熱處理羊乳酪蛋白結(jié)構(gòu)與抗原性的變化規(guī)律

薛海燕，樊嬌嬌，賀寶元，操歌，李晶瑩，宋宏新

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

（2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021）

乳制品含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等的營養(yǎng)成分，是人類攝取營養(yǎng)的重要來源之一。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質(zhì)，約占乳總蛋白質(zhì)的80%，它在乳中主要以膠束形式存在，是一種高度磷酸化鈣結(jié)合蛋白[1]，酪蛋白主要有αs1-CN，αs2-CN，β-CN和κ-CN四種類型。對于過敏人群來說，酪蛋白則是引起人體過敏反應(yīng)的主要過敏原之一，如表1中，羊乳酪蛋白中β-CN含量最大，κ-CN也較牛乳含量高，而αs1-CN含量低于牛乳。有研究顯示了對低αs1-CN含量的山羊乳有較小免疫反應(yīng)性[2]，故αs-CN對研究羊乳抗原性等方面性質(zhì)極其重要。而羊乳與牛乳酪蛋白結(jié)構(gòu)不同，受加工影響的結(jié)構(gòu)和抗原性變化亦不同。

表1 山羊乳、牛乳和人乳中酪蛋白含量差異[3]Table 1 Difference of casein content in goat milk, bovine milk and human milk

乳品加工中，通過一定的加工處理可使蛋白質(zhì)改性，引起乳品蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)發(fā)生改變，有可能會改變?nèi)槠返倪^敏性[4]。主要的處理方法有物理法（熱處理[5]、高壓處理、輻照處理等）、化學(xué)法（糖基化作用等）、酶法和生物法等。許倩[6]等利用動態(tài)高壓微射流結(jié)合加熱處理濃縮乳蛋白可降低其中酪蛋白的抗原性，增加α-乳白蛋白的抗原性，但對β-乳球蛋白效果不明顯；張微等[7]研究蛋白酶水解作用對牛乳酪蛋白抗原性的影響，結(jié)果表明胰蛋白酶能夠有效降低牛乳酪蛋白的抗原性。Li[8]等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲處理后的蝦肉蛋白，純化蝦原肌球蛋白的IgE結(jié)合能力降低了80%。麻小娟[9]對卵白蛋白采用糖基化處理來探索其抗原性及過敏原性，發(fā)現(xiàn)隨著糖基化的進(jìn)行，卵白蛋白的抗原性逐漸升高，過敏原性逐漸降低。

而熱處理是乳品加工中常用的物理改性方法。在巴氏滅菌奶、UHT牛奶、乳奶、煉乳等乳制品的加工過程中都有涉及加熱。熱處理能夠使蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得其抗原表位被破壞、掩埋、暴露等，最終影響蛋白的抗原性。Bu[10,11]等通過不同溫度加熱處理乳清分離蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱溫度在90 ℃以下時，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性增加，當(dāng)溫度高于90 ℃時，兩種蛋白的抗原性均顯著下降。張銀[12]等采用熱處理與動態(tài)超高壓加工兩種方式結(jié)合處理卵白蛋白，結(jié)果表明卵白蛋白抗原性隨著加熱溫度的升高而降低，隨著壓力的升高先降低后回升，并且表明了熱處理對卵白蛋白抗原性的影響比超高壓大。

關(guān)于熱處理改變蛋白性質(zhì)，目前大多是關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究，在牛乳方面較多關(guān)于乳清蛋白中α-La與β-Lg的研究，但關(guān)于對羊乳酪蛋白結(jié)構(gòu)及抗原性等的研究尚少。因此，在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，采用羊乳酪蛋白中的α-CN與β-CN作為研究對象，對其進(jìn)行不同溫度處理，測定其蛋白的結(jié)構(gòu)變化與抗原性變化，并分析不同溫度下蛋白的結(jié)構(gòu)變化與抗原性之間的關(guān)系，為羊乳的過敏原性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

羊乳：陜西金牛乳液有限公司提供；Tris-base；鄰甲苯甲醛（DNPH）；乙酸乙酯；鹽酸胍；乙二胺四乙酸（EDTA）；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）；1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）；胰蛋白酶；胃蛋白酶。

1.2 儀器與設(shè)備

超高溫高壓滅菌，上海申安醫(yī)療器械廠；電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；PHS-3C型pH計，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，南京馳順科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，青島永和創(chuàng)新電子科技有限公司；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司；圓二色光譜儀，英國應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳酪蛋白的分離制備

將新鮮羊乳離心脫脂，鹽酸沉淀（pH=4.1）羊乳酪蛋白。用0.05 mol/L的NaOH作為溶劑，配置30 mg/mL羊乳酪蛋白溶液，在30 ℃下調(diào)pH至12.0，加CaCl2溶液至體系中的Ca2+濃度為0.09 mol/L，調(diào)pH至中性，4000 r/min離心15 min，收集沉淀①。將沉淀①于3 mol/L的尿素溶液中完全溶解后，調(diào)pH為4.1，離心，收集沉淀②，反復(fù)水洗沉淀，透析并凍干得α-CN；將沉淀①溶于水，待完全溶解后調(diào)pH 4.1，在4 ℃下冷卻3 h，離心，提取上清液，在30 ℃下調(diào)pH為4.1，再離心，收集沉淀③，水洗3次，透析并凍干得β-CN。將制得酪蛋白的分離組分在冷凍干燥機(jī)中，進(jìn)行真空凍干，凍干粉末-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 羊乳酪蛋白的熱處理

將羊α-CN、羊β-CN用0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配成1 mg/mL的溶液，依據(jù)常見的處理方式溫度設(shè)定如下：63 ℃（低溫保持巴氏殺菌）30 min、80 ℃（高溫巴氏殺菌）15 s、100 ℃（煮沸殺菌）300 s、134 ℃（超高溫高壓滅菌）4 s，不進(jìn)行熱處理作為對照組。加熱處理后的樣品，取出后瞬間低溫冷卻放置。

1.3.3 SDS-PAGE檢測分子量[13]

將熱處理后的酪蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析熱處理對蛋白質(zhì)分子量的影響。

1.3.4 酪蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)修飾變化

1.3.4.1 游離羰基含量的測定[14]

采用DNPH比色法測定熱處理后的羊α-CN、羊β-CN樣品溶液中游離羰基含量。以不加蛋白樣品為空白，在370 nm波長處測量上清液的吸光值，用Bradford法測上清液中的蛋白質(zhì)含量[15]。按朗伯比爾定律計算羰基含量。

式中：A表示所測樣品的凈吸光值；ξ為DNPH的摩爾消光系數(shù)，值為22000 L/(mol·cm)；b為比色皿的厚度；c為游離羰基的濃度，用nmol/g蛋白質(zhì)表示。

1.3.4.2 自由巰基的測定

參照Ellman’s DTNB法[16]。分別取得熱處理前后的1.0 mL的羊α-CN、羊β-CN樣品溶液與4.0 mL Tris-Gly緩沖溶液（0.086 M Tris、0.09 M Gly、5 mM EDTA、pH 8.0）混勻，再加入50 μL 4 mg/mL的Ellman’s試劑（4.0 mg DTNB溶于1.0 mL的Tris-Gly緩沖液），37 ℃反應(yīng)15 min，在412 nm處測其吸光值。

式中：A為吸光度；D為稀釋倍數(shù)；C為樣品濃度(mg/mL)。

1.3.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定

利用圓二色光譜儀對熱處理前后的羊α-CN、羊β-CN樣品用PBS配置成0.02 mg/mL溶液進(jìn)行色譜檢測。測定條件：掃描范圍是210～280 nm，其中石英樣品池的光程是0.01 cm，掃描速度是100 nm/min，掃描帶寬為0.5 nm，步長為1 nm。通過系統(tǒng)自帶的分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.6 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法對熱處理前后的羊α-CN、羊β-CN的疏水性進(jìn)行測定[17]。測定條件為：激發(fā)波長為370 nm，掃描發(fā)射波長范圍為400～600 nm，電壓為400 V，狹縫寬度均為10 nm。本實驗用熒光強(qiáng)度來表示疏水性的大小。

1.3.7 測定消化后酪蛋白抗原性

模擬嬰兒胃腸消化，將熱處理后的羊α-CN、羊β-CN調(diào)節(jié)pH至3，在37 ℃下加入0.3%（質(zhì)量體積比）的胃蛋白酶，恒溫攪拌反應(yīng)2 h，即開始進(jìn)行模擬胃液消化。反應(yīng)停止后立即調(diào)節(jié)溶液pH至7，加入胰蛋白酶使其濃度為10 mg/mL，恒溫攪拌反應(yīng)4 h，即進(jìn)行模擬腸液消化。最后用100 ℃沸水浴滅酶5 min停止反應(yīng)，然后放置冰水冷卻，將樣品分裝后-20 ℃條件下保存待測[18]。

1.3.8 抗原性評估[19]

采用間接競爭ELISA方法測定被處理的α-CN和β-CN的殘余抗原性。在間接競爭ELISA體系中待測抗原與包被抗原競爭結(jié)合抗體血清，因此被測抗原的抗原性大小與吸光值成反比。羊α-CN、羊β-CN稀釋包被濃度為12.5 μg/mL，取100 μL包被在96酶標(biāo)孔板中4 ℃過夜；隔天洗板后加入待測抗原與羊抗兔IgG預(yù)混液進(jìn)行競爭反應(yīng)，其中對照組不加待測抗原；1 h后洗板并加入1:4000稀釋的羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記物進(jìn)行檢測并顯色，終止顯色后檢測吸光值OD，將梯度濃度對應(yīng)的OD值轉(zhuǎn)化為B/B0值作為縱坐標(biāo)（B0為無抗原競爭時的OD值，B為各相應(yīng)濃度抗原抑制時的OD值），相應(yīng)濃度的對數(shù)是橫坐標(biāo)lg[α-CN]（或lg[β-CN]），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸擬合，由此計算得待測抗原的濃度，來反映相應(yīng)抗原性的變化。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0軟件作圖，并用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子量分析

如圖1為羊乳分離制備的酪蛋白組分電泳圖譜，經(jīng)凝膠成像灰度值分析估算出所分離得到的羊α-CN和β-CN的純度都在80%以上，市售標(biāo)準(zhǔn)蛋白純度為70%以上，表明所分離的蛋白較純，可用于后續(xù)研究。

酪蛋白經(jīng)過熱處理、高壓脈沖電場、輻射以及超聲波手段的處理后，其分子量可能會發(fā)生改變。圖2為羊乳的α-CN和β-CN經(jīng)過不同溫度處理后對酪蛋白分子量的影響。觀察各組條帶顏色可知：羊乳的α-CN和β-CN在63 ℃時灰度無明顯變化，在溫度升高達(dá)到80 ℃之后有灰度變淺的現(xiàn)象。電泳圖譜中蛋白條帶的灰度深淺可以代表進(jìn)入電泳凝膠內(nèi)的蛋白含量變化。因為羊乳的酪蛋白熱穩(wěn)定性差，使得酪蛋白發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)引起蛋白分子交聯(lián)形成大分子物質(zhì)，而無法進(jìn)入分離膠形成條帶[20]，導(dǎo)致電泳圖所示的條帶灰度變淺。這與李林強(qiáng)等[21]對于熱處理牛羊乳酪蛋白的SDS電泳結(jié)果相似，蛋白經(jīng)一定程度的熱處理均發(fā)生交聯(lián)聚合，且羊乳較牛乳更易發(fā)生聚合。

圖1 羊奶酪蛋白成分的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of the components of casein in goat milk

圖2 溫度對羊乳中α-CN和β-CN分子量的影響Fig2. Effect of temperature on the molecular weight of α-CN and β-CN in goat milk

2.2 酪蛋白的側(cè)鏈修飾的變化

2.2.1 游離羰基含量

蛋白質(zhì)的很多側(cè)鏈氨基酸官能團(tuán)都容易氧化形成羰基類衍生物，如肽鍵的斷裂、氨基酸側(cè)鏈的氧化等，因此游離羰基含量可以被用來判斷蛋白質(zhì)的氧化程度[22-24]。圖2為不同溫度的處理下，羊乳α-CN和β-CN中游離羰基含量的變化?？梢杂^察出，在溫度達(dá)到63 ℃時，羊乳α-CN和β-CN的游離羰基含量顯著增長，且隨著溫度的升高不斷增多，當(dāng)溫度到達(dá)134 ℃時，羊乳的α-CN和β-CN中游離羰基含量與未處理時相比分別增加了134.72%和110.98%，均有極顯著增長。這是由于蛋白中的α-CN和β-CN為無規(guī)則卷曲蛋白，蛋白中的色氨酸、蛋氨酸、組氨酸等受高溫影響最易被氧化形成羰基[25]。羊乳熱穩(wěn)定性低，易在高溫條件下被氧化，且溫度越高，氧化程度越劇烈。

圖2 溫度對羊乳的α-CN和β-CN中游離羰基含量的影響Fig.2 Effect of temperature on free carbonyl content of α-CN and β-CN in goat milk

2.2.2 自由巰基含量

圖3 溫度對羊乳的α-CN和β-CN中自由巰基含量的影響Fig.3 Effect of temperature on free sulfhydryl content of α-CN and β-CN in goat milk

巰基基團(tuán)時蛋白質(zhì)中的重要功能性基團(tuán)之一，它可以相互交聯(lián)后形成二硫鍵，用來穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)[26,27]。圖3是不同溫度的處理下，羊乳的α-CN和β-CN中自由巰基含量的變化。由圖可知，羊乳的α-CN中自由巰基含量低于β-CN中自由巰基的含量，通過計算得出，當(dāng)溫度加熱至63 ℃時，羊乳α-CN中的自由巰基含量有顯著下降，在溫度達(dá)到100 ℃時便有極顯著降低，隨后下降趨于平緩，當(dāng)溫度為134 ℃時，其自由巰基含量減少了53.03%。然而，羊乳β-CN中的自由巰基含量不及α-CN對溫度敏感，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時，自由巰基的含量才開始有了顯著降低，當(dāng)溫度到達(dá)134 ℃時，自由巰基含量減少了52.65%，與未處理時相比，有了極顯著差異。

2.3 酪蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

圖4 不同溫度條件下羊乳α-CN（a）和β-CN（b）的圓二色譜圖Fig.4 CD chromatogram of α-CN (a) and β-CN (b) from goat under the different thermal processing conditions

蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，肽鍵的序列都是一定的，這些順序決定著肽鍵能級會發(fā)生的躍遷情況，圓二色譜的譜帶因蛋白的二級結(jié)構(gòu)不同而有所差異，因此，根據(jù)圓二色譜可以分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)差異。如圖4為不同溫度條件下羊乳α-CN和β-CN的圓二色譜圖。由圖4可以看出，在190～250 nm范圍內(nèi)，在206 nm處由負(fù)轉(zhuǎn)正有一正譜帶，這是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[28]；在212 nm處和225 nm處的兩個負(fù)峰是α-螺旋特征峰；在222 nm處還有一個負(fù)譜帶，是β-折疊特征峰，譜圖可發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中含有大量無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[29]。

表2和表3是關(guān)于羊乳中α-CN和β-CN的二級結(jié)構(gòu)含量變化。計算發(fā)現(xiàn)羊乳α-CN與β-CN與的二級結(jié)構(gòu)含量變化，其中，羊β-CN的α-螺旋結(jié)構(gòu)的初始含量高于α-CN的該結(jié)構(gòu)含量，這或許是由于羊乳本身α-CN的含量就遠(yuǎn)低于β-CN[30]。且由表格可知，隨著溫度變化，兩種酪蛋白的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角的含量變化均隨著溫度的升高而減少，當(dāng)溫度達(dá)到134 ℃時α-CN的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量減少了85.38%，無規(guī)則卷曲減少了51.71%，β-CN的兩類結(jié)構(gòu)的含量分別減少了56.14%和94.38%，這表明了隨著溫度升高羊乳α-CN的結(jié)構(gòu)彈性增加，這或?qū)⑴c它更易被水解有關(guān)。α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量變化則與上述兩種結(jié)構(gòu)變化相反，隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到134 ℃時兩種蛋白分別增加了53.11%和85.50%。該二級結(jié)構(gòu)變化與章宇斌[31]對酪蛋白進(jìn)行不同溫度處理后的CD測定的部分研究結(jié)果相似，加熱導(dǎo)致αs-及β-CN的螺旋含量逐漸增加。然而，兩種酪蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)的含量卻隨著溫度的升高分別在26.52%～28.56%和13.79%～ 21.88%的區(qū)間內(nèi)有著小幅度的無規(guī)則的變化，這表明了溫度的改變不會對羊乳的該蛋白結(jié)構(gòu)有明顯的影響。吳相佚[26]等對濃縮乳蛋白70進(jìn)行熱處理，其蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量下降，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量上升。蛋白的不同可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的差異，且乳蛋白自身還存在著酪蛋白與清蛋白的交聯(lián)與聚集，可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。

表2 溫度對羊α-CN二級結(jié)構(gòu)各組分含量的影響Table 2 Effect of temperature on the content of goat α-CN secondary structure (%)

表3 溫度對羊β-CN二級結(jié)構(gòu)各組分含量的影響Table 3 Effect of temperature on the content of goat β-CN secondary structure (%)

表4 溫度對樣品熒光光譜分析時最大熒光強(qiáng)度的影響Table 4 Effect of temperature on maximum fluorescence intensity in fluorescence spectrum analysis of samples

2.4 酪蛋白疏水性分析

圖5 不同溫度條件下羊α-CN（a）和β-CN（b）的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of α-CN (a) and β-CN (b) from goat at different temperatures

圖5是由ANS熒光探針檢測法得到的兩種酪蛋白不同溫度條件下的熒光光譜圖。應(yīng)用熒光探針法來研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象，在一定范圍內(nèi)，最大熒光強(qiáng)度與蛋白表面的疏水性呈線性關(guān)系[32]。

觀察譜圖可以看出，未經(jīng)過熱處理時，羊乳的α-CN疏水性均小于β-CN的疏水性，這說明羊乳α-CN的疏水性結(jié)合位點低于β-CN。結(jié)合表4可以看出，隨著溫度升高，羊乳α-CN的最大熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，到134 ℃時增加了約50.38%，這是由于溫度的升高導(dǎo)致二硫鍵介導(dǎo)的聚合反應(yīng)隱藏了部分含有熒光色基團(tuán)的氨基酸，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時，蛋白二級構(gòu)象發(fā)生改變，一些集中在α-螺旋、β-折疊等轉(zhuǎn)角處的親水區(qū)域因結(jié)構(gòu)的變化而減少，從而使得蛋白分子內(nèi)的疏水基團(tuán)暴露，也可導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。上述現(xiàn)象可以證明隨著溫度的升高，酪蛋白結(jié)構(gòu)表面疏水基團(tuán)會增加，而疏水性的增強(qiáng)或?qū)?dǎo)致蛋白的解離程度有所增大。又因羊乳酪蛋白的熱穩(wěn)定性弱，且β-CN在羊乳酪蛋白中占有很大比例，所以羊乳β-CN的膠束與ANS結(jié)合的親和力與緊密度相對不穩(wěn)定，使得最大熒光強(qiáng)度與其他蛋白相比在溫度的升高過程中有著擺動性的無規(guī)則變化。

2.5 抗原性的變化

通過模擬嬰兒的胃腸水解消化，并采用間接競爭ELISA法檢測熱處理對牛羊乳α-CN和β-CN的抗原濃度變化，來反應(yīng)其抗原性的變化。圖6表示消化前后的抗原性變化。觀察發(fā)現(xiàn)：在未經(jīng)過熱處理時，羊乳中的β-CN含量高于α-CN，因此圖示羊乳α-CN的抗原性低于β-CN的抗原性[33]。在未經(jīng)過胃腸模擬消化時，羊乳中α-CN和β-CN的抗原性均隨著溫度的升高而持續(xù)性降低，當(dāng)加熱溫度為80 ℃時，抗原性有顯著性變化，當(dāng)溫度為134 ℃時抗原性有了極顯著的降低，α-CN和β-CN的抗原性分別降低了61.80%和69.02%。羊乳的α-CN在模擬胃腸消化之后，其抗原性與相同溫度下未消化時的抗原性相比約下降了50%左右，且僅當(dāng)溫度達(dá)到63 ℃時抗原性就有顯著降低，而羊乳β-CN的抗原性卻直至溫度達(dá)到80 ℃時才有顯著性減少。當(dāng)溫度在134 ℃時，兩種蛋白的抗原性濃度相似，僅剩7.86～8.54 μg/mL，與未經(jīng)溫度處理的消化前后相比，都有著極顯著的降低。這就與前人所得出的羊乳酪蛋白較牛乳在體內(nèi)來說更易被人體消化吸收的結(jié)論相呼應(yīng)。結(jié)合羊乳的α-CN和β-CN的側(cè)鏈修飾變化、二級結(jié)構(gòu)和疏水性的變化可推斷，隨著溫度升高，羊乳酪蛋白抗原性的減少，除了與其氧化程度（游離羰基含量的增多）、疏水性增加有關(guān)，或與二級結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角含量和無規(guī)則卷曲含量的減少有關(guān)，它們隨著溫度的升高幾近消失，這種現(xiàn)象或?qū)е虏糠挚乖Y(jié)合位點的消失而減少了免疫反應(yīng)的進(jìn)行。

圖6 不同溫度對羊α-CN和β-CN抗原性的影響Fig6. Effects of different temperatures on the antigenicity of goat α-CN (a) and β-CN (b)

3 結(jié)論

熱處理羊乳酪蛋白會發(fā)生蛋白的交聯(lián)，導(dǎo)致部分沉降或聚集成大分子物質(zhì)。同時，樣品蛋白被高溫所氧化，導(dǎo)致游離羰基含量升高、自由巰基含量減少。且隨著溫度的不斷升高，羊乳的α-CN和β-CN的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋呈現(xiàn)增加趨勢，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲則減少至幾近消失。此外，羊乳α-CN的熒光強(qiáng)度均隨著溫度升高而增強(qiáng)，而羊乳β-CN的膠束與ANS結(jié)合的親和力與緊密度相對不穩(wěn)定，故羊乳β-CN的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)無規(guī)則變化。溫度的升高會引起蛋白的卷曲程度及彈性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致分子內(nèi)的疏水基團(tuán)，二硫鍵等暴露，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生聚合或交聯(lián)，部分分子表面的抗原表位被掩埋或被氧化分解，最終導(dǎo)致了被測蛋白抗原性均有所降低。故溫度的升高，能夠使羊乳α-CN和β-CN的抗原性減弱，且與蛋白的游離羰基含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲與抗原性變化呈一定正相關(guān)，而α-CN的抗原性與疏水性呈反比關(guān)系。此外，羊乳α-CN和β-CN經(jīng)過不同條件的熱處理后再經(jīng)胃腸消化，抗原性再度明顯降低。但僅依據(jù)單體蛋白研究還不能十分準(zhǔn)確的探究其具體規(guī)律性改變，在實際加工過程中，蛋白的分子間也存在交聯(lián)與聚合現(xiàn)象，這還需進(jìn)一步探究其中的潛在規(guī)律。