伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

楊卓一，陳 會，白思益，帕梅拉·帕爾哈提，侯敬麗，袁運(yùn)生

1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞工程及抗體藥物教育部研究工程中心，上海200240；2.上海交通大學(xué)分析測試中心，上海200240

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（post translational modifications，PTM）廣泛存在所有生物體內(nèi)。人和動物體內(nèi)的蛋白翻譯后修飾，如蛋白的糖基化、泛素化、乙?；土姿峄葘τ谡{(diào)控蛋白質(zhì)的功能、活性和穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要的作用［1］。其中，蛋白的磷酸化修飾是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白翻譯后修飾之一，通過體內(nèi)的蛋白激酶和蛋白去磷酸化酶系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控；蛋白磷酸化水平的改變直接影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的功能，并參與調(diào)控功能蛋白的泛素化修飾來間接調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［2-3］。在人和動物體內(nèi)，蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸是最常見的磷酸化氨基酸，細(xì)胞中它們各自被磷酸化的比例分別為84%、15%、＜1%［4］。肝臟是人體能量代謝、維持生命活動的重要器官［5］，已有文獻(xiàn)［6］報道蛋白質(zhì)磷酸化修飾在影響肝功能、肝細(xì)胞再生以及肝細(xì)胞癌方面具有重要作用。酪氨酸磷酸化在肝再生中對細(xì)胞內(nèi)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)；肝部分切除（partial hepatectomy，PH）后，雷帕霉素可降低肝增殖速率［7］、增加肝細(xì)胞凋亡的速率［8］；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/protein-serine-threonine kinase，PI3K/AKT）途徑在肝癌中被廣泛研究。上述這些都說明蛋白質(zhì)磷酸化修飾在肝病研究中的重要意義。

小鼠靜脈內(nèi)注射植物凝集素伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）是廣泛使用的急性免疫介導(dǎo)的肝炎模型［9］，ConA 可以通過激活T 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)特定的急性肝損傷。由于T 細(xì)胞免疫［10-11］的參與，且與人類自身免疫性肝炎的相似性，該模型也被認(rèn)為是人類自身免疫性肝炎的良好模型。近年來已有很多研究者采用ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型對肝細(xì)胞再生等進(jìn)行研究，但ConA 誘導(dǎo)的肝損傷模型的蛋白質(zhì)磷酸化組學(xué)研究還未見報道。本研究建立ConA 誘導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12 細(xì)胞的損傷模型，通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用的方式，采用非標(biāo)定量法檢測模型細(xì)胞中發(fā)生磷酸化修飾的蛋白，并尋找差異性調(diào)控的磷酸化修飾位點(diǎn)，以期為肝臟疾病的研究提供相關(guān)通路以及靶標(biāo)信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠正常肝細(xì)胞AML12細(xì)胞株（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。DME/F12細(xì)胞培養(yǎng)基（HyClone，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco，美國）。尿素、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、丙酮、脫氧膽酸鈉（Na-deoxycholate）、3-［（3-膽酰胺丙基）‐二甲氨基］‐丙磺酸｛3?［（3-cholamidopropyl）?dimethylammonio］-1-propanesulfonate，CHAPS｝ 均購自美國Sigma 公司。甲酸、乙腈、C18 微量層析柱（Thermo Fisher Scientific，美國）。支原體檢測試劑盒（南京諾唯贊，中國），Bradford蛋白定量試劑盒（上海碧云天，中國），10 kD 超濾離心管（Sartorius，德國），胰蛋白酶（Promega，美國），二氧化鈦（島津，日本），脫氧膽酸鈉（上海麥克林，中國），硒酸鈉（中國醫(yī)藥集團(tuán)，中國），轉(zhuǎn)鐵蛋白（上海源葉，中國），胰島素（蘇州禮來，中國），地塞米松（安徽豐原，中國）。接觸式超聲波破碎儀（Bio-Rad，美國），高速冷凍離心機(jī)和離心濃縮儀、納升液相-四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 方法

1.2.1 AML12 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 AML12 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS 的DME/F12 培養(yǎng)基中，添加1%青霉素-鏈霉素雙抗、0.005 mg/mL 胰島素、0.005 mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 ng/mL 硒元素、40 ng/mL 地塞米松。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。建立肝損傷模型時，將細(xì)胞按每皿1×106個接種于6 個10 cm 培養(yǎng)皿，設(shè)置為對照組和ConA組，每組3個培養(yǎng)皿。于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，取20 μL培養(yǎng)基上清，用支原體檢測試劑盒并按照說明書步驟進(jìn)行檢驗。確認(rèn)細(xì)胞無污染后，每盤ConA 組細(xì)胞中加入10 μg/mL ConA，對照組添加等體積的磷酸緩沖鹽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后消化收集細(xì)胞至15 mL 離心管，每管細(xì)胞數(shù)約為2×107個。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管，凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)組樣品制備 自細(xì)胞裂解液提取蛋白，每100 mL 添加4 mL Tris-HCl （1 mol/L，pH 7.4）、64 g 尿素、4 g CHAPS、1 mL 乙二胺四乙酸（100 mmol/L）、5 mL 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（10 mmol/L）。使用前按1∶100 加入磷酸酶抑制劑A 和磷酸酶抑制劑B、6.5 mL 二硫蘇糖醇（1 mol/L）、1 mL 苯甲基磺酰氟（1 mol/L）。每管細(xì)胞樣品加1 mL 細(xì)胞裂解液，于冰上用接觸式超聲波破碎儀低溫裂解15 min。細(xì)胞破碎后于4 ℃離心機(jī)13 800×g 離心20 min 后取200 μL 上清液，向其中加入5 倍體積的蛋白沉淀劑，混合均勻，于-20 ℃沉淀過夜。次日取出樣品于4 ℃、13 800×g 離心1 h，沉淀用90%丙酮洗3遍后繼續(xù)離心10 min。將蛋白沉淀于室溫晾10～15 min。沉 淀 干 燥 后 加 入100 mmol/L NH4HCO3、8 mol/L 尿素溶液重新溶解蛋白，并用Bradford 試劑盒測定蛋白濃度。取400 μg/200 μL 蛋白，每個樣品3 管，總蛋白共1.2 mg，加入8 μL 1 mol/L 二硫蘇糖醇，于37 ℃孵育1 h后，每管加入40 μL 1 mol/L碘乙酰胺，室溫下避光孵育40 min。將蛋白轉(zhuǎn)移到10 KD超濾管中，13 800×g、4 ℃離心30 min 后棄濾液。往超濾管中加入100 μL 50 mmol/L NH4HCO3，13 800×g、4 ℃離心20 min 后棄濾液，重復(fù)3 次。得到的蛋白按照酶和蛋白質(zhì)量比1∶25 加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解過夜。酶解的蛋白于4 ℃、13 800×g 離心20 min 后收集濾液，加入50 μL 50 mmol/L NH4HCO3，13 800×g、4 ℃離心20 min，并與上步濾液合并后，于35 ℃離心濃縮儀中干燥。3 管酶解的肽段分別用50 μL上樣緩沖液溶解并合并成1管。

1.2.3 TiO2富集磷酸化肽段 多肽凍干后用100 μL 上樣緩沖液（65%乙腈、2%三氟乙酸）溶解于1.5 mL 離心管中。 金屬氧化物親和色譜（metal oxide affinity chromatography，MOAC）珠（TiO2beads），用1 mL 上樣緩沖液室溫渦旋孵育20 min（多肽∶beads 的質(zhì)量比為1∶2～1∶8）。4 ℃、1 000×g 離心，棄去上清液，加入第1 份新鮮的1 mL 活化的beads 溶液，室溫渦旋30 min，收集上清液和beads。上清液加入第2 份新鮮的1 mL 活化的beads溶液，室溫渦旋30 min，4 ℃、1 000×g離心，棄去上清液，收集beads，并與上步收集的beads合并。用800 μL沖洗緩沖液1（65%乙腈、0.5%三氟乙酸）洗滌beads，室溫渦旋15～30 min，4 ℃、1 000×g離心，棄上清液；加入800 μL 沖洗緩沖液2（65%乙腈、0.1%三氟乙酸）洗滌beads，室溫渦旋15～30 min，4 ℃、1 000×g 離心，棄上清液；加入300 μL洗脫緩沖液1（300 mmol/L NH4OH、50%乙腈），室溫渦旋15～30 min，4 ℃、1 000×g 離心，取上清液；加入300 μL 洗脫緩沖液2 （500 mmol/L NH4OH、60%乙腈），室溫渦旋15～30 min，1 000×g 離心取上清液，并與上步驟的上清液合并。合并的上清液于4 ℃、15 000×g 下離心10 min 后，于離心濃縮儀室溫干燥，再用20 μL 0.1%甲酸水溶液重溶、脫鹽、干燥。

1.2.4 納升液相-四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀分析 富集的磷酸化樣品用NanoLC-Oribtrap-MS 進(jìn)行檢測。脫鹽后的樣品用10 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，取9 μL 上機(jī)測試。液相色譜儀型號為Easy-nLC1200，色譜柱為75 μm×150 mm，3 μm particle C18 column 自制柱。流動相A 為0.1%甲酸水溶液；流動相B 為含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液，流速為300 nL/min。采用120 min 梯度洗脫樣品：0～3 min，2%～6% B；3～98 min，6%～22% B；98～108 min， 22%～32% B； 108～110 min， 32%～100%B；110～120 min，100%B。

四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀型號為Q-Exactive Plus。離子源為nano-ESI，噴霧電壓1.8 kV，毛細(xì)管溫度275 ℃。一級掃描的質(zhì)荷比（m/z）范圍為350～1 800，最大注入時間（maximum ion injection time，MIT）50 ms。選取豐度前20 的肽段進(jìn)行二級碎裂（loop count=20，MSX count =1，TopN =20），碎裂模式為高能碰撞解離（high energy collisional dissociation，HCD），碰撞能量（normalized collision energy，NCE）設(shè)置為28。離子排除（charge exclusion）：排除電荷數(shù)為1、7、8 以及大于8 的離子。動態(tài)排除時間30 s。

1.2.5 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 原始數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer 2.3（Thermo Fisher Scientific，美國）軟件進(jìn)行搜庫分析，搜索引擎為SEQUEST。小鼠的蛋白數(shù)據(jù)庫下載自UniProt 2019_11 （https：//www.uniprot.org/）。搜庫參數(shù)采用固定修飾為“Carbamidomethyl（C）”，可變修飾為“Oxidation （M）、 Deamidation （NQ）、 Acetyl （N terminal）、Phosphorylation（STY）”。母離子質(zhì)量容差（precursor mass tolerance）為1×10-5，二級譜圖質(zhì)量容差（fragment mass tolerances）為0.050，允許最大漏切位點(diǎn)（max missed cleavages）為2，肽段和蛋白的錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）均≤1%。

1.2.6 肽段和蛋白的定量和分析方法 本實(shí)驗采用非標(biāo)定量法，以蛋白和肽段的峰面積對蛋白和肽段進(jìn)行相對定量分析，滿足差異倍數(shù)為2以及多肽和蛋白的FDR≤1%的蛋白確定為表達(dá)差異蛋白。蛋白的鑒定通過對多個不同肽段與數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)序列預(yù)測的碎片離子的比對得到，肽段的序列主要通過對b 離子和y 離子的捕獲進(jìn)行鑒定［12］。利用String 11.0（https：//string-db.org/）軟件進(jìn)行基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）分析，方法和P值計算參考文獻(xiàn)［13］，結(jié)果從String 11.0 軟件導(dǎo)出。通過String 11.0 軟件對鑒定到的77 個磷酸化蛋白進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并使用Cytoscape 3.7.2軟件使互作網(wǎng)絡(luò)可視化。熱圖由Proteome Discoverer 2.3軟件導(dǎo)出。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。樣本間關(guān)系采用Spearman 相關(guān)性分析，肽段間關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析的方式，以及采用聚類后縮放（complete 算法）的聚類方法，對磷酸化修飾肽段進(jìn)行聚類分析，顏色比對范圍從-1.5～2.0。通過非配對的雙側(cè)Student's t 檢驗，統(tǒng)計2 組哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）磷酸化肽段含量間的差異。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)肽段和蛋白質(zhì)分析

從細(xì)胞表型上看，加入10 μg/mL ConA 作用12 h 后的AML12 細(xì)胞生長間隙較對照組變大，細(xì)胞干癟、光澤度降低，并出現(xiàn)少量死亡細(xì)胞漂浮的現(xiàn)象。經(jīng)過細(xì)胞蛋白裂解、酶解、肽段富集、脫鹽、質(zhì)譜檢測后共收集到磷酸化修飾肽段11 200條，根據(jù)ConA 組與對照組肽段的峰面積值和2組間峰面積比值的P 值篩選出可定位定量的肽段2 685 條，其中差異性調(diào)控的磷酸化修飾肽段共83條，去除種屬來源非小鼠的1 條，對應(yīng)磷酸化蛋白77 個。82 條肽段中上調(diào)的磷酸化肽段20 條，下調(diào)的磷酸化肽段62 條。磷酸化位點(diǎn)在蛋白上的分布結(jié)果及各種磷酸化修飾的比例統(tǒng)計結(jié)果如圖1A、B 所示。磷酸化修飾蛋白中有1個磷酸化修飾位點(diǎn)的有68個，2個磷酸化修飾位點(diǎn)的有8 個，3 個磷酸化修飾位點(diǎn)的有1 個蛋白。而這些磷酸化修飾86%發(fā)生在絲氨酸位點(diǎn)，7%發(fā)生在蘇氨酸修飾位點(diǎn)。熱圖結(jié)果如圖1C所示，ConA 組與對照組的3個樣品組間聚類趨勢相同，ConA 組的磷酸化肽段大部分被下調(diào)，少部分被上調(diào)。

圖1 差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定及定量結(jié)果Fig 1 Results of identification and quantification of differentially phosphorylated proteomics

2.2 磷酸化修飾位點(diǎn)的確定

本研究獲得了ConA 誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的所有差異性調(diào)控的磷酸化肽段的序列、對應(yīng)的蛋白、磷酸化修飾方式和個數(shù)、磷酸化修飾位點(diǎn)在蛋白上的位置等信息。磷酸化變化最大的前10個蛋白的信息見表1。在ConA誘導(dǎo)AML12細(xì)胞損傷過程中，磷酸化修飾變化最大的10個蛋白分別是過氧化物還原酶5（peroxiredoxin 5，Prdx5）、mTOR、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E， eIF4E）、 RNA 輸 出 磷 酸 化 適 配 器（phosphorylated adaptor for RNA export，Phax）、具有序列相似性的家族蛋白76 成員B （family with sequence similarity 76，member B，F(xiàn)am76b）、磷酸葡萄糖突變酶1（phosphoglucomutase 1，Pgm1）、絲氨酸/精氨酸重復(fù)基質(zhì)蛋白1（serine/arginine repetitive matrix 1，Srrm1）、真核細(xì)胞翻譯起始因子5B（eukaryotic translation initiation factor 5B，eIF5B）、AMP 激活的β1 非催化亞基蛋白激酶（protein kinase， AMP-activated， beta 1 non-catalytic subunit， Prkab1）、 膜 聯(lián) 蛋 白 A13 （annexin A13，Anxa13）。

mTOR 可響應(yīng)激素、生長因子、營養(yǎng)素、能量和應(yīng)激多種信號，是細(xì)胞代謝、生長和存活的主要調(diào)節(jié)劑［14-15］，直接或間接調(diào)節(jié)至少800 種蛋白的磷酸化［16-17］。已知在動物模型中，雷帕霉素通過抑制淋巴細(xì)胞活化來預(yù)防ConA 引起的肝損傷［18］。在本實(shí)驗?zāi)Ｐ椭衜TOR 發(fā)生磷酸化修飾的肽段序列為［K］.LHVSTINLQK.［A］，磷酸化發(fā)生在肽段序列的第4個絲氨酸位點(diǎn)上，二級質(zhì)譜圖見圖2A。從二級質(zhì)譜圖可以看出，b??（-P）419.24069 和b??（-P）520.29572 均發(fā)生了磷酸化。而從mTOR 2 組間磷酸化肽段的含量比較（圖2B）可以看出，mTOR 的磷酸化水平在ConA 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷過程中被上調(diào)（P=0.049 5）。

表1 前10個差異磷酸化修飾肽段序列和修飾位點(diǎn)信息Tab 1 Top ten differentially phosphorylated peptide sequences and modification site information

圖2 mTOR磷酸化修飾肽段二級質(zhì)譜和2組間含量比較結(jié)果Fig 2 Secondary mass spectrum of mTOR phosphorylation modified peptides and comparison between the two groups

2.3 差異磷酸化修飾蛋白質(zhì)功能分析

根據(jù)前述條件篩選出的磷酸化修飾肽段，通過UniProt 2019_11 找到對應(yīng)的磷酸化蛋白的官方基因代碼，在String 11.0 上對這77 個蛋白進(jìn)行生物進(jìn)程、分子功能的GO分析，結(jié)果如圖3所示，圖中羅列了篩選的前12位結(jié)果。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ConA 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷過程中，差異磷酸化修飾的蛋白主要與蛋白質(zhì)結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、DNA 結(jié)合、RNA 結(jié)合、酶結(jié)合等細(xì)胞功能相關(guān)。另外這77 個磷酸化修飾蛋白主要參與肝細(xì)胞損傷過程中細(xì)胞的蛋白質(zhì)定位，細(xì)胞骨架、細(xì)胞核、細(xì)胞成分組織，以及mRNA 代謝、細(xì)胞代謝過程的調(diào)節(jié)?？梢娫诟螕p傷過程中磷酸化修飾參與了細(xì)胞中眾多的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)成分的調(diào)節(jié)過程。

2.4 ConA 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷中差異磷酸化蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過String 11.0 對鑒定到的77 個差異磷酸化蛋白進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并使用Cytoscape 3.7.2軟件使互作網(wǎng)絡(luò)可視化，結(jié)果如圖4所示。從蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)該模型所鑒定到的磷酸化蛋白中，與凋亡相關(guān)的mTOR、Crebbp、Bcl2L11、Prkab1、Snip、Taok1 等蛋白處于一個大家族通路上，mTOR 蛋白與多個蛋白具有相互作用關(guān)系，處于一個相對重要的位置。而與RAS 激酶通路相關(guān)的Ksr1、Ptk2b、Sorbs2、Rab12 等蛋白在另一個家族通路上。mTOR 相關(guān)通路和RAS 激酶通路在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中起著重要作用。mTOR 是促細(xì)胞存活因子，在細(xì)胞凋亡中起著抑制劑的作用。細(xì)胞在壓力應(yīng)激下，隨著mTOR 的消耗，抑制細(xì)胞生長和增殖，并增加細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生［19-21］。RAS 蛋白可能同時具有促凋亡和抗凋亡功能，具體取決于RAS 效應(yīng)子途徑和凋亡的機(jī)制［22］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ConA 誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷過程中磷酸化蛋白的主要互作關(guān)系與凋亡和RAS 激酶通路相關(guān)，這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為研究肝損傷藥物的通路機(jī)制提供了參考。

圖3 差異磷酸化修飾蛋白GO分析結(jié)果Fig 3 Results of GO analysis of differentially phosphorylated modified proteins

3 討論

圖4 差異磷酸化修飾蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Interaction network of differentially phosphorylated modified proteins

肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法近年來已趨于成熟，本研究建立了ConA 誘導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型，定位、定量在ConA 誘導(dǎo)的肝損傷過程中發(fā)生差異磷酸化修飾的蛋白以及挖掘潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)，為肝臟疾病的研究提供新的研究靶點(diǎn)以及通路信息。ConA 是一種多克隆有絲分裂原，可通過激活T 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)特定的急性肝損傷。許多小鼠譜系易受ConA 影響而產(chǎn)生肝炎。單次注射ConA 可引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中CD4+淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，并通過特定的炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷［23-24］。mTOR 作為關(guān)鍵的能量傳感器和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)劑，通過形成功能獨(dú)特的復(fù)合物mTORC1 和mTORC2 來控制蛋白質(zhì)的合成、自噬和許多重要的細(xì)胞過程［25-26］。在ConA 誘導(dǎo)的肝損傷動物模型中，mTOR 通過抑制促炎細(xì)胞因子γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的產(chǎn)生抑制肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖［18］，達(dá)到保護(hù)肝損傷的效果。本研究發(fā)現(xiàn)在ConA 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷過程中，mTOR 的磷酸化水平被上調(diào)，猜測該過程可能參與了保護(hù)ConA 引起的肝細(xì)胞損傷，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

肝損傷過程中包括cAMP 依賴性蛋白激酶（protein kinase A，PKA）、PI3K/AKT/mTOR、蛋白激酶C 異構(gòu)體（protein kinase C， PKC）、 絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）、 Jun 激 酶（Jun kinase，JNK）和p38激酶（p38 kinase，p38K）等在內(nèi)的蛋白可以通過可逆的磷酸化和去磷酸化過程來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬［27］。對蛋白質(zhì)功能調(diào)控相關(guān)的磷酸化修飾進(jìn)行研究，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在受到ConA 刺激之后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能蛋白活性發(fā)生改變；該發(fā)現(xiàn)對于進(jìn)一步研究ConA 誘導(dǎo)的肝損傷動物模型具有重要參考價值。從富集到的差異磷酸化修飾蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)可以看出肝細(xì)胞損傷過程中差異磷酸化修飾主要發(fā)生在凋亡通路以及RAS 激酶通路上，提示我們在對肝損傷保護(hù)藥物的開發(fā)研究中可以參考該蛋白互作關(guān)系進(jìn)行針對性研究。mTOR 蛋白在該蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵的位置，且在ConA 動物模型中對肝損傷具保護(hù)作用，提示可以在將來的研究中將mTOR 蛋白以及凋亡通路中其上下游蛋白列為重點(diǎn)研究對象。由于非標(biāo)定量法未對靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，存在定量上的缺陷，未來的研究中我們將采用靶向蛋白定量的方法對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。

本研究提供了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝損傷過程中發(fā)生差異磷酸化修飾的蛋白的分子功能、生物進(jìn)程、相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)以及磷酸化修飾位點(diǎn)的信息，可為肝臟疾病的研究提供靶點(diǎn)信息。