針刺治療慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激大鼠多時間點(diǎn)血清代謝組學(xué)的變化*

徐雪嬌,李天英,李 欣,馬蕓瑄,喬延盈,劉俊麟,羅文彬,梁 東

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著抑郁癥發(fā)病率的不斷增加，其對人類的危害逐漸顯現(xiàn)并且愈發(fā)嚴(yán)重。抑郁癥的治療成為人們極為關(guān)注的熱點(diǎn)。尋找有效的治療方法刻不容緩。針刺作為中醫(yī)學(xué)的重要治療手段之一，在抑郁癥的臨床治療上具有一定的優(yōu)勢[1-2]。但其機(jī)制尚不清楚。2016年美國內(nèi)科學(xué)會臨床實踐指南提出：單用針刺治療抑郁癥具有療效好且副作用低的優(yōu)勢[3]。本研究選用經(jīng)典的抑郁動物模型——慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)模型[4]。以往較為重視對治療結(jié)果的研究而忽略治療過程。本研究選取針刺百會和印堂治療CUMS大鼠過程中的多個時間點(diǎn)，觀察糖水消耗和血清代謝組學(xué)的變化，找尋相關(guān)代謝通路。為針刺治療抑郁癥提供更加全面的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

領(lǐng)取30只雄性SD大鼠[黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK(黑)2018-003]。適應(yīng)環(huán)境：單籠飼養(yǎng)1周。適應(yīng)2%蔗糖水溶液：5周。飼養(yǎng)條件：溫度：22～23℃，濕度：45%～55%，光照周期：12 h。提供標(biāo)準(zhǔn)食水。

1.2 實驗流程

如圖1，在蔗糖水溶液適應(yīng)階段，每周固定時間進(jìn)行糖水消耗實驗。刺激開始前，將大鼠隨機(jī)分成CUMS大鼠24只和對照組大鼠6只，將對照組大鼠放置于另外的房間不予刺激并正常喂養(yǎng)。4周的慢性不可預(yù)見性溫和刺激結(jié)束后將CUMS大鼠隨機(jī)平均分為針刺1周組、針刺2周組、針刺3周組和CUMS組并開始針刺治療，SPT每周固定時間進(jìn)行。

圖1 實驗總流程圖

1.3 CUMS流程

本實驗采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激造模方法[5]。具體操作有空籠，合籠，傾斜鼠籠45°，禁水，空瓶和夜間光照等。每日1～2種刺激，同一種刺激2 d內(nèi)不重復(fù)使用。糖水消耗實驗過程中不刺激。

1.4 行為學(xué)

1.4.1 糖水消耗實驗 糖水消耗實驗(Sucrose prefe-rence test,SPT)是CUMS模型評價中的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。同時放置外觀完全相同的一瓶純水和一瓶糖水。在實驗的中間時間點(diǎn)交換兩瓶水的位置。觀察規(guī)定時間內(nèi)蔗糖水溶液消耗的百分比。

1.4.2 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0，采用Student t檢驗或非參數(shù)檢驗。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 針刺流程

參考相關(guān)研究[7],每天上午10點(diǎn)，選取針刺百會(GV20，兩耳尖連線中點(diǎn))和印堂(GV29，兩眼連線中點(diǎn))進(jìn)行針刺。針具：華佗牌(0.18 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，先用酒精棉球消毒再進(jìn)針5 mm，留針20 min。

1.6 取材

7%水合氯醛腹腔注射麻醉后采血，室溫下靜置25～30 min，離心10 min(3 000 r/min)，吸取上清保存到EP管中，儲存于-80℃冰箱。

1.7 GC-MS分析

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromotography/mass spectrometry,GC-MS)分析方法基于課題組相關(guān)研究[8-9]，具體如下。

1.7.1 樣品制備 樣本取出并解凍，將50 μL的血清樣本移至EP管中加入內(nèi)標(biāo)(20 μL,0.3 mg/mL,L-2-氯苯丙氨酸)，加入150 μL甲醇-乙腈(2∶1,v∶v)溶液，持續(xù)搖勻，-20 ℃靜置約10 min。冰水浴超聲5 min，靜置10 min(-20 ℃)，離心10 min(4 ℃)，取100 μL上清。加入80 μL甲氧胺鹽酸鹽吡啶(15 mg/mL)，渦旋震蕩2 min后，進(jìn)行肟化反應(yīng)。將樣品取出并加入80 μL的BSTFA(1%TMCS)和20 μL正己烷進(jìn)行渦旋震蕩(2 min)并于70 ℃發(fā)生反應(yīng)。

1.7.2 色譜條件 選用7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent,USA)。采用不分流模式將樣品注入進(jìn)行分析(1 μL)。經(jīng)毛細(xì)管柱(HP-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm,Folsom,CA,USA)分離后進(jìn)入質(zhì)譜。進(jìn)樣口溫度：280 ℃，流速：6.0 mL/min。升溫程序：60 ℃，125 ℃，190 ℃，210 ℃，310 ℃。

1.7.3 質(zhì)譜條件 采用隨機(jī)連續(xù)樣本分析。離子源：230 ℃，四極桿：150 ℃，電子能量：70 eV。全掃描模式范圍為50～600 m/z。

1.7.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)軟件(ChromaTOF)預(yù)處理后，可導(dǎo)出三維矩陣(CSV格式)，可獲得樣品的基本信息，其中假陽性數(shù)據(jù)已除去。進(jìn)行響應(yīng)強(qiáng)度峰面積的歸一化，矩陣導(dǎo)入軟件包。無監(jiān)督的主成分分析(Principal components analysis,PCA)用于評價樣本間的總體情況，有監(jiān)督的(正交)偏最小二乘法分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)用于尋找組間差異代謝物。200次排序檢驗用于驗證模型是否存在過度擬合。

2 結(jié)果

2.1 針刺百會和印堂對CUMS大鼠糖水消耗的影響

經(jīng)過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激后，CUMS大鼠糖水消耗顯著降低(P<0.01)。針刺治療第1周和第2周，針刺大鼠糖水消耗雖然有上升趨勢，但與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。針刺治療3周后，針刺3周組大鼠糖水消耗與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組糖水消耗值比較

2.2 針刺百會和印堂治療CUMS大鼠多時間點(diǎn)血清代謝組學(xué)的變化

如圖2所示，PCA分析尚不能將針刺組與CUMS組區(qū)分。進(jìn)而采用PLS-DA和OPLS-DA分析。其中OPLS-DA分析能將4組明顯區(qū)分。從排列檢驗中得出該模型不存在過擬合。OPLS-DA載荷圖鑒定出77種差異代謝物。其中28種在CUMS組和針刺3周組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且在治療過程中始終保持升高(F>1)或降低(F<1)的趨勢。見表2。

圖2 代謝組學(xué)分析

表2 4組血清差異代謝物 (n=6)

續(xù)表2

2.3 相關(guān)代謝通路分析

28種差異代謝物與代謝途徑的關(guān)聯(lián)：KEGG和HMDB。確定關(guān)聯(lián)途徑的影響值：MetaboAnalyst 3.0。結(jié)果顯示這些差異代謝物主要參與以下代謝途徑：①D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(谷氨酸，2-氧戊二酸酯)；②丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(N-乙?；?L-天冬氨酸，谷氨酸，檸檬酸鹽，2-氧戊二酸酯)；③甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝(甘氨酸，蘇氨酸)。見圖3(impact factor≥0.2),代謝途徑如圖4所示。

圖3 關(guān)聯(lián)途徑影響值(impact factor≥0.2)

圖4 代謝途徑

3 討論

近年來，隨著抑郁癥給家庭和社會造成的影響日益凸顯，其治療也成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，西藥治療具有短期療效好的優(yōu)勢，但其耐藥性的產(chǎn)生以及副作用是不可忽視的。針刺治療情志病早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期就有記載，《靈樞·癲狂》曰：“癲疾始生，先不樂，頭重痛……取手太陽、陽明、太陰，血變而止。”臨床上抑郁癥采用單純針刺治療效果顯著，百會和印堂為常用穴位[10]。

CUMS大鼠廣泛應(yīng)用于抑郁癥的研究中[11-12]。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，代謝組學(xué)能夠檢測體液中全部的小分子代謝物，并通過分析檢測與模式識別找尋相關(guān)的生理病理變化[13]。本研究觀察針刺治療CUMS大鼠過程中血清代謝組學(xué)的變化，將治療前后具有顯著性差異且在治療過程中始終保持升高或者降低趨勢的代謝物進(jìn)行相關(guān)通路分析。最終有以下6種代謝物：N-乙?；?L-天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、檸檬酸鹽和2-氧戊二酸酯參與3條氨基酸代謝通路。

氨基酸代謝紊亂在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中都起到了至關(guān)重要的作用[14-16]。N-乙酰基-L-天冬氨酸的主要作用是調(diào)節(jié)大腦滲透壓，在神經(jīng)元中合成并為神經(jīng)元損傷的標(biāo)志，是谷氨酸合成途徑中的氨基酸[17]。有研究表明其代謝紊亂與抑郁癥的認(rèn)知障礙有關(guān)[18]。針刺治療CUMS過程中對N-乙?；?L-天冬氨酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，提示針刺在治療抑郁癥的同時可能起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

谷氨酸作為腦中最為豐富的游離氨基酸是主要的興奮性氨基酸。在神經(jīng)元的存活和分化中起主要作用[19]。有研究表明逍遙散通過減輕谷氨酸誘導(dǎo)的額葉皮質(zhì)神經(jīng)元損傷而發(fā)揮抗抑郁作用[20]。右側(cè)海馬谷氨酸/N-乙?；?L-天冬氨酸的比值與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者的創(chuàng)傷負(fù)荷呈正相關(guān)[21]。谷氨酸與N-乙?；?L-天冬氨酸可以作為針刺治療抑郁癥神經(jīng)元保護(hù)相關(guān)機(jī)制的切入點(diǎn)。檸檬酸鹽、2-氧戊二酸酯與谷氨酸和N-乙酰基-L-天冬氨酸共同參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，在針刺治療過程中均呈下降趨勢。提示針刺在治療抑郁癥的過程中對此通路可能具有抑制作用。

蘇氨酸為必須氨基酸，甘氨酸為主要氨基酸，甘氨酸是通過絲氨酸和蘇氨酸等經(jīng)肝臟和腎臟代謝而成[22]。氯胺酮的抗抑郁研究結(jié)果顯示骨骼肌的甘氨酸水平有助于氯胺酮的抗抑郁作用。改善骨骼肌甘氨酸水平可能是抑郁癥治療的新靶點(diǎn)[23]。在抑郁癥的發(fā)病機(jī)理研究中，腸道菌群可能參與誘發(fā)了甘氨酸和蘇氨酸的代謝紊亂[18]。在針刺治療CUMS大鼠過程中，筆者發(fā)現(xiàn)血清蘇氨酸含量持續(xù)下降而甘氨酸持續(xù)上升，提示針刺治療過程中促進(jìn)蘇氨酸的代謝從而加速甘氨酸的生成。

本研究找尋針刺治療抑郁癥過程中血清多時間點(diǎn)相關(guān)差異代謝物，并進(jìn)行通路關(guān)聯(lián)。得出針刺治療CUMS大鼠過程中主要對氨基酸代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。下一步筆者將這些數(shù)據(jù)與同時間點(diǎn)腦組織代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，聯(lián)合中樞與外周為針刺治療抑郁癥提供更加全面的理論依據(jù)。