貧w分析得出，CAT活性隨COS劑量的增加呈現(xiàn)顯著的二次曲線升高(P=0.013)，以COS80組的活性最高，趨于顯著地高于CON和COS320組(P=0.063)，且COS320組與CON組之間無顯著差異(P≥0.10)。

表2 COS對細(xì)胞活力、抗氧化酶活性和炎癥因子含量的影響

與CON組相比，COS40、COS80、COS160組的TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，尤以COS160組含量最低，COS320組顯著高于COS160組(P<0.05)，但與CON組和其他COS組無顯著差異(P≥0.10)；回歸分析得出，TNF-α含量隨COS劑量的增加呈顯著的二次曲線降低(P<0.001)。COS40組NO含量顯著高于CON組(P<0.05)，COS160組的NO含量顯著低于CON組(P<0.05)，COS80、COS160、COS320組NO含量顯著低于COS40組(P<0.05)，以COS160組的含量最低；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，NO含量呈趨于顯著的線性降低趨勢(P=0.052)。IL-1β、IL-6含量隨COS劑量的增加先下降后上升，COS40和COS80組IL-1β含量趨于顯著地低于COS320組(P=0.058)，COS80組IL-6含量趨于顯著地低于COS320組(P=0.090)；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，IL-1β含量呈趨于顯著的二次曲線降低趨勢(P=0.073)，IL-6含量呈趨于顯著的線性降低趨勢(P=0.068)。ROS活性隨COS劑量的增加而下降，但各組間差異不顯著(P≥0.10)。與CON組相比，COS80、COS160和COS320組的iNOS活性顯著降低(P<0.05)，其中以COS160組最低；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，iNOS活性呈顯著的二次曲線上升(P=0.005)。COS劑量對GPx活性沒有產(chǎn)生顯著影響(P=0.399)。

2.2 iNOS、炎癥因子和NF-κB信號通路的基因表達(dá)

由表3可知，與CON組相比，各COS組NF-κBp50和NF-κBp65的mRNA相對表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，其中NF-κBp50的mRNA相對表達(dá)量以COS160、COS320組較低，NF-κBp65的mRNA相對表達(dá)量以COS160組最低；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，NF-κBp50的mRNA相對表達(dá)量呈顯著的線性下降(P<0.001)，NF-κBp65的mRNA相對表達(dá)量呈顯著的二次曲線降低(P<0.001)。COS40、COS80和COS160組iNOS的mRNA相對表達(dá)量顯著低于CON組(P<0.05)，但COS320組顯著高于CON組和其他COS組(P<0.05)。COS80和COS160組TNF-α的mRNA相對表達(dá)量顯著低于CON、COS40和COS320組(P<0.05)，CON、COS40和COS320組之間無顯著差異(P≥0.10)；回歸分析得出，iNOS和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量均隨COS劑量的增加呈顯著的二次曲線降低(P<0.001)。IL-1β的mRNA相對表達(dá)量隨COS劑量的增加先降低后升高，其中以COS80組最低且趨于顯著地低于COS320組(P=0.088)，但與CON組相比無顯著差異(P≥0.10)；回歸分析得出，IL-1β的mRNA相對表達(dá)量隨COS劑量的增加呈趨于顯著的二次曲線降低趨勢(P=0.060)。

表3 COS對iNOS、炎癥因子和NF-κB信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 體外添加COS對奶牛PBMC抗氧化功能和炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

PBMC包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是機(jī)體主要的血液免疫細(xì)胞，能夠反映機(jī)體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應(yīng)激能力與奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相關(guān)。通常，內(nèi)源性抗氧化劑包括SOD、GPx、CAT和TrxR在內(nèi)的酶抗氧化劑，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御的主要形式。SOD催化超氧陰離子歧化為H2O2和氧分子(O2)，因此使?jié)撛谟泻Φ某蹶庪x子的危害性降低；GPx可將H2O2分解為水[16]，血漿GPx活性與脂質(zhì)過氧化物含量有關(guān)；CAT是一種常見的抗氧化酶，幾乎存在于所有利用氧氣的活組織中，催化H2O2還原為水和O2；TrxR組成了硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)，是重要的抗氧系統(tǒng)[17]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，體外PBMC中添加COS對TrxR、CAT和SOD活性的促進(jìn)作用呈二次曲線劑量依賴效應(yīng)，其中以COS80和COS160組效果較好；而COS320組CAT活性與COS160組相比有降低趨勢，與CON組相近，說明COS對奶牛PBMC的抗氧化相關(guān)指標(biāo)的促進(jìn)作用呈劑量依賴性。已有體內(nèi)試驗(yàn)指出，在大鼠飼糧中添加COS可以提高SOD、CAT、GPx活性和總抗氧化能力(T-AOC)，降低血清、肝臟、脾臟中的丙二醛(MDA)含量，通過減輕脂質(zhì)過氧化和恢復(fù)抗氧化能力，保護(hù)大鼠免受H2O2的損傷[18]。本試驗(yàn)從體外印證了COS可提高PBMC的抗氧化功能。

在PBMC中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子含量的高低可以反映細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，受到如LPS等刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子會大量產(chǎn)生引起炎癥反應(yīng)[19]。本試驗(yàn)中IL-1β、TNF-α和NO的含量及其基因的mRNA相對表達(dá)量隨著COS劑量的增加呈顯著或趨于顯著的二次曲線降低，其中以COS160組的含量最低，IL-6的含量也有下降的趨勢，說明COS在改善奶牛PBMC抗氧化功能的同時，對炎癥因子的產(chǎn)生也具有劑量依賴性的抑制作用，COS320組對炎癥因子的產(chǎn)生沒有表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

3.2 COS促進(jìn)奶牛PBMC抗氧化和降低炎癥反應(yīng)的機(jī)理

在炎癥過程中，乳腺的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO在乳腺炎期間介導(dǎo)炎癥，過量釋放的NO會對奶牛的組織器官(如乳腺等)造成氧化損傷[20]。有研究表明，體外刺激小鼠巨噬細(xì)胞時，iNOS的表達(dá)增強(qiáng)，會導(dǎo)致NO、TNF-α和白細(xì)胞介素(IL)大量產(chǎn)生[21]。iNOS的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路的調(diào)控，在正常細(xì)胞中，胞漿中的NF-κB信號通路是非活性的，由蛋白二聚體(p65/p50)和NF-κB抑制蛋白(IκB)抑制劑組成[22]，NF-κB信號通路一旦被激活，p65/p50二聚體可以遷移到細(xì)胞核中，啟動炎癥因子如IL-1β、TNF-α和iNOS等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)NO大量生成[23]。有體內(nèi)試驗(yàn)也表明，殼聚糖可通過NO分子途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[24]。本試驗(yàn)中，通過對NF-κBp50和NF-κBp65基因表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn)，體外添加COS對奶牛PBMC的NF-κB信號通路具有抑制作用，并呈現(xiàn)線性劑量依賴效應(yīng)，與CON組相比，各COS組中iNOS活性及其基因的mRNA相對表達(dá)量及NO的含量均隨COS劑量的增加先降低后升高，其中COS160組最低，COS320組出現(xiàn)升高趨勢，表明COS可以在一定范圍內(nèi)對奶牛PBMC中iNOS的表達(dá)具有抑制作用，并降低NO的產(chǎn)生；同時，免疫因子IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量也隨COS劑量的增加呈下降趨勢。這提示，COS提高PBMC的抗氧化功能，抑制炎癥反應(yīng)的反生，可能與其對NF-κB信號通路活性的抑制降低了NO的生成有關(guān)。有研究指出，低分子質(zhì)量的硫酸化殼寡糖可抑制LPS誘導(dǎo)導(dǎo)致的NO、IL-6和TNF-α等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，并通過NF-κB信號通路活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生[25]，因此，今后可從MAPK信號通路進(jìn)一步探討COS影響PBMC抗氧化功能與炎癥因子產(chǎn)生的機(jī)理。

4 結(jié) 論

體外添加COS對奶牛PBMC抗氧化功能的促進(jìn)作用及其對炎癥因子產(chǎn)生的抑制作用呈劑量效應(yīng)，其中以160 μg/mL COS的效果較好，但320 μg/mL COS對炎癥因子產(chǎn)生的抑制作用減弱；COS抑制了NF-κBp50和NF-κBp65的基因表達(dá)，COS可能通過抑制NF-κB信號通路活性，降低iNOS與炎癥因子IL-1β和TNF-α的基因表達(dá)，降低NO的生成，進(jìn)而提高抗氧化應(yīng)激能力。