竹節(jié)香附素A 對(duì)肝缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用機(jī)制

李洪波，黃 銳，代 將，鐘振東

（1. 四川省廣漢市人民醫(yī)院外二科，廣漢 618300；2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽外科，成都 610007；3. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院急救中心，成都 610007；4. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院動(dòng)物研究中心，成都 610007）

近年來(lái)，肝病發(fā)病率逐年上升。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上多達(dá)2 5% 的人口有肝病，主要誘發(fā)類型包括病毒性感染、酗酒和非酒精性脂肪肝[1]。肝病后期的主要治療手段是肝臟手術(shù)或肝移植手術(shù)，而肝缺血再灌注（hepatic ischemia reperfusion，HIR）則是手術(shù)必要環(huán)節(jié)。目前，肝缺血再灌注的主要損傷為缺氧造成的器官損傷、炎性反應(yīng)、細(xì)胞過(guò)度凋亡和基因突變等，因此，如何預(yù)防與治療此類損傷已經(jīng)是全球性課題[2]。

竹節(jié)香附素A（raddeanin A, RA）是從?？刑崛〉膴A竹桃型三萜皂苷[3]。研究發(fā)現(xiàn)RA對(duì)人類肝癌細(xì)胞具有抗增殖[3]、促凋亡、抑制遷移與侵襲的效果。另外，RA 已被證實(shí)能通過(guò)抑制核因子-κB 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，引起結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[4]，但至今未見(jiàn)RA 在預(yù)防肝缺血再灌注損傷中的相關(guān)報(bào)道。此外，RA 參與PI3K/AKT/mTOR 通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[4]，提示RA能在細(xì)胞凋亡通路中起調(diào)節(jié)作用，可能是預(yù)防肝缺血再灌注后肝細(xì)胞過(guò)度凋亡的一個(gè)潛在化合物。因此，本實(shí)驗(yàn)從氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面探討RA 對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為260±20 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK（川）2015-030]，飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西醫(yī)院[SYXK(川)2018-119]。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)（編號(hào)2020280A）。

1.2 藥物、試劑和儀器

RA 純度≥98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：20190203）。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、TUNEL 測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、β-肌動(dòng)蛋白（βactin）一抗和羊抗兔二抗均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）、切片機(jī)（德國(guó)Le i c a 公司）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）、蛋白質(zhì)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）、全功能成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠肝缺血再灌注模型構(gòu)建[5]

將30只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成3組，即模型組、假手術(shù)組與RA 組，每組10 只。RA 組手術(shù)前24 h 與1 h 分別經(jīng)尾靜脈注射RA（10 mg/kg），模型組與假手術(shù)組同法注射等體積的0.9% NaCl溶液（生理鹽水）。最后一次預(yù)處理完畢后1 h，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥（40 mg/kg），于上腹正中做長(zhǎng)約4 cm 切口打開腹腔，暴露肝臟且游離肝周韌帶。模型組與RA 組用無(wú)損傷血管夾夾閉肝左葉和肝中葉入肝血管阻斷血流（70%肝臟缺血）60 min 后，松開血管夾恢復(fù)血流。假手術(shù)組僅游離肝門而不阻斷血流。再灌注6h 后，從下腔靜脈采血用于丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（A S T）、乳酸脫氫酶（L D H）的檢測(cè)；采集左葉肝臟在－80℃下儲(chǔ)存，用于炎性因子、氧化應(yīng)激因子和凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)；右葉肝臟儲(chǔ)存在4% 的多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色與TUNEL 染色病理學(xué)觀察。

1.3.2 血清中ALT、AST、LDH 含量的檢測(cè)

收集下腔靜脈血1 mL，以3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用全自動(dòng)血液生化儀測(cè)定各組血清中ALT、AST 和LDH 的水平。

1.3.3 肝臟中IL-1β、IL-6、TNF-α 及SOD、MDA含量的檢測(cè)

將左葉肝臟制備10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定肝臟中IL-1β、IL-6、TNF-α 及SOD、MDA 的含量。

1.3.4 肝臟形態(tài)學(xué)分析

所有組織病理學(xué)檢查均采用“雙盲法”。將固定好的各組肝臟標(biāo)本用石蠟包埋后分別使用HE染色，在400 倍下進(jìn)行組織學(xué)分析，評(píng)價(jià)肝臟組織被膜、肝索、中央靜脈和核膜等的損傷情況。

1.3.5 肝細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

各組肝臟標(biāo)本用石蠟包埋、切片后，按照TUNEL染色試劑盒進(jìn)行染色操作，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，按每100 個(gè)細(xì)胞中含凋亡細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

將左葉肝臟取出，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品（20μg）使用10 % SDS-PAGE進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉將膜封閉60 min，然后加入下列一抗在4 ℃條件下過(guò)夜孵育：兔抗大鼠B a x（1 ∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2（1∶1 000）、兔抗大鼠Caspase-3（1∶1 000）、兔抗大鼠β-actin（1∶1 000）。使用TBST 將膜清洗干凈后，加入羊抗兔IgG（1∶1 0000），室溫孵育2 h，最后使用ECL試劑盒曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 RA 預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟功能的保護(hù)作用

再灌注6 h 后，與假手術(shù)組相比，模型組與RA 組血清中ALT、AST 與LDH 含量明顯增高（P＜0.01）。與模型組相比，RA 組血清中ALT、AST 與LDH 的含量明顯減少（P＜0.01）（表1）。

2.2 RA 預(yù)處理對(duì)大鼠炎性因子的影響

再灌注6 h 后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量明顯增多（P＜0.01）；與模型組相比，RA 組肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量明顯減少（P＜0.05）（表2）。

2.3 RA 預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激因子的影響

再灌注6 h 后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝臟中SOD 含量明顯降低，MDA 含量明顯增多（均P＜0.0 5）；與模型組相比，R A 組肝臟中SOD 含量明顯增多，MDA 明顯減少（均P＜0.05）（表3）。

表 1 3 組大鼠血清中ALT、AST、LDH 含量Table 1 Serum ALT, AST and LDH contents in the three groups of rats( ± s, n=10)

表 1 3 組大鼠血清中ALT、AST、LDH 含量Table 1 Serum ALT, AST and LDH contents in the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，##P ＜0.01。

組 別 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1) LDH/(U·L-1)假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組45.83±5.95 199.50±15.24**129.87±14.88##110.67±5.68 203.67±11.02**166.67±6.72##791.53±21.33 1717.57±75.74**1347.23±34.36##

表 2 3 組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量Table 2 IL-1β, IL-6 and TNF-α contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 2 3 組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量Table 2 IL-1β, IL-6 and TNF-α contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，##P ＜0.01。

組 別 IL-1β/(ng·L-1) IL-6/(ng·L-1) TNF-α/(ng·L-1)假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組4.55±0.21 5.28±0.14**4.82±0.16##3.58±0.11 3.99±0.13**3.70±0.10##35.96±1.47 40.36±0.66**37.99±0.30##

表 3 3 組大鼠肝臟中SOD 和MDA 含量Table 3 SOD and MDA contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 3 3 組大鼠肝臟中SOD 和MDA 含量Table 3 SOD and MDA contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05。

組 別 SOD/(ng·L-1) MDA/(ng·L-1)假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組22.97±1.08 20.47±0.14*21.13±0.32#0.73±0.02 0.84±0.02**0.79±0.02#

2.4 RA 預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響

HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組肝臟組織均為正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯的纖維組織增生及炎性滲出（圖1A）。模型組肝臟被膜完整，肝索排列紊亂；大量肝細(xì)胞空泡變性或壞死，可見(jiàn)細(xì)胞明顯腫脹變形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡，細(xì)胞核多被擠于一側(cè)，部分細(xì)胞核固縮或溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊；門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯病理改變（圖1B）。RA 組肝臟被膜完整，肝索排列較為整齊，肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，偶見(jiàn)少量肝細(xì)胞呈點(diǎn)狀壞死，并伴少量中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯病理改變（圖1 C）。

圖 1 3組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 (HE染色)Figure 1 Observation on pathological morphology of the liver in the three groups of rats (HE staining)

圖 2 3組大鼠肝細(xì)胞凋亡觀察 (TUNEL染色)Figure 2 Observation on apoptosis of hepatocytes of the three groups of rats (TUNEL staining)

2.5 RA 預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 法結(jié)果顯示，假手術(shù)組細(xì)胞核多數(shù)呈藍(lán)色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，凋亡細(xì)胞較少（圖2A）；模型組大部分細(xì)胞核呈黃色，說(shuō)明細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，凋亡細(xì)胞大量生成（圖2B）；RA組細(xì)胞核大部分呈藍(lán)色，部分細(xì)胞核呈黃色，說(shuō)明出現(xiàn)部分凋亡細(xì)胞（圖2C）。與假手術(shù)組相比，模型組和RA 組肝臟細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，RA 組肝臟細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.0 1）（表4）。

2.6 RA 預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟凋亡蛋白的影響

與假手術(shù)組相比，模型組與RA 組中Bax 與Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，RA 組中Bax 與Caspase-3 的表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）（表5，圖3）。

表 4 3 組大鼠肝細(xì)胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of hepatocytes in the three groups of rats( ± s, n=10)

表 4 3 組大鼠肝細(xì)胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of hepatocytes in the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，##P ＜0.01。

組 別 凋亡率/%假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組0.02±0.04 16.15±0.33**6.62±0.99##

表 5 3 組大鼠肝臟中Bax、Bcl-2 和Caspase-3 表達(dá)Table 5 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 5 3 組大鼠肝臟中Bax、Bcl-2 和Caspase-3 表達(dá)Table 5 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P<0.01。

組 別 Bax Bcl-2 Caspase-3假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組1.00±0.00 2.43±0.33**1.81±0.11##1.00±0.00 0.54±0.12**0.77±0.14#1.00±0.00 1.61±0.17**1.23±0.05##

圖 3 3 組大鼠肝臟中Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達(dá)Figure 3 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats

3 討論

肝缺血再灌注損傷最主要的特征是肝損傷，而肝功能檢測(cè)是目前肝損傷檢測(cè)最快捷方便的一個(gè)方法，其最常見(jiàn)的檢測(cè)指標(biāo)為血清中的ALT、AST和LDH。肝損傷的主要表現(xiàn)是血清中ALT和AST 的水平異常升高[6-7]。本研究結(jié)果顯示，RA 能有效降低肝缺血再灌注后肝細(xì)胞中ALT與AST的水平，同時(shí)能降低血清中LDH 的水平（P＜0.01），說(shuō)明模型制備成功，而且RA 能預(yù)防肝缺血再灌注后肝細(xì)胞的損傷。

氧化應(yīng)激平衡在缺血過(guò)程中起關(guān)鍵作用，失衡會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[8]，主要原因是缺血導(dǎo)致組織缺氧，形成大量氧自由基，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用[9-10]。目前檢測(cè)氧化應(yīng)激平衡的常用指標(biāo)為SOD 與MDA。本研究結(jié)果表明，肝缺血再灌注前使用RA 預(yù)防給藥，能明顯降低肝組織中MDA的含量，提高SOD 的水平（P＜0.05），說(shuō)明RA 能預(yù)防肝缺血再灌注帶來(lái)的氧化應(yīng)激失衡。有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中的巨噬細(xì)胞會(huì)在再灌注后產(chǎn)生大量的炎性因子與趨化因子，調(diào)節(jié)與激活一系列的炎性機(jī)制，造成炎性反應(yīng)，損傷肝細(xì)胞[11]，最終引起細(xì)胞死亡和組織壞死[12]。同時(shí)，再灌注早期主要的損傷是由促炎因子與細(xì)胞因子造成，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)前使用RA 預(yù)防后，肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著降低（P ＜0.05），阻止了肝組織氧化應(yīng)激失衡，同時(shí)減輕了炎性因子對(duì)肝臟的損傷。

病理學(xué)觀察是評(píng)價(jià)器官病變的重要手段之一，能直觀地反映器官組織的狀態(tài)。對(duì)肝臟進(jìn)行病理學(xué)形態(tài)觀察也發(fā)現(xiàn)，HE 染色后，RA 組肝臟組織的細(xì)胞核腫脹程度與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空白均明顯減少，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)也恢復(fù)整齊，證明RA 可以預(yù)防肝缺血再灌注后的損傷。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞死亡方式。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟再灌注會(huì)激活相關(guān)凋亡通路，誘導(dǎo)正?；蚴軗p的肝細(xì)胞死亡[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA 組中肝細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯減少，細(xì)胞凋亡率也明顯降低（P ＜0.01）；RA 組凋亡通路中Bax 和Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 的表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05），結(jié)果表明，RA 在作用正常肝細(xì)胞時(shí)，體現(xiàn)的藥理作用主要以抗炎抗氧化為主，通過(guò)減少肝臟組織中氧化應(yīng)激與炎性因子的水平間接避免肝臟細(xì)胞受損，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡減少的狀態(tài)。綜合兩部分結(jié)果，RA 的預(yù)防給藥能減輕肝臟的病變，減少肝細(xì)胞的凋亡數(shù)量，其作用機(jī)制可能是降低Bax 和Caspase-3 的表達(dá)，以及增加Bcl-2 的表達(dá)。

缺血再灌注是一種復(fù)雜的病理生理現(xiàn)象，是一個(gè)包括局部缺血損傷與再灌注損傷的動(dòng)態(tài)過(guò)程[15]，涉及代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。所以，探討缺血再灌注損傷的確切機(jī)制對(duì)減輕手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和改善患者預(yù)后具有重要意義。RA 作為一種中藥有效提取成分，提取方法簡(jiǎn)單，成本低廉且獲取方式多，不良反應(yīng)少，是一種非常好的治療藥物。RA 在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗腫瘤的作用，對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)與抗炎作用，不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠術(shù)前注射RA，研究發(fā)現(xiàn)其有預(yù)防肝缺血再灌注損傷的效果，表現(xiàn)為提升肝功能、降低氧化損傷、減少炎性因子的釋放，以及減少肝細(xì)胞凋亡，其作用途徑可能與Bax/Bcl-2/Caspase-3 凋亡通路相關(guān)。