應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇培育抗稻瘟病恢復(fù)系R153

朱玉君 黃得潤 樊葉楊 莊杰云 沈波

（1 中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室/國家水稻改良中心，杭州310006；2 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州311121；第一作者：zhuyujun@caas.cn；*通訊作者：bshen65@163.com）

水稻是我國最主要的糧食作物之一，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗的水稻新品種是保證國家糧食安全的重要基礎(chǔ)。稻瘟病是危害水稻最嚴重的病害之一。全國農(nóng)技推廣網(wǎng)統(tǒng)計，2001 年至2018 年稻瘟病年均發(fā)生面積達456.0 萬hm2。國家統(tǒng)計局公報，2019 年我國水稻種植面積為2 969.4 萬hm2。由此可推測，稻瘟病發(fā)病面積會占到種植總面積的15.4%，且稻瘟病一旦發(fā)病，減產(chǎn)幅度一般為10.0%～15.0%，發(fā)病嚴重的地塊甚至顆粒不收。稻瘟病是水稻持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴重阻礙。

培育抗稻瘟病的水稻品種是減少因病害損失的有效方法。我國對培育抗稻瘟病品種高度重視，在新品種審定過程中，嚴格實行稻瘟病抗性一票否決制。但從2013 年至2017 年參加國家長江中下游稻區(qū)品種區(qū)試的800 個秈稻品種的稻瘟病抗性分析結(jié)果看，新品種對稻瘟病的抗性不高。試驗中，這800 個品種的苗葉瘟、穗瘟和穗瘟損失率在6 個鑒定點的平均病級分別為4.0 級、6.8 級和4.1 級，表現(xiàn)為中感、感和中感；稻瘟病綜合指數(shù)平均值為4.76，屬于中感水平。參試的品種中表現(xiàn)為抗的品種所占比例只有0.2%，沒有表現(xiàn)為高抗的品種[1]。由此可見，培育高抗稻瘟病品種任重而道遠。

挖掘優(yōu)異的稻瘟病抗性基因是培育高抗病水稻品種的前提條件。目前，共檢測到100 多個稻瘟病抗性基因，其中35 個已被分離和克隆[2]。借助分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，部分抗性基因已應(yīng)用于重要雜交稻親本的改良，如JIANG 等[3]應(yīng)用9 個稻瘟病抗性基因（Pi37、Pit、Pid3、Pigm、Pi36、Pi5、Pi54、Pikm 和Pib）改良兩系不育系Y58S、廣占63S、C815S 和HD9802S，獲得51 份攜帶1 個或2 個抗性基因的品系；CHEN 等[4]應(yīng)用Pi9，Pi47，Pi48 和Pi49 改良兩系不育系C815S，獲得多份聚合1～3 個抗稻瘟病基因的品系。另外，還有三系恢復(fù)系福恢673 的改良[5]，不育系華1228S[6]、恢復(fù)系R163 和R167[7]的選育均基于抗性基因的挖掘。

本研究將來源于谷梅2 號的稻瘟病抗性基因Pi25（具有抗性強、抗譜廣的特點）作為目的基因[8]，以攜帶該抗性基因的品系BL108 為供體親本，與自選恢復(fù)系恢11-32 配制組合，利用與Pi25 緊密連鎖的分子標(biāo)記及功能標(biāo)記進行基因型檢測，以期培育出抗稻瘟病的優(yōu)良恢復(fù)系，為雜交稻品種選育提供抗病親本資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用水稻材料為恢復(fù)系恢11-32 和攜帶稻瘟病抗性等位基因Pi25 的品系BL108?；?1-32 是以中恢161 為母本、蜀恢85 為父本雜交后，通過系譜法選育而成的恢復(fù)系，具有良好的株葉形態(tài)，恢復(fù)力強，但感稻瘟病。BL108 來源于組合G36/中恢9308，其中G36 是從中156 和谷梅2 號重組自交系群體中篩選出的1 份攜帶Pi25 純合抗性等位基因的抗稻瘟病株系。G36 與中恢9308 雜交后，自交加代，經(jīng)分子標(biāo)記輔助選擇和性狀鑒定，篩選出1 份高抗稻瘟病的品系，命名為BL108[9]。

2011 年冬季在海南陵水，以恢11-32 為母本、BL108 為父本配制雜交組合。2012 年夏季在浙江杭州，種植6 株F1，成熟后挑選1 株收種。2012 年冬季在陵水種植F2群體，約500 個單株，挑選到360 個具有優(yōu)良株葉形態(tài)的單株收種。2013 年夏季在杭州種植360個株系，挑選到表型優(yōu)良的97 個F3單株，成熟后收獲各單株種子用于基因型鑒定。

表1 R153 的稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

圖1 Pi25 連鎖標(biāo)記Si13070C 對F3 單株的檢測結(jié)果

圖2 Pi25 功能標(biāo)記CAP3/BglⅡ?qū)蜻x恢復(fù)系的檢測結(jié)果

1.2 DNA 提取

取約20 粒種子置于培養(yǎng)皿，在光照培養(yǎng)箱生長1周后，在各培養(yǎng)皿中混取8 株幼苗葉片，參照ZHENG等[10]方法進行DNA 提取。

1.3 標(biāo)記檢測

本研究所用的分子標(biāo)記共2 對，與Pi25 緊密連鎖的STS 標(biāo)記Si13070C[9]和功能標(biāo)記CAP3/BglⅡ[11]。前者主要用于低世代大群體基因型檢測，后者用于高世代苗頭恢復(fù)系檢測。Si13070C 上游引物序列為ATAACGTGTGTCCATAACAGT， 下 游 引 物 序 列 為TTAATGACTCGTGTATAGAGC；CAP3/Bgl Ⅱ上 游 引 物序列為CCTCACGTTTCTACGTCTTG，下游引物序列為CACACCATTTCTGATGAACC，限制性內(nèi)切酶為BglⅡ。PCR 擴增體系、反應(yīng)條件和凝膠電泳檢測參考前人研究結(jié)果[9，11]。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定在福建省上杭縣茶地國家水稻新品種稻瘟病抗性區(qū)試點進行。鑒定材料種植20 株，株行距16.7 cm×16.7 cm，四周種植感病誘發(fā)品種廣陸矮4 號，葉瘟、穗頸瘟調(diào)查參照陳錦文等[12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因Pi25 的檢測

應(yīng)用與Pi25 緊密連鎖的STS 標(biāo)記Si13070C 對97份材料進行基因型檢測，部分樣品檢測結(jié)果如圖1 所示，最終有26 份樣品呈純合型Pi25 抗性等位基因。將這26 份DNA 對應(yīng)的單株于2014 年夏季在杭州種植F4株系，通過進一步表型觀察，挑選6 個株系作為候選恢復(fù)系。2014 年冬季在海南陵水，6 個F5株系分別與不育系306A 進行配組。同時，提取DNA，應(yīng)用Pi25 功能標(biāo)記進行基因型檢測驗證。結(jié)果表明，6 個株系均攜帶Pi25 抗性等位基因（圖2）。2015 年夏季在杭州種植6 個測交組合，其中1 個組合表現(xiàn)突出，將對應(yīng)恢復(fù)系命名為R153。

2.2 稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

從表1 可見，感病對照廣陸矮4 號苗瘟發(fā)病率8%，鑒定為5 級；R153 苗瘟發(fā)病率0%，鑒定為0 級。廣陸矮4 號葉瘟發(fā)病率18%，鑒定為9 級；R153 發(fā)病率7%，鑒定為4 級。廣陸矮4 號穗瘟發(fā)病率100%，鑒定為9 級；R153 發(fā)病率5%，鑒定為1 級?？剐跃C合評價R153 為抗稻瘟病。

3 討論

本研究通過分子標(biāo)記輔助選擇將Pi25 抗性等位基因?qū)牖謴?fù)系恢11-32 中，選育出新恢復(fù)系R153，經(jīng)稻瘟病抗性鑒定表現(xiàn)為抗病。在與多個不育系測配中，發(fā)現(xiàn)該恢復(fù)系與潢達A 配組獲得的雜交稻組合表現(xiàn)出較強產(chǎn)量雜種優(yōu)勢。在2019 年中國水稻研究所組織的所內(nèi)晚秈新品種比較試驗中，比對照五優(yōu)308 增產(chǎn)11.3%，比天優(yōu)華占增產(chǎn)4.7%。R153 的選育為雜交稻新組合選育提供了新的親本資源。

分子標(biāo)記輔助選擇已成為新品種選育的常規(guī)手段，其主要優(yōu)勢在于分子標(biāo)記檢測與表型鑒定的吻合度高、檢測時間不受水稻種植季節(jié)限制。本研究用于檢測Pi25 的分子標(biāo)記Si13070C 為緊密連鎖標(biāo)記，CAP3/BglⅡ為功能標(biāo)記，后者在基因型鑒定過程中需要進行酶切反應(yīng)，增加了檢測成本和時間。在本研究中，我們先用連鎖標(biāo)記進行初步檢測，結(jié)合基因型和表型淘汰大量個體，再對中選的少數(shù)苗頭材料用功能標(biāo)記進行驗證，可有效減少工作量和試劑成本。

對于本研究的目的基因Pi25，研究表明該抗性基因在我國稻種資源中頻率較低[13]，但其對稻瘟病表現(xiàn)出良好抗性。本課題組近10 多年來一直圍繞該基因進行分子標(biāo)記輔助選擇育種。早在2010 年，借助分子標(biāo)記輔助選擇選育出攜帶Pi25 抗性等位基因的20 份候選恢復(fù)系和27 份候選保持系[9]，并將這些抗性材料提供給多家育種單位，目前已成功改良和選育出多個雜交稻親本：如以BL108 為供體親本，改良兩系不育系浙科22S，獲得5 個綜合性狀表現(xiàn)良好且抗稻瘟病的兩系不育系品系[14]；以BL47 為供體親本，改良三系保持系福稻B，獲得5 個候選保持系[15]；以BL27 為供體親本，改良臻達B，獲得新不育系157A[16]；以BL5 為供體親本，改良RGD-7S，獲得具有較好應(yīng)用前景的兩系不育系元亨S，由該不育系配組獲得的雜交稻組合元兩優(yōu)676（審定編號：閩審稻20190012）和元兩優(yōu)6503（審定編號：閩審稻20200020）已通過福建省品種審定。這些品種的改良和選育均表明Pi25 具有良好的育種應(yīng)用價值。

致謝：本研究所用不育系306A 和潢達A 由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所黃庭旭研究員提供，謹致謝意！