不同時(shí)間電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心功能、胰島素抵抗的影響及機(jī)制研究*

馬劼旎,吳 松,李 丹，李方文卉，韓永麗,陳 松，趙 敏

(湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430061)

心肌缺血(Myocardial ischemia，MI)是因冠狀動(dòng)脈持續(xù)性缺血缺氧引起，可導(dǎo)致心肌梗死或心力衰竭等損傷，該病發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)。重建冠狀動(dòng)脈血流是該病常規(guī)的臨床治療手段，但恢復(fù)心肌供血及供氧的同時(shí)，心肌組織損傷會(huì)加重，稱為缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia - reperfusion injury，MIRI),在治療心肌缺血中減輕缺血再灌注損傷成為關(guān)鍵因素。針灸預(yù)處理作為針灸治未病的手段之一，具有良好的預(yù)治作用，臨床研究表明，針刺預(yù)處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷，對(duì)其治療具有一定效果，但其機(jī)制尚未完全明確[1-2]。在各種急性心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia - reperfusion injury，MIRI)大鼠模型中，以在體冠狀動(dòng)脈結(jié)扎最為常用，左心功能指標(biāo)能較好反映MIRI對(duì)心臟機(jī)能所造成的影響和心室重構(gòu)的情況[3-4]。亦有研究表明胰島素抵抗是多種代謝疾病的共同病理表現(xiàn)，其參與了MIRI對(duì)心肌損傷的全過程[5]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察左心室心功能指標(biāo)、大鼠血漿內(nèi)β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素的含量及心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)電針預(yù)處理“內(nèi)關(guān)”對(duì)MIRI的保護(hù)作用及時(shí)間規(guī)律進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器 ST-360型酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司);ALC-V8S小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司);BL-420系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);HANS-200型電針治療儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);TGL-10B系列臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.1.2 主要試劑 β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素試劑盒購自北京萊博特利生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只,體質(zhì)量180～220 g，購于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2012-0067]。購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件：動(dòng)物房溫度為20～25℃，相對(duì)濕度(50±10)%，自由進(jìn)食進(jìn)水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)科研中心進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開始實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將60只大鼠隨機(jī)分為6組：對(duì)照組(S組)、模型組(M 組)、電針預(yù)處理0.5 h組(EA1組)、電針預(yù)處理1 h組(EA2組)、電針預(yù)處理2 h組(EA3組)和電針預(yù)處理3 h組(EA4組)。對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)，開胸后暴露心臟不做其他處理；模型組：采用左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，開胸后缺血20 min，再灌注40 min;各電針刺預(yù)處理組：分別于造模前0.5 h、1 h、2 h和3 h選取大鼠雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴進(jìn)行電針，造模方法同模型組。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立

1.3.1 心肌缺血模型制備 將大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉，把大鼠固定于鼠臺(tái)，將其四肢連接電極，心電導(dǎo)連線按右前肢(綠) 、右后肢(黑)和左前肢(紅)相連，進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)[6-7]。剪開其頸部皮膚并暴露氣管，在氣管切口插入導(dǎo)管，使用呼吸機(jī)輔助呼吸。心前區(qū)剪毛并消毒，在左胸骨第3、4肋間暴露心臟，結(jié)扎前降支冠狀動(dòng)脈，打活結(jié)造成缺血模型，并在缺血20 min后，行左冠狀動(dòng)脈缺血再灌注術(shù)。

1.3.2 制備成功標(biāo)志 心電監(jiān)測(cè)中ST段明顯抬高為缺血標(biāo)志；再灌注時(shí)心電圖抬高的ST段下降，且局部有反應(yīng)性充血的現(xiàn)象，即為造模成功[8]。

1.4 電針預(yù)處理方法

除對(duì)照組與模型組外，EA1組、EA2組、EA3組和EA4組針刺預(yù)處理時(shí)間分別為：造模前0.5 h、1 h、2 h和3 h。方法為上述4組大鼠置于鼠臺(tái)，參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》[9]取穴，在前肢內(nèi)側(cè)離腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間取雙側(cè)內(nèi)關(guān)，用0.30 mm×15 mm毫針針刺雙側(cè)穴位，針刺深度約5 mm，接HANS-200電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度為1 mA，電針30 min。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 左心室心功能指標(biāo)的測(cè)定 接入呼吸機(jī)，分離大鼠頸總動(dòng)脈，對(duì)其頸外靜脈和頸動(dòng)脈進(jìn)行插管，連接BL-420系統(tǒng)，待造模成功后，收集各組舒張末期壓力(end-diastolic pressure,LVEDP)、左室收縮期平均壓(left ventricular systolic mean presure,LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.5.2 血漿β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素的測(cè)定 MIRI造模成功后，用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，取2 mL腹主動(dòng)脈血，置于肝素抗凝管中，常溫下在離心機(jī)3 000 r/min離心15 min取得血清，隨后將血清進(jìn)行分離，并按照試劑盒說明書上進(jìn)行操作。

1.5.3 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 將大鼠心肌組織置于緩沖液中進(jìn)行漂洗，使其固定3 h，隨后按照脫水、包埋、固化和切片的步驟，切片厚度為50～100 nm,使用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠舒張末期壓力、左室收縮期平均壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率和左心室內(nèi)壓最大下降速率比較

與S組相比較，M組、EA1組、EA2組、EA3組和EA4組的LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EA1組、EA2組、EA3組和EA4組與M組比較，LVEDP顯著降低，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax水平有所上升(P<0.05)。尤其是EA3組、EA4組對(duì)于LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的影響明顯優(yōu)于EA1組和EA2組(P<0.05)，EA1組和EA2組比較，各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EA3組和EA4組比較，各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠 LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax比較

2.2 各組大鼠β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素比較

與S組相比較，M組、EA1組、EA2組、EA3組和EA4組的β-EP、胰島素、C肽和抵抗素的含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EA1組、EA2 組、EA3組和EA4組與M組比較，能顯著下調(diào)β-EP、胰島素、C肽和抵抗素的表達(dá)(P<0.05)。尤其是EA3組、EA4組對(duì)于β-EP、胰島素、C肽和抵抗素含量的影響明顯優(yōu)于EA1組和EA2組(P<0.05)。EA1組和EA2組對(duì)于β-EP、胰島素、C肽和抵抗素含量的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EA3組和EA4組比較β-EP、胰島素、C肽和抵抗素含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠β-EP、胰島素、C肽和抵抗素比較

2.3 大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(電鏡)

見圖1。S組大鼠心肌肌纖維組織排列較為規(guī)整，心肌細(xì)胞胞質(zhì)充實(shí)，線粒體數(shù)量為正常值，未見明顯異常；M組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為模糊，心肌肌纖維溶解，線粒體腫大，其肌漿網(wǎng)可見明顯擴(kuò)張和腫脹；EA1組、EA2組、EA3組和EA4組的心肌肌纖維排列較為整齊，線粒體有部分腫大，心肌細(xì)胞腫脹減少，其中EA3組和EA4組的心肌纖維排列更為齊整，線粒體結(jié)構(gòu)完整，自噬空泡較少，溶酶體較多。

3 討論

心肌缺血后會(huì)出現(xiàn)左心室重構(gòu)，并逐步發(fā)展為心力衰竭的慢性階段，同時(shí)伴有心功能下降和心室擴(kuò)張[10]。左室舒張末期壓力(end-diastolic pressure,LVEDP)增大表明舒張末期耗能增加，左室收縮期平均壓(Left ventricular systolic mean presure,LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)則反映心肌的收縮能力，四者相結(jié)合能較好地反映心室重構(gòu)的情況[4]。有研究表明，導(dǎo)致心肌缺血患者心功能損傷的因素眾多，其中由MIRI引起的心肌胰島素抵抗可能是導(dǎo)致心功能損傷及患者并發(fā)癥發(fā)生率和病死率增加的重要原因之一，因此降低甚至糾正心肌胰島素抵抗可能對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義[11]。血清C肽水平可反映胰島細(xì)胞貯備功能，其作為有效評(píng)估胰島功能的方法，在一定程度上可反映胰島素抵抗的情況[12]。β-內(nèi)啡肽(β-endorphin，β-EP)屬于內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)，該物質(zhì)在腦神經(jīng)系統(tǒng)中大量存在，在急性冠脈綜合征發(fā)生、發(fā)展的過程中起重要作用，能夠通過調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)來參與心血管活動(dòng)，有研究發(fā)現(xiàn)中樞與外周β-內(nèi)啡肽對(duì)在體大鼠MIRI有保護(hù)作用[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在休息時(shí)β-內(nèi)啡肽可影響胰島素和胰高血糖素水平，從而可能影響運(yùn)動(dòng)過程中葡萄糖的作用，并且血清C肽在運(yùn)動(dòng)過程中水平下降[14]。因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素含量的測(cè)定，來探究胰島素抵抗機(jī)制作用及影響。

心肌缺血屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“胸痹心痛”的范疇，臨床以胸痛、胸悶、短氣、疲乏無力與心律失常等為主要表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)“治未病”的理論，采用電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理的方法防治心肌缺血。針刺預(yù)處理蘊(yùn)含著針灸“治未病”的思想理論，針灸用于預(yù)防疾病稱為“逆針灸”，是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治未病的主要手段之一?！端貑枴ご虩嵴摗分杏涊d：“病雖未發(fā)，見赤色者刺之，名曰治未病?！敝挝床∈侵冈诩膊∥窗l(fā)生之前進(jìn)行防治，其理念與現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)有共通之處，即預(yù)防疾病的發(fā)生優(yōu)先度高于發(fā)病后治療，從而降低疾病的發(fā)病率，提高國民的健康水平?！皟?nèi)關(guān)”穴為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，通于陰維脈，對(duì)于心胸部疾病有良好療效?！夺樉拇蟪伞ぶ尾∫ā吩唬骸皟?nèi)關(guān)：主氣塊，及脅痛，勞熱，瘧疾，心胸痛?！鼻摇夺樉拇蟪伞ぐ朔ń粫?huì)八穴歌》中記載：“公孫沖脈胃心胸，內(nèi)關(guān)陰維下總同”，也提到內(nèi)關(guān)為治療心系疾病的重要穴位之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組比較，電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理可通過降低LVEDP，升高LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax水平，改善左心功能和影響心室重構(gòu)；同時(shí)電針干預(yù)能顯著下調(diào)β-EP、胰島素、C肽和抵抗素的含量，有效調(diào)控胰島素抵抗相關(guān)因子，減少心肌組織的損傷。透射電鏡結(jié)果提示，模型組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為模糊，心肌肌纖維溶解，線粒體腫大，其肌漿網(wǎng)可見明顯擴(kuò)張和腫脹；電針預(yù)處理組的心肌肌纖維排列較為整齊，線粒體有部分腫大，心肌細(xì)胞腫脹減少，其中EA3組和EA4組的心肌纖維排列更為齊整，線粒體結(jié)構(gòu)完整，自噬空泡較少，溶酶體較多，說明電針預(yù)處理可以減輕心肌組織的損傷，保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。其中，電針預(yù)處理2 h組和電針預(yù)處理3 h組對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的改善情況優(yōu)于電針預(yù)處理0.5 h組和電針預(yù)處理1 h組，該結(jié)論提示不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)心肌組織的保護(hù)效應(yīng)具有一定差異。有研究表明針刺預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴3～5 d均能有效降低心肌梗死面積，其中以4 d為佳，但預(yù)處理超過3 d后電針的保護(hù)作用進(jìn)入平臺(tái)期[14]。本實(shí)驗(yàn)電針預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)的選擇為造模前0.5～3 h,可較好發(fā)揮針刺即時(shí)效應(yīng)，避免平臺(tái)期對(duì)保護(hù)效應(yīng)的影響，但由于樣本量較小，針刺預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)的選擇仍需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理能通過調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)及胰島素抵抗相關(guān)因子來保護(hù)受損心肌組織，降低 MIRI 對(duì)心功能的損害，且預(yù)處理的時(shí)間點(diǎn)選擇對(duì)心肌的保護(hù)作用有差異性。本研究筆者從胰島素抵抗的角度討論了電針預(yù)處理對(duì)心肌缺血保護(hù)作用的可能機(jī)制，但由于樣本量和其他條件的限制仍需進(jìn)行深入研究，為臨床心肌缺血的治療提供思路。