艾滋病合并肝細胞癌患者的病理特征及其對生存率的影響

趙輝 汪勇 許飛龍 凌洲焜

近 年 來 艾 滋 ?。╝cquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者生存期明顯延長，預期壽命已經(jīng)接近普通人群[1]。隨著艾滋病患者的壽命延長，發(fā)生惡性腫瘤的機會增加。有研究顯示肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）已成為艾滋病患者的發(fā)病率和死亡率的主要原因，人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者的HCC發(fā)病率是普通人的7.7倍[2]。HCC是世界上最難治性的惡性腫瘤之一[3]，目前普遍認為手術(shù)治療是能夠?qū)崿F(xiàn)根治癌癥及使其獲得長期生存的最重要手段[4]。但手術(shù)比例低，術(shù)后易復發(fā)轉(zhuǎn)移，總體預后差。近年來，免疫檢查點抑制劑在HCC治療上取得一定突破，有望成為未來最具前途的治療方式之一。但目前HIV+HCC患者很難獲得公平、合理的治療，許多患者接受不太符合標準的治療甚至根本未接受任何治療[5]。認識不足、缺乏專業(yè)共識指南及職業(yè)暴露風險是其重要原因[6]。目前國內(nèi)外關(guān)于手術(shù)治療艾滋病合并肝細胞癌的臨床、病理研究非常少，也還未見將免疫檢查點抑制劑應用于艾滋病合并肝細胞癌患者的研究報道。因此，加強對該類患者的病理、臨床研究既非常必要又迫在眉睫。筆者近年來對HIV+HCC的治療特別是手術(shù)治療進行了一系列研究。前期研究發(fā)現(xiàn)對HIV+HCC患者行根治性肝切除術(shù)是可行的，但更易發(fā)生圍手術(shù)期死亡，肝功能衰竭是圍手術(shù)期死亡的主要原因[7]；HIV+HCC患者比非艾滋病HCC患者生存預后更差，HIV與HCC患者的生存率下降有關(guān)[8]。本研究通過對比艾滋病合并肝細胞癌與非艾滋病肝細胞癌患者的病理特征，從病理角度探討HIV感染對HIV+HCC生存率的影響，并尋找PD-1/PD-L1抑制劑治療HIV+HCC的可能依據(jù)。以期能提高對HIV+HCC患者的認識，并為其提供更佳治療決策，改善治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2013年1月-2018年12月在廣州醫(yī)科大學附屬市八醫(yī)院接受根治性肝切除術(shù)的26例HIV+HCC患者的臨床及病理資料。該26例患者HIV感染診斷經(jīng)廣州市疾病控制中心確認，均為HIV-1型，均已進入艾滋病期。將該26例患者設(shè)定為研究組即艾滋病肝細胞癌組，簡稱HIV+組。選擇同一時期在本院接受根治性肝切除術(shù)的113例未合并艾滋病的肝細胞癌患者作為對照，即非艾滋病肝細胞癌組，簡稱HIV-組。肝癌診斷及根治性切除標準符合文獻[9]原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）；病理診斷符合文獻[10]原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015年版）；艾滋病診斷符合文獻[11]中國艾滋病診療指南（2018版）。納入標準：（1）術(shù)前影像學評估為可切除肝癌；（2）手術(shù)達到根治性肝癌切除；（3）術(shù)后病理檢查證實為HCC；（4）術(shù)前肝功能Child-Pugh分級A級或B級；（5）術(shù)前ECOG評分0或1分；（6）年齡≥18歲；（7）有完整的臨床資料。排除標準：（1）術(shù)中發(fā)現(xiàn)有臨近組織侵犯、肝門及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；（2）行腹腔鏡肝切除術(shù)；（3）術(shù)前曾合并有肝癌破裂出血；（4）術(shù)前曾行放療、化療和/或消融治療；（5）合并其他惡性腫瘤；（6）合并嚴重的心、肺、腎等臟器功能障礙。HIV+組26例，全部為男性；年齡28～64歲，中位年齡44.5歲。HIV-組113例，男101例，女12例；年齡29～75歲，中位年齡50歲。該研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學附屬市八醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)病理檢查 聘請兩位資深病理專家重新閱片，根據(jù)病理資料收集要求單獨閱片，分別報告。如出現(xiàn)差異，則討論后一起重新閱片，達成一致意見。

1.2.2 PD-L1抗體表達檢測 主要儀器：Dako公司Autostainer Link48自動免疫組織化學染色儀、全自動免疫組化預處理儀（PT Link，PT200）。主要試劑：Dako 公 司 EnVinsion FLEX（PD-L1 IHC 22C3）套裝試劑盒：包括 Linker Anti-Mouse、Monoclonal Mouseanti-PD-L1 Clone 22C3、Target Retrieval Solution Low pH （50×）、Peroxidase-Blocking Reageagent、DAB Enhancer、Vi-sualizationI Reagent-HRP、Negative Control Reagent、DAB+Chromogen、Control SlidesDAB+Substrate Buffer等試劑。組織蠟塊切片：取對照組、檢測組蠟塊，將蠟塊3 μm切片各兩張，裱在防脫載玻片上。所有蠟塊均分蠟塊陰性對照組、檢測組，組織切片65 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇至水化后待用。免疫組織化學染色：免疫組織切片抗原修復使用Dako全自動免疫組化預處理儀。先根據(jù)編輯程序打印相關(guān)條形碼，蠟塊測試及蠟塊陽性對照片各一張，每例病例分組貼好不同條形碼。再將EDTA組織修復液裝入自動免疫組化預處理儀中，然后扣上儀器蓋。按啟動鍵，將修復液加熱預溫到65 ℃后。打開儀器蓋，將組織切片及細胞片浸入修復液中。繼續(xù)啟動預處理程序進行98 ℃，20 min的抗原修復，到程序結(jié)束，將組織切片及細胞片pH 7.2～7.4 PBS緩沖液洗滌 3 min，蒸餾水洗滌 1 min。

PD-L1（22C3） 蛋 白 檢 測： 使 用 Da-ko Autostainer Link 48 自動免疫組織化學染色儀，Dako EnVinsion FLEX（PD-L1 IHC 22C3）套裝試劑盒上機檢測（室溫 22 ℃ ～25 ℃），染色主要步驟：（1）將修復好的組織切片及細胞片上機掃描開始染色，內(nèi)源性過氧化物酶封閉 5 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗，一抗PD-L1（22C3）室溫孵育30 min（陰性對照片不需要加一抗），pH 7.2～7.4 Buffer沖洗 1 min。二抗室溫孵育 30 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗 1 min。（2）VisualizationI Reagent-HRP 室溫孵育 30 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗 1 min；DAB 室溫顯色 5 min×2 ；pH 7.2～7.4 Buffer沖洗 1 min。（3）擴大劑室溫 5 min；pH 7.2～7.4 Buffer沖洗 1 min；蘇木精復染 1 min，無水乙醇脫水，電吹風微風吹干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.3 PD-1抗體表達的檢測 儀器、步驟參考PD-L1檢測，抗體試劑采用廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn)的鼠抗人PD-1單克隆抗體。

1.2.4 結(jié)果判定 PD-L1免疫組化（TPS）判讀標準（參考試劑盒說明書）：指部分或完整膜染色的腫瘤細胞占樣品中存在的所有活腫瘤細胞的百分比（PD-L1染色陽性腫瘤細胞數(shù)/總活腫瘤陰性和陽性細胞數(shù)），判讀中應排除任何免疫細胞、基質(zhì)細胞、壞死細胞的陽性表達。TPS＜1%或無腫瘤細胞表達為陰性，TPS≥1%為陽性；TPS 1%～49%為低表達，TPS≥50%為高表達。PD-1結(jié)果判定參考抗體試劑說明書：組織切片中可見目標細胞細胞質(zhì)有棕色/棕黃色染色，且無背景染色即染色陽性。組織切片中未見目標細胞有棕色/棕黃色染色即為染色陰性。

1.3 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。對預后相關(guān)因素采用Kaplan-Meier曲線生存分析、單因素分析，并以對數(shù)秩和檢驗（Log-rank）法比較各組間的生存率（OS）。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床基本資料對比

HIV+組確診HCC時的年齡小于HIV-組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組性別、體質(zhì)量指數(shù)、BCLC分期、TNM分期比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HIV+組術(shù)前肝功能稍差，Child-Pugh評分B級占11.5%，而HIV-組為0.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021），見表 1。HIV+ 組 CD4+＜200 μl 13 例（50.0%），≥200 μl 13 例（50.0%）；HIV RNA ＜400 拷貝 /ml 17 例（65.4%），≥400 拷貝 /ml 9例（34.6%）。

表1 兩組臨床基本資料對比

表1 （續(xù)）

2.2 兩組常規(guī)病理特征對比

HIV+組微血管侵犯（MVI）發(fā)生率高于HIV-組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017），HIV+組腫瘤直徑＞5 cm比例高于HIV-組（P=0.019），兩組腫瘤分化程度、組織學分級及肝硬化差異無統(tǒng)計學意義（P=0.905、0.101、0.820），兩組肝纖維化分級差異無統(tǒng)計學意義（P=0.050），見表2。

表2 兩組常規(guī)病理特征對比[例（%）]

表2 （續(xù)）

2.3 不同病理特征肝細胞癌患者生存率比較

單因素分析MVI、腫瘤直徑＞5 cm影響預后，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同病理特征肝細胞癌患者生存率比較

2.4 兩組免疫組化檢查（PD-1/PD-L1表達）對比

兩組PD-1、PD-L1陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），單因素分析PD-1、PD-L1表達與預后不相關(guān)（P＞0.05），見表4、表5。

表4 兩組PD-1/PD-L1在腫瘤細胞的表達對比[例（%）]

表5 不同免疫組化檢查結(jié)果肝細胞癌患者生存率比較

3 討論

肝細胞癌通常起病隱匿，早期多無明顯癥狀，當患者就診時多已進展到中晚期，錯過最佳治療時期，總體預后差，多年來形成的以手術(shù)為主的治療模式正面臨嚴峻挑戰(zhàn)。近年來，免疫檢查點抑制劑在抗腫瘤治療領(lǐng)域異軍突起、捷報頻傳，為肝細胞癌的治療帶來了新的希望，但免疫檢查點抑制劑在艾滋病合并肝細胞癌患者應用尚未見相關(guān)研究報道。原因可能是多方面的，缺乏相關(guān)研究支持就是其中重要原因之一。筆者前期從流行病學、臨床表現(xiàn)、手術(shù)治療及術(shù)后并發(fā)癥等方面對該病進行了一系列研究。本文從病理角度探討HIV感染對艾滋病合并肝細胞癌生存率的影響，并尋找PD-1/PD-L1抑制劑治療艾滋病合并肝細胞癌的可能依據(jù)。

本研究中HIV+HCC患者確診時更年輕，這與文獻[12]相似，主要考慮HIV的免疫協(xié)同作用導致肝細胞癌的更快進展。另一方面，隨著艾滋病患者生存質(zhì)量不斷改善，其更重視自己身體狀況，更愿意接受規(guī)范隨訪及常規(guī)檢查，也更容易發(fā)現(xiàn)腫瘤。本研究中26例HIV+患者均為男性，男性比例明顯高于HIV-組。性別差異主要考慮HCC好發(fā)于男性，男女比例接近4∶1。也可能與HIV傳播方式的改變有關(guān)，近年來以男男同性傳播為主。BCLC、TNM分期兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明本研究中兩組腫瘤分期及進展具有可比性，術(shù)前HIV+HCC患者肝功能稍差，考慮可能與HIV對肝細胞的直接損傷及抗HIV感染治療藥物的毒性作用有關(guān)。

在本研究中，兩組始發(fā)表現(xiàn)、臨床癥狀相似，但HIV+組容易發(fā)展成更大腫瘤，這可能與機體感染HIV后腫瘤更具侵襲性，生長更快有關(guān)。但兩組間肝纖維化分級尚不能認為有差異（P=0.050），是否合并肝硬化兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.820），但無合并肝硬化比例更高，與文獻[12]相似，提示HIV/HBV患者更易從非肝硬化狀態(tài)進展為HCC。目前機制不完全清楚，考慮是患者免疫功能受損或者HIV的免疫協(xié)同作用及與肝炎病毒共同感染加速了疾病進程。本研究中HIV+組更易發(fā)生MVI，兩組間MVI發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017），無微血管侵犯的患者表現(xiàn)出較好的預后。近年來的研究表明：腫瘤大小、腫瘤形態(tài)、腫瘤包膜及癌周強化等與MVI相關(guān)[13]。隨著腫瘤大小的增加，腫瘤向晚期發(fā)展，腫瘤的分化程度及其侵襲性增加，MVI 發(fā)生的概率也隨之上升[14]，這與我們的研究有很多相似之處。研究中發(fā)現(xiàn)HIV+組有92.3%為中低分化肝癌，單個腫瘤直徑大于5 cm者明顯多于HIV-組（P=0.019），這可能就是艾滋病合并肝癌更易發(fā)生MVI的原因。另外，HIV+ HCC患者中位診斷年齡更小，腫瘤更大，說明艾滋病患者肝細胞癌生長更迅速，更具侵襲性，更易出現(xiàn)MVI。

近年來，多項研究證實免疫檢查點抑制劑對肝細胞癌特別是中晚期肝細胞癌具有明顯的效果[15-17]。但是，免疫檢查點抑制劑在臨床的全面應用還面臨許多問題。首先，關(guān)于PD-1和PD-L1在肝細胞癌上的表達水平及意義報道不一，甚至存在一些爭議。李冰等[18]研究發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1在肝癌中表達顯著增高，并且可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展及預后相關(guān)，但并未報道表達率比值。邱曉莉等[19]研究發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1在中分化原發(fā)性肝癌組織中的表達顯著高于高分化及低分化者。其次，目前PD-L1表達水平被廣泛認可為PD-1/PD-L1抑制劑療效預測標志物，但PD-L1檢測存在缺乏一致性與檢測金標準的缺陷[20]。肝細胞肝癌PD-L1靶向治療的伴隨診斷、判讀閾值等也尚未達到比較統(tǒng)一的標準，目前甚至有文獻在肝細胞癌采用其他腫瘤的評判標準[21]。但是，不論是先前的各種臨床研究還是新近的藥物試驗，都沒有將HIV感染人群納入研究。這為免疫檢查點抑制劑在艾滋病合并肝癌患者中展開治療蒙上了一層陰影。在本研究中，PD-1在HIV+組的表達為0，在HIV-組的表達為2.7%，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），也不影響患者的預后。這與李冰等[18]研究報道的高表達存在差異。PD-1在本研究中的低表達原因目前不清楚。一般認為肝細胞癌組織中PD-1的表達水平與腫瘤大小、有無門靜脈癌栓和TNM分期有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、病理分化程度和臨床分期無關(guān)[22]。由于PD-1主要在活化淋巴細胞上表達，由此推測可能與各種刺激最終導致CD8+T淋巴細胞功能障礙和衰竭有關(guān)，但也有可能與本研究樣本量太小有關(guān)。目前普遍認為免疫檢查點抑制劑治療腫瘤時其治療效果取決于腫瘤細胞是否表達PD-1和PDL1，低表達或不表達PD-L1或PD-1的腫瘤，抗體治療效果欠佳[23]。因此PD-1抑制劑是否可以被考慮在艾滋病合并肝癌的免疫治療中有待進一步研究證實。在本研究中，PD-L1在HIV+組與HIV-組的表達率為（38.5% vs 45.1%），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.537），且不影響患者的預后，但部分PD-L1表達人群卻表現(xiàn)出更好的預后。這是否意味著像非艾滋病肝細胞癌患者一樣，PD-L1抑制劑也應該被考慮到艾滋病合并肝癌的免疫治療中值得進一步研究證實。

本研究是基于我國人群的單中心回顧性研究，這可能會在分析中引入潛在的偏見，且樣本量相對較小，未能對HIV+組進一步分層分組研究。未來的研究中，應擴大樣本并進行多中心研究。

綜上所述，HIV合并肝細胞癌預后更差，可能與微血管侵犯有關(guān)，腫瘤大小是影響預后的重要因素，PD-L1抑制劑應用于HIV合并肝細胞癌應該被考慮。