腹膜透析濾出液外泌體miR-200a 在不同腹膜轉運特性患者中的表達差異及其生物學功能預測

佟 琰，方均燕，鄧 海，宋阿會，李 璞，劉英莉

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院腎內科，上海200011

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）利用人體自身的腹膜作為透析膜，清除體內的毒素和過多的水分［1］。溶質通過腹膜的速度，即腹膜溶質轉運率（peritoneal solute transport rate，PSTR），是評價腹膜性能的重要指標。臨床上常通過腹膜平衡試驗（peritoneal equilibrium test，PET）對PSTR 進行評估，按照4 h 腹膜透析濾出液/血漿肌酐濃度比值（4h D/PCr）數(shù)值分為高轉運（0.82～1.03）、高平均轉運（0.65～0.81）、低平均轉運（0.50～0.64）和低轉運（0.34～0.49）［2-3］。腹膜高轉運狀態(tài)的患者容量清除較差，更容易出現(xiàn)水鈉潴留、超濾衰竭和腹膜纖維化等PD 相關并發(fā)癥［4-5］。上皮細胞的間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腹膜纖維化形成的重要病理生理過程［6］。在一項PD 大鼠動物模型的研究［7-8］中發(fā)現(xiàn)，腹膜纖維化早期miR-200a 的表達減少，并且miR-200a 可以通過靶向E 盒結合鋅指蛋白1/2 （zinc finger E-box-binding homeobox 1/2，ZEB1/2）負向調節(jié)轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）誘導的EMT。腹膜高轉運狀態(tài)與腹膜纖維化直接相關，而miR-200a 作為與腹膜纖維化顯著相關的miRNA，其與腹膜高轉運狀態(tài)之間的關系尚未見報道。

外泌體是一類直徑為30～150 nm的細胞外囊泡，內含蛋白質、RNA和脂質等成分，電子顯微鏡下觀察呈杯狀。外泌體可由多種細胞分泌，也存在于多種體液中，如血液或尿液。腹膜透析濾出液（peritoneal dialysis effluent，PDE）是PD 患者獨特的臨床樣本，取材簡便，標本易得。許多研究發(fā)現(xiàn)PDE 中的白介素-6 （interleukin-6，IL-6）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 單 核 細 胞 趨 化 蛋 白1 （monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）和基質金屬蛋白酶2（matrix metallop roteindse 2，MMP2）等細胞因子［9-11］，胰脂肪酶［12］及一些miRNA 可能與腹膜高轉運狀態(tài)相關。另有研究［13-14］發(fā)現(xiàn)直接從PDE 或PDE 離心后所得沉淀中提取到的細胞內miRNA 也與腹膜轉運特性相關。本研究不同于既往研究，所提取的PDE 外泌體miRNA 主要為細胞外miRNA，外泌體雙層磷脂膜結構的包裹使其較游離miRNA更穩(wěn)定，且可發(fā)揮信息傳遞的作用。

本研究通過提取PDE 中的外泌體miRNA，比較外泌體miR-200a 在不同腹膜轉運特性患者中的表達差異，探索其是否與腹膜轉運特性相關，是否能成為監(jiān)測腹膜狀態(tài)改變的一種新型分子標志物，并利用生物信息學分析預測miR-200a及其靶基因影響腹膜轉運特性的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本收集

選取于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院行維持性PD 的患者，透析方案均為持續(xù)性不臥床腹膜透析，夜間留腹6～10 h，日間留腹方案可不同?；颊吣挲g18～80 歲，連續(xù)3 次PET 值提示其轉運特性為穩(wěn)定的高轉運/高平均轉運或低轉運/低平均轉運；據此將患者分為H 組（高轉運/高平均轉運）和L 組（低轉運/低平均轉運）。近3 個月內發(fā)生過腹膜炎或其他部位感染者、惡性腫瘤患者、有肝炎或結核病史的患者及自身免疫疾病患者均不予納入研究。最后，納入H 組和L 組各10 例患者，收集這些患者的基本臨床資料。本研究于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院科研倫理審查委員會備案（審批號SH9H-2020-T23-1）。

1.2 外泌體的提取

收集PD 患者行PET 前1 d 留腹過夜的PDE 500 mL，經截留相對分子質量為10 000 的再生纖維素膜在超濾杯（Millipore，美國） 中濃縮至40 mL；于2 500×g 離心15 min 去除濃縮液中的細胞碎片后，18 000×g 高速離心30 min；0.22 μm 孔徑濾器過濾，去除上清液中的大分子物質；在超速離心機中（Beckman，美國）120 000×g 離心2 h，加入PBS再次120 000×g離心清洗2 h后棄去上清液；用200 μL PBS 重懸，得到外泌體。所有離心過程均于4 ℃下進行。外泌體提取后立即提取miRNA 或保存于-80 ℃。

1.3 外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（FEI，美國）用于觀察外泌體的形態(tài)和大小。納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）系統(tǒng)（PMX，德國）用于分析外泌體的粒徑和濃度。Western blotting檢測外泌體表面標志蛋白CD9和CD63。

1.4 Western blotting檢測蛋白CD9和CD63

10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；5%牛奶封閉2 h 后，抗CD9和抗CD63（1∶1 000，SBI，美國）抗體4 ℃孵育過夜；二抗（1∶5 000，proteintech，美國）室溫孵育1 h；滴加ECL顯影液后在化學發(fā)光顯影儀下顯影。

1.5 外泌體miRNA提取

用miRNeasy（Qiagen，德國）提取外泌體miRNA；在外泌體中加入5 倍體積的TRIzol、3.5 μL 外參cel-miR-39，以及與外泌體等體積氯仿；4 ℃下12 000×g 離心15 min，取上清液加入1.5倍體積100%乙醇；所得混合液經過RNeasy spin column 12 000×g 反復離心洗滌；用去RNA酶水洗脫膜上的RNA，將所得RNA進行定量。

1.6 實時熒光定量PCR檢測外泌體miR-200a的表達

采用miDETECT A TrackTMmiRNA 試劑盒（廣州銳博，中國）將外泌體miRNA 經過加polyA 尾反轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測。PCR擴增條件：預變性95 ℃10 min；變性95 ℃2 s，退火60 ℃20 s，延伸70 ℃10 s，重復40 個循環(huán)。以miR-39為外參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

1.7 靶基因預測及功能富集

使用在線數(shù)據庫Targetscan、miRmap 和miRWalk 進行miRNA 的靶基因預測分析。采用String 數(shù)據庫（https：//string-db.org/）預測相關蛋白，采用Cytoscape 軟件將蛋白間相互作用關系（protein-protein interaction，PPI）進行可視化，采用MCODE 插件將其進行模塊化。采用DAVID 數(shù)據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行靶基因功能富集（gene ontology，GO）分析，RStudio 軟件作圖。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料用x±s 表示，組間比較采用t 檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。定性資料組間比較采用Fisher 確切概率法。相關性分析采用Spearman 秩相關分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDE外泌體的鑒定

通過超速離心法得到的濃縮后PDE 中的外泌體，在TEM 下呈圓形雙層膜包裹的囊泡結構（圖1A）；NTA 檢測多數(shù)囊泡直徑介于50～150 nm （圖1B）；Western blotting 結果顯示其具有外泌體表面標志物CD9 和CD63（圖1C）。

圖1 PDE外泌體的鑒定Fig 1 Identification of PDE exosomes

2.2 miR-200a在2組PDE外泌體中的表達差異

20 例患者的基本信息見表1。H 組和L 組患者男女比例、年齡、透析齡、估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、尿素清除指數(shù)（Kt/V）比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。2 組PET 值比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。以miR-39為外參，RT-qPCR 結果顯示（圖2）：L 組PDE 外泌體miR-200a 的表達水平高于H組，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。

2.3 miR-200a與PET值、4 h超濾量和24 h超濾量的相關性

將PET 結束時的超濾量作為4 h 超濾量，患者行PET前24 h 內的總超濾量作為24 h 超濾量。對H 組和L 組miR-200a 的相對表達量分別與PET 值、4 h 和24 h 超濾量進行相關性分析，結果（圖3）顯示：PDE 外泌體miR-200a/miR-39 與PET 值呈負相關（r=-0.871，P=0.000），與4 h 超濾量呈正相關（r=0.448，P=0.048），但其與24 h超濾量無相關性（r=0.355，P=0.125）。

表1 PD患者的臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of PD patients

圖2 2組PDE外泌體miR-200a表達水平的比較Fig 2 Comparison of expression of PDE exosomal miR-200a between the two groups

2.4 miR-200a靶基因預測及分析

通過Targetscan、miRmap 和miRWalk 3 種miRNA 靶基因在線預測數(shù)據庫共同預測到的miR-200a 靶基因有679 種（圖4A）。選取參與EMT 相關的GO 功能——GO 0002053 正向調節(jié)間充質細胞增殖的靶基因，發(fā)現(xiàn)有6 種基因富集在此生物過程中，分別為矮小同源盒基因（short stature homeobox 2， SHOX2）、 WNT 家 族5A（WNT family member 5A，WNT5A）、成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1， FGFR1）、轉化生長因子βⅡ型受體（transforming growth factor β receptor 2，TGFBR2）、腫瘤蛋白p63（tumor protein p63，TP63）、叉頭框蛋白P1（forkhead box P1，F(xiàn)OXP1）；再利用String 數(shù)據庫構建EMT 相關靶基因表達的蛋白與其他蛋白之間的PPI；最后使用Cytoscape軟件的MCODE功能進行模塊分析。結果顯示，2 個靶基因聚集在模塊中，參與纖維化過程的發(fā)生和進展（圖4B）。

圖3 PDE外泌體miR-200a與PET值、4 h和24 h超濾量的相關性分析Fig 3 Correlation analysis between PDE exosomal miR-200a and PET values,4 h and 24 h ultrafiltration volume

圖4 miR-200a潛在靶基因預測及EMT相關靶基因表達蛋白的PPI模塊Fig 4 Prediction of target genes of miR-200a and PPI modules of EMT-related target genes expressing proteins

2.5 miR-200a靶基因功能分析

為進一步研究miR-200a 在PD 中的作用，將679 個靶基因輸入到DAVID 數(shù)據庫中進行GO 分析（P＜0.05），包括 分 子 功 能（molecular function， MF）、 細 胞 組 分（cellular component， CC）、 生 物 學 過 程（biological process，BP）3 個部分（圖5）。結果顯示：miR-200a 的靶基因參與了許多重要的細胞組分；其參與的生物學過程不僅包括正向調控間充質細胞增殖，同時也能正向調控內皮細胞遷移，并參與調控凋亡過程和蛋白磷酸化；分子功能方面顯示其可能影響ATP、DNA 和mRNA 等的結合過程，在金屬離子結合方面也有一定的富集。值得注意的是，溶質載體（solute carrier，SLC）家族中有多種蛋白的編碼基因均為miR-200a 的靶基因。SLC 家族為典型的跨膜蛋白，負責氨基酸、核苷酸、葡萄糖、無機離子和藥物等物質的吸收和運輸［15-17］，如SLC9A5［也稱為鈉氫轉運體5（NHE5）］、SLC10A1 為鈉/膽汁酸協(xié)同轉運蛋白，SLC17A4 為鈉/磷酸鹽共轉運蛋白。此外，編碼鈉離子電壓門控通道（sodium voltage-gate channel，SCN）亞基蛋白也可能為miR-200a 的靶點。由此推測，miR-200a 除影響EMT 或細胞凋亡等過程外，還可能通過調控離子結合、離子轉運，影響各種離子、小分子等溶質轉運，從而參與腹膜高轉運狀態(tài)的發(fā)生過程。

圖5 miR-200a靶基因的GO富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of miR-200a target genes

3 討論

PD 是終末期腎臟?。╡nd-stage renal disease，ESRD）患者的主要腎臟替代治療方法之一，具有血流動力學穩(wěn)定、中分子清除效率好、居家治療安全方便等優(yōu)點。PD患者的中期（至少5年）生存率基本等同于血液透析患者的生存率［18］。雖然PD 技術在不斷發(fā)展和改進，但是腹膜形態(tài)和功能的改變仍會導致患者出現(xiàn)一些并發(fā)癥，影響患者的透析質量。腹膜高轉運狀態(tài)與腹膜纖維化、超濾衰竭和技術失敗密切相關［5］，因此及時有效地獲得腹膜轉運特性的信息對早期預防和診斷相關并發(fā)癥具有重要意義。

外泌體是由細胞分泌的特異性囊泡，參與細胞間通信，發(fā)揮多種功能［19］。利用來自血液或尿液的外泌體miRNA 作為診斷疾病的生物標志，也是“液體活檢”的一種新興方法，但很少有研究報道PDE 中的外泌體及其組成。2017 年，Carreras-Planella 等［20］首次報道了PDE中細胞外囊泡的存在并予以分離；隨后相關研究［21］通過多種方法，如差速離心、排阻色譜法以及納米顆粒跟蹤分析等證實這些囊泡大多數(shù)為外泌體。本研究將濃縮后的PDE 進行超速離心，并利用TEM、NTA 和Western blotting等方法鑒定，成功提取到了PDE來源的外泌體。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a 可能通過調節(jié)SIRT1/Notch1 信號 通 路［22］以 及miR-200a/Smad7/TGF- β1/EMT/MAPK軸［23］參與抗肝臟纖維化的過程，也可通過抑制ZEB1/2改善腹膜纖維化［7-8］，但未發(fā)現(xiàn)miR-200a與腹膜高轉運狀態(tài)相關。本實驗將20 例PD 患者按照PET 值分為H 組和L 組，提取PDE 外泌體miRNA，結果發(fā)現(xiàn)外泌體miR-200a 在L 組的相對表達量較高，并且其表達量與PET 值呈一定程度的負相關關系，與4 h 超濾量呈正相關關系，但與24 h超濾量并無相關性。

Targetscan 是最常用的miRNA 靶基因預測數(shù)據庫之一，提供多物種信息，通過與miRNA 種子區(qū)域匹配的保守的8mer 和7mer 位點來預測靶基因。miRWalk 記錄了基因全長序列上的miRNA 結合位點，也將其與已有的12個miRNA靶標預測程序的預測信息進行結合關聯(lián)。miRmap將涵蓋11 種預測特征的4 種方法集合在一個模型中，預測能力較強。為避免預測假陽性，本研究同時使用3個數(shù)據庫，對其共同預測到的基因交集進行分析。在對預測到的miR-200a 靶基因進行GO 分析后，本研究選取EMT相關的GO 功能組，對6 個靶基因表達蛋白進行PPI 模塊分析，發(fā)現(xiàn)FGFR1 和TGFBR2 主要聚集在2 個模塊，通過參與相關信號通路促進間充質細胞增殖，從而促進纖維化。此外，對miR-200a 的GO 分析結果也顯示，其靶基因在組成細胞成分、調控凋亡過程以及參與ATP、DNA、mRNA和金屬離子結合方面有一定富集。

本研究成功提取并鑒定了PDE 來源外泌體，探究了PDE 外泌體miR-200a 與轉運特性的關系，也對miR-200a進行了靶基因預測和GO富集分析；發(fā)現(xiàn)其靶基因中有許多SLC 家族蛋白，可能在離子結合、離子和溶質轉運等方面具有一定的調控功能。本研究為探討miRNA 如何影響腹膜轉運特性的機制問題提供了新思路。但本研究只選取了20 例PD 患者，樣本量較少，具有一定的局限性。首先，本研究未觀察到miR-200a 的相對表達量與24 h 超濾量的相關性；分析原因可能為影響24 h 超濾量的因素較多，如PD 方案、患者殘腎功能和24 h 尿量。若要證明PDE 外泌體miR-200a 可成為判斷腹膜轉運特性的標志物及其與24 h 超濾量的關系，需要多中心、大樣本的研究進行驗證。其次，本研究沒有確定PDE 外泌體的來源。腹膜組織主要由間皮細胞組成，腹膜腔內也有一些免疫細胞，如巨噬細胞、淋巴細胞等［24］；因此，PDE 外泌體可能由多種細胞分泌，可進一步檢測外泌體表面蛋白，鑒別其具體來源。再次，我們只選取了miR-200a 作為目標miRNA，還有一些參與多種功能調控的miRNA，如miR-21，值得在后續(xù)實驗中進一步討論。最后，我們通過生物信息學分析，認為miR-200a 可能通過調控SLC 家族影響離子結合或離子轉運，但未進行實驗驗證，相關分子機制和信號通路仍需深入研究。

綜上所述，本研究通過提取PDE 外泌體，比較外泌體miR-200a 在不同腹膜轉運特性患者PDE 中的表達，發(fā)現(xiàn)轉運特性較低的患者PDE 外泌體miR-200a 的相對表達量較高，并且miR-200a的相對表達量與PET值呈負相關，與4 h 超濾量呈正相關；但其與24 h 超濾量是否相關，是否影響離子結合及相關作用機制需要更多實驗進一步探討。