諾麗果原粉對(duì)絨山羊體外瘤胃發(fā)酵功能的影響

張清月 梁曉帥 李胤豪 馬國(guó)強(qiáng) 郭曉宇 趙艷麗 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古絨山羊作為世界著名的絨肉兼用型品種，其肉質(zhì)細(xì)嫩、膻味小且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。但由于天然草場(chǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)季節(jié)性不平衡以及我國(guó)禁牧力度的不斷加強(qiáng)，絨山羊的養(yǎng)殖逐漸由放牧轉(zhuǎn)變?yōu)樯犸暫桶肷犸曫B(yǎng)殖。然而，集約化養(yǎng)殖易使絨山羊產(chǎn)生氧化應(yīng)激，甚至引起營(yíng)養(yǎng)代謝病，進(jìn)而降低其生產(chǎn)性能?？股卦诮鉀Q上述問(wèn)題時(shí)也帶來(lái)了食品安全隱患，且飼料中的全面禁抗使得養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中替抗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)尤為需要。諾麗(MorindacitrifoliaL.，藥名海巴戟)在我國(guó)東南部地區(qū)種植廣泛，其果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物學(xué)活性物質(zhì)，主要為多酚類、糖苷類和生物堿等，具有抗菌、消炎和提高免疫力等多種功效[1]，極具開(kāi)發(fā)為綠色飼料添加劑及新型替抗產(chǎn)品的前景。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于諾麗果的研究主要集中在其功能性成分的提取和分析上，以及以小鼠[2]、雞[3]和犢牛[4]為模型研究其藥理作用，或是研究其工業(yè)廢棄物對(duì)奶山羊體外發(fā)酵的影響[5]。然而，將諾麗果作為飼料添加劑應(yīng)用于絨山羊等反芻動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。瘤胃作為反芻動(dòng)物最重要的消化器官，其功能對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的獲取具有重要意義。但活體試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量大、試驗(yàn)周期長(zhǎng)且成本高，研究工作常受到限制。而體外瘤胃發(fā)酵可在離體環(huán)境下模擬瘤胃內(nèi)的消化過(guò)程，且更為省時(shí)省力。因此，本試驗(yàn)利用體外瘤胃發(fā)酵結(jié)合多項(xiàng)組合效應(yīng)值(MFAEI)，研究飼糧中添加不同劑量的諾麗果原粉對(duì)絨山羊瘤胃發(fā)酵功能的調(diào)控作用，以期為諾麗果資源在飼料領(lǐng)域的綜合利用提供基礎(chǔ)，也為絨山羊養(yǎng)殖中替抗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

諾麗果風(fēng)干片由海南省五指山市諾麗果基地提供，于65 ℃烘干，粉碎后過(guò)40目篩制成諾麗果原粉。

3.系統(tǒng)內(nèi)普法與社會(huì)普法不平衡。各級(jí)各部門在落實(shí)責(zé)任制過(guò)程中，存在系統(tǒng)內(nèi)普法與社會(huì)普法不能并重的情況。許多單位積極開(kāi)展社會(huì)普法，緊密結(jié)合本部門法律法規(guī)頒布實(shí)施紀(jì)念日、宣傳日、紀(jì)念周等重要普法節(jié)點(diǎn)，組織開(kāi)展各類有聲有色的普法活動(dòng)，但卻忽視對(duì)系統(tǒng)內(nèi)執(zhí)法人員和工作人員的普法，執(zhí)法工作人員法律素養(yǎng)不夠高，法治意識(shí)不夠強(qiáng)，開(kāi)展“誰(shuí)執(zhí)法誰(shuí)普法”的廣度與深度不夠，實(shí)效性欠缺。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和基礎(chǔ)飼糧

選取3只體況相近、年齡為2.5歲的健康絨山羊羯羊(品系為內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊)作為瘤胃液供體羊。每天于09:00和15:00對(duì)供體羊進(jìn)行飼喂，供體羊自由飲水，基礎(chǔ)飼糧參照我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

于剛性輪，其中在空載工況中尤為明顯，脫軌系數(shù)減小43.84%，超限時(shí)間減少26.09%。直線軌道上彈性輪和剛性輪的脫軌系數(shù)均未超過(guò)限值，彈性輪的最大值略小。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考Menke等[7]的方法配制緩沖液，稱取1 g發(fā)酵底物放入高壓滅菌的發(fā)酵瓶中，于39 ℃預(yù)熱。于晨飼前經(jīng)口腔采集3只絨山羊的瘤胃液，混合后經(jīng)1層紗布過(guò)濾至已預(yù)熱達(dá)39 ℃并通有二氧化碳(CO2)的保溫瓶中。將瘤胃液與緩沖液按1∶2的比例混合，并分裝至上述玻璃瓶中，培養(yǎng)體系為60 mL，該步驟全程通CO2進(jìn)行。將發(fā)酵瓶密封后于39 ℃氣浴搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。培養(yǎng)時(shí)間分別為3、6、9、12和24 h，到達(dá)各時(shí)間點(diǎn)后，迅速將相應(yīng)的培養(yǎng)瓶取出，冰浴終止發(fā)酵，并取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

表2 NF1～NF4組試驗(yàn)飼糧的營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 體外培養(yǎng)方法

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)5個(gè)諾麗果原粉添加劑量，試驗(yàn)飼糧分別以0(對(duì)照組，CON組)、1.0%(NF1組)、2.0%(NF2組)、3.5%(NF3組)和5.0%(NF4組)的諾麗果原粉等比例替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米；并設(shè)5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，分別為3、6、9、12和24 h；每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)重復(fù)(即每個(gè)添加劑量有30個(gè)發(fā)酵瓶)。其中，CON組的發(fā)酵底物為基礎(chǔ)飼糧，營(yíng)養(yǎng)水平與瘤胃液供體羊基礎(chǔ)飼糧的營(yíng)養(yǎng)水平相同；NF1～NF4組試驗(yàn)飼糧的營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

粗蛋白質(zhì)(CP)含量的測(cè)定參照《飼料中粗蛋白的測(cè)定 凱氏定氮法》(GB/T 6432—2018)；粗脂肪(EE)含量的測(cè)定參照《飼料中粗脂肪的測(cè)定》(GB/T 6433—2006)；鈣含量的測(cè)定參照《飼料中鈣的測(cè)定》(GB/T 6436—2018)，采用高錳酸鉀法；磷含量的測(cè)定參照《飼料中總磷的測(cè)定 分光光度法》(GB/T 6437—2018)；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的測(cè)定參考Van Soest等[8]的方法，采用ANKOM纖維分析儀；pH用CT-6022型手持便攜式pH計(jì)測(cè)定；氨態(tài)氮(NH3-N)濃度的測(cè)定采用比色法[9]；菌體蛋白(BCP)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮蘭法[10]；原蟲數(shù)量的測(cè)定參考馮仰廉[11]的方法；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度的測(cè)定采用氣相色譜法[12]，以二乙基丁酸為內(nèi)標(biāo)，并計(jì)算總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度；產(chǎn)氣量采用ANKOM RFS體外產(chǎn)氣系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定；參考盧德勛[13]的計(jì)算方法，對(duì)單項(xiàng)組合效應(yīng)值(SFAEI)及MFAEI進(jìn)行計(jì)算，MFAEI是不同組合(處理)的各指標(biāo)SFAEI之和，SFAEI的計(jì)算公式如下式：

用染色序列對(duì)P進(jìn)行著色,實(shí)際上是對(duì)m(2n+1)+2n-1條邊進(jìn)行著色,而圖4中色集合的個(gè)數(shù)有個(gè),根據(jù)上述染色算法,當(dāng)k是奇數(shù)時(shí),有當(dāng)k是偶數(shù)時(shí),有因此恒成立,此時(shí)求得最小的整數(shù)k滿足?。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

由表3可知，添加不同劑量的諾麗果原粉均顯著降低了體外瘤胃發(fā)酵pH、NH3-N濃度和原蟲數(shù)量(P<0.05)；NF3組NH3-N濃度最低，顯著低于其他各組(P<0.05)；NF3組原蟲數(shù)量也最低，顯著低于NF1組(P<0.05)。隨諾麗果原粉添加劑量的增加，NH3-N濃度和原蟲數(shù)量均呈顯著的一次線性和二次曲線下降(P<0.05)，而pH也呈顯著的一次線性和二次曲線下降(P<0.05)。添加不同劑量的諾麗果原粉顯著提高了BCP濃度(P<0.05)；其中，NF3和NF4組BCP濃度顯著高于NF1組(P<0.05)；NF3組BCP濃度最高，顯著高于NF2組(P<0.05)。NF3和NF4組產(chǎn)氣量顯著高于CON組(P<0.05)，且以NF3組最高。隨諾麗果原粉添加劑量的增加，BCP濃度和產(chǎn)氣量均呈顯著的一次線性升高(P<0.05)。發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH、NH3-N濃度、BCP濃度、原蟲數(shù)量和產(chǎn)氣量均有顯著影響(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，pH呈下降趨勢(shì)；產(chǎn)氣量呈上升趨勢(shì)；NH3-N濃度、BCP濃度和原蟲數(shù)量則呈先升高再下降的趨勢(shì)，并在培養(yǎng)12 h達(dá)最高值。添加劑量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)原蟲數(shù)量有顯著影響(P<0.05)，培養(yǎng)3和6 h時(shí)各組原蟲數(shù)量較少，培養(yǎng)12 h時(shí)CON組的原蟲數(shù)量最多。

式中：m為各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(m=1，2，3，4，5)；n為培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的個(gè)數(shù)(n=5)；A1m為組合前(對(duì)照組)各單一指標(biāo)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值；A2m為組合后(試驗(yàn)組)各單一指標(biāo)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值。

由表4可知，NF2和NF3組乙酸濃度顯著高于CON組(P<0.05)，且以NF3組最高，顯著高于NF1和NF4組(P<0.05)；NF1～NF4組丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和TVFA濃度顯著高于CON組(P<0.05)，乙酸/丙酸顯著低于CON組(P<0.05)。NF3組丁酸、戊酸和TVFA濃度最高，其中，NF3組丁酸和TVFA濃度顯著高于其他組(P<0.05)，而戊酸濃度顯著高于NF1組(P<0.05)；NF2～NF4組異戊酸濃度顯著高于CON組(P<0.05)。隨著諾麗果原粉劑量的增加，乙酸和異丁酸濃度呈顯著的二次曲線升高(P<0.05)，乙酸/丙酸呈顯著的二次曲線下降(P<0.05)；戊酸和異戊酸濃度呈顯著的一次線性升高(P<0.05)，而丙酸、丁酸和TVFA濃度呈顯著的一次線性和二次曲線升高(P<0.05)。發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、TVFA濃度和乙酸/丙酸有顯著影響(P<0.05)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除乙酸/丙酸呈先下降、再趨于平緩、之后再下降的趨勢(shì)；其他指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)。添加劑量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)TVFA濃度有顯著影響(P<0.05)，培養(yǎng)24 h時(shí)NF3組的TVFA濃度最高，培養(yǎng)3 h時(shí)各組的TVFA濃度較低。

2 結(jié) 果

2.1 諾麗果原粉對(duì)體外瘤胃發(fā)酵pH、NH3-N濃度、BCP濃度、原蟲數(shù)量和產(chǎn)氣量的影響

使用SAS 8.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用MIXED模型進(jìn)行方差分析和回歸分析，混合模型包括諾麗果原粉的添加劑量、培養(yǎng)時(shí)間、添加劑量×培養(yǎng)時(shí)間的交互作用以及發(fā)酵瓶的隨機(jī)效應(yīng)。P<0.05表示差異顯著。

表3 諾麗果原粉對(duì)體外瘤胃發(fā)酵pH、NH3-N濃度、BCP濃度、原蟲數(shù)量和產(chǎn)氣量的影響

2.2 諾麗果原粉對(duì)瘤胃體外發(fā)酵VFA濃度的影響

3.死亡體重。據(jù)筆者的資料分析，仔豬初生重0.5 kg以下，哺乳期間死亡占死亡總數(shù)的80%以上，0.6～1.0 kg占13%，1.1 kg以上占6%?？梢?jiàn)，仔豬初生重越小，死亡率越高。

表4 諾麗果原粉對(duì)瘤胃體外發(fā)酵VFA濃度的影響

2.3 諾麗果原粉對(duì)瘤胃體外發(fā)酵MFAEI的影響

由表5可知，添加諾麗果原粉后，BCP濃度、TVFA濃度和產(chǎn)氣量的SFAEI均顯著升高(P<0.05)；且NF3和NF4組BCP濃度的SFAEI顯著高于NF1和NF2組(P<0.05)；而TVFA濃度和產(chǎn)氣量的SFAEI均以NF3組最高，且NF3組TVFA濃度的SFAEI顯著高于其他各組(P<0.05)，而產(chǎn)氣量的SFAEI顯著高于NF1和NF2組(P<0.05)。BCP濃度、TVFA濃度和產(chǎn)氣量的SFAEI均隨諾麗果原粉添加劑量的增加呈顯著的線性和二次曲線升高(P<0.05)。并且，NF1～NF4組的MFAEI顯著升高；以NF3組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；以NF4組次高，顯著高于NF1和NF2組(P<0.05)。MFAEI隨諾麗果原粉添加劑量的增加呈顯著的一次線性和二次曲線升高(P<0.05)。

表5 諾麗果原粉對(duì)瘤胃體外發(fā)酵MFAEI的影響

3 討 論

瘤胃液中的BCP濃度是綜合評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)利用效率及微生物種群數(shù)量的重要指標(biāo)，而NH3-N是合成BCP的主要氮源。因而在一定范圍內(nèi)NH3-N濃度的降低和BCP濃度的升高暗示著瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)合成效率的提高。所以，原蟲的存在增加了氮在瘤胃內(nèi)的周轉(zhuǎn)和消耗，去原蟲更有利于提高反芻動(dòng)物的氮利用效率[14]。合成優(yōu)質(zhì)BCP也需要適宜的pH維持瘤胃發(fā)酵穩(wěn)態(tài)，pH在6.0～7.0之間利于BCP的合成[15]。在本試驗(yàn)中，添加諾麗果原粉后pH雖下降，但仍在BCP合成的適宜范圍內(nèi)；而NH3-N濃度和原蟲數(shù)量的下降以及BCP濃度的增加，則表明添加諾麗果原粉可以促進(jìn)體外瘤胃發(fā)酵的氮降解并提高機(jī)體對(duì)氮的利用效率。關(guān)于本試驗(yàn)中諾麗果原粉的降原蟲數(shù)量功能，有研究表明每100 g成熟諾麗果中的皂苷含量約為236.0 mg[16]，且皂苷類物質(zhì)可通過(guò)破壞原蟲細(xì)胞膜殺死原蟲[17]，因而諾麗果原粉的降原蟲作用可能與其含有皂苷類物質(zhì)有關(guān)。

產(chǎn)氣量是間接評(píng)定飼料樣品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其在瘤胃內(nèi)發(fā)酵狀況的指標(biāo)[18]；而VFA是反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源，也是瘤胃微生物重要的碳架來(lái)源，其濃度與組成是反映瘤胃消化及其代謝能力的重要指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)中，產(chǎn)氣量和VFA濃度顯著升高，說(shuō)明添加諾麗果原粉可顯著促進(jìn)飼料樣品體外瘤胃發(fā)酵及其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝；而乙酸/丙酸顯著下降，則說(shuō)明諾麗果原粉可優(yōu)化VFA組成，提高能量利用效率，為BCP合成提供充足碳源。分析本試驗(yàn)中pH降低的原因，可能與諾麗果原粉中有機(jī)酸含量較高[20]或培養(yǎng)液中VFA濃度增加有關(guān)；也可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中原蟲數(shù)量的減少，致使原蟲因儲(chǔ)存淀粉而穩(wěn)定pH的作用減弱[21]，進(jìn)而導(dǎo)致體外發(fā)酵pH的下降。諾麗果促進(jìn)瘤胃發(fā)酵的機(jī)理尚不清楚，這可能與諾麗果中含有多糖、酚類等活性物質(zhì)有關(guān)[22]。目前尚未見(jiàn)這方面的研究報(bào)道，但關(guān)于其他多糖的體內(nèi)外研究表明，黃芪多糖[23]、苦瓜多糖[24]、香菇多糖或木聚糖[25]等均可促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。因而，可能是諾麗果多糖調(diào)控了瘤胃微生物多樣性及其代謝產(chǎn)物，進(jìn)而影響了瘤胃發(fā)酵，需要進(jìn)一步研究探討。

MFAEI可反映飼料間的整體互作，其數(shù)值越大，對(duì)應(yīng)的飼料組合越有利于瘤胃發(fā)酵以及營(yíng)養(yǎng)組分的利用。因此，可利用MFAEI判斷飼料的適宜配比。本試驗(yàn)的各指標(biāo)回歸分析結(jié)果表明，隨諾麗果原粉添加劑量的增加，pH、BCP濃度、產(chǎn)氣量和異戊酸濃度呈顯著的一次線性變化趨勢(shì)，其他指標(biāo)呈顯著的二次曲線劑量依賴效應(yīng)，且極值均出現(xiàn)在NF3組。雖然MFAEI的一次線性和二次曲線升高趨勢(shì)均顯著，但以NF3組最高，NF4組次高，且二者差異顯著。這說(shuō)明諾麗果原粉的添加劑量為3.5%時(shí)，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵的效果較好，而當(dāng)添加劑量增至5.0%時(shí)，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵的效果減弱。MFAEI對(duì)諾麗果添加劑量的二次曲線響應(yīng)是可以預(yù)見(jiàn)的，因?yàn)楦邉┝康闹Z麗果所具有的抗菌性更強(qiáng)，因而可能會(huì)使其促瘤胃發(fā)酵作用減弱。類似的，無(wú)籽諾麗果渣在體外發(fā)酵中促TVFA生成的作用與其添加劑量呈顯著的二次曲線升高趨勢(shì)，最佳添加劑量為10%～15%，而添加20%～25%時(shí)TVFA濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異[5]。飼糧中添加沙棘果渣可促進(jìn)體外瘤胃發(fā)酵，但添加24%時(shí)的TVFA濃度顯著低于添加16%時(shí)[26]。目前，關(guān)于諾麗果促進(jìn)瘤胃發(fā)酵的機(jī)理尚不清楚，今后需進(jìn)一步從其多糖、酚類物質(zhì)等方面，研究諾麗果促瘤胃發(fā)酵的功效物質(zhì)，并結(jié)合微生物多樣性等多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)深入探究諾麗果促瘤胃發(fā)酵的機(jī)理。

4 結(jié) 論

飼糧中添加諾麗果原粉可促進(jìn)阿爾巴斯白絨山羊的體外瘤胃發(fā)酵功能，并降低原蟲數(shù)量，且均在添加劑量為3.5%時(shí)效果較好。