重組禽流感病毒三價(jià)滅活疫苗對(duì)鵝的免疫效果評(píng)估試驗(yàn)

肖 杰，陳金仙

(廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東 廣州 511356)

高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由正粘病毒科A型流感病毒中的H5或H7亞型禽流感病毒引起的一種全身性或呼吸性的傳染病，屬于人畜共患病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[1]，常導(dǎo)致感染的家禽群體全部覆滅，甚至是感染人類后導(dǎo)致人的死亡，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和危害人類的健康，而禽流感滅活疫苗是防控該病的關(guān)鍵所在[2]。預(yù)防和控制禽流感最有效的手段就是免疫接種，目前我國(guó)用于禽流感H9N2防控的疫苗多為滅活疫苗，所采用的佐劑多數(shù)為注射用礦物白油佐劑。免疫佐劑是指與抗原同時(shí)或先于抗原使用，能增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)[3]，而白油佐劑是目前獸用佐劑使用最為廣泛的佐劑。主要由礦物油、Span-80與硬脂酸鋁加熱溶解后形成的淡黃色油狀液體，與抗原乳化成W/O型乳液。它可以延緩免疫原在機(jī)體內(nèi)的存留時(shí)間，使之持續(xù)緩慢釋放，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。目前，白油Span佐劑雖然存在礦物油不可代謝的一些副作用，但由于出色的免疫效果，以及成本優(yōu)勢(shì)，在獸用佐劑中無(wú)可替代。油乳劑滅活疫苗由于其具有完整的免疫原性和無(wú)毒力返祖現(xiàn)象，并且具有免疫效力高，使用安全，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，受到了廣大養(yǎng)殖戶的青睞。因此，注射用礦物白油作為一種佐劑被廣泛地應(yīng)用于禽用滅活疫苗生產(chǎn)中。但是，不同廠家生產(chǎn)的注射用礦物白油佐劑黏度和純度等質(zhì)量不一，其應(yīng)激、免疫吸收和抗體消長(zhǎng)效果差異較大，直接影響著疫苗的免疫效果[4]。因而選擇佐劑時(shí)不僅要考慮其免疫促進(jìn)作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當(dāng)比例配制后疫苗的黏度、穩(wěn)定性等是否符合要求[5]。礦物白油佐劑在獸用滅活疫苗上的應(yīng)用研究開(kāi)始于上世紀(jì)80年代，對(duì)預(yù)防控制畜禽重大疫病的傳播起到重要作用[6]。注射用礦物白油，其配制的滅活疫苗的共性問(wèn)題是：如果注射用礦物白油的運(yùn)動(dòng)黏度系數(shù)高，則制備的滅活疫苗在免疫注射過(guò)程中出現(xiàn)黏稠度較大、注射困難、毒副反應(yīng)較強(qiáng)(過(guò)敏)、引起注射部位紅腫、化膿、吸收慢、殘留量高，導(dǎo)致免疫動(dòng)物生產(chǎn)和生長(zhǎng)發(fā)育性能顯著下降等現(xiàn)象；運(yùn)動(dòng)黏度系數(shù)過(guò)低，則制備的滅活疫苗在免疫注射過(guò)程中出現(xiàn)黏稠度較小、吸收過(guò)快、毒副反應(yīng)較強(qiáng)(過(guò)敏)，黏度過(guò)高過(guò)低均會(huì)引起大的應(yīng)激問(wèn)題，其本質(zhì)與礦物白油佐劑的內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)[7]。

為提高禽流感滅活疫苗的質(zhì)量水平，本試驗(yàn)采用了三種不同白油配制的禽流感滅活疫苗對(duì)肉鵝進(jìn)行免疫效果綜合評(píng)估試驗(yàn)，為禽流感滅活疫苗選擇合適的白油來(lái)配苗和對(duì)鵝的免疫方式提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 廣東省廣州市花都區(qū)紅領(lǐng)巾農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖的同批次60日齡的鵝，共100羽進(jìn)行免疫試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)疫苗 由廣東永順生物制藥股份有限公司生產(chǎn)的三批試驗(yàn)疫苗，每批試驗(yàn)疫苗均采用不同的白油佐劑進(jìn)行配制，疫苗分別為試2020004批，試2020005批和試2020006批三批試驗(yàn)疫苗。分別編為A、B、C三組對(duì)鵝進(jìn)行免疫。三組試驗(yàn)疫苗使用的白油佐劑占比如表1。

表1 A、B、C三組苗白油佐劑占比

1.3檢驗(yàn)試劑 H5N1Re-11標(biāo)準(zhǔn)抗原(批號(hào)：20180823)、 H5N1Re-12標(biāo)準(zhǔn)抗原(批號(hào)：20180823)、H7N9H7-Re2標(biāo)準(zhǔn)抗原(批號(hào)：20180823)、H5N1Re-11標(biāo)準(zhǔn)抗病毒血清(批號(hào)2019004)、H5N1Re-12標(biāo)準(zhǔn)抗病毒血清(批號(hào)2019004)和H7N9H7-Re2標(biāo)準(zhǔn)抗病毒血清(批號(hào)2019004)均購(gòu)置于哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

健康公雞心臟血(無(wú)AI抗體)，配制洗滌用的1%紅細(xì)胞懸液，由廣東永順生物制藥有限公司生物實(shí)驗(yàn)室制備。

2 試驗(yàn)方法

2.1試驗(yàn)動(dòng)物分組 把100羽60日齡的鵝隨機(jī)分成10組，平均每組10羽。用疫苗A、B、C對(duì)三組鵝分別進(jìn)行腿部肌肉注射，注射劑量為1 mL/羽，注射完畢后，將這三組鵝分別對(duì)應(yīng)編組為A1、B1、C1，同理，對(duì)進(jìn)行胸部肌肉注射的三組鵝分別對(duì)應(yīng)編組為A2、B2、C2；進(jìn)行頸部皮下注射的三組鵝分別對(duì)應(yīng)編組為A3、B3、C3。最后一組鵝則注射1 mL的生理鹽水作為對(duì)照組。

2.2臨床觀察 對(duì)注射疫苗后鵝的表現(xiàn)狀況進(jìn)行觀察，并詳細(xì)記錄鵝的飲食狀況、精神狀況、有無(wú)免疫反應(yīng)副作用等。

2.3樣品采集

2.3.1在免疫前隨機(jī)抽取30羽鵝進(jìn)行采血分離血清測(cè)定免疫前的HI抗體，并稱重計(jì)算每組鵝的平均體重。

2.3.2分別在免疫后21 d、28 d和35 d對(duì)每組鵝進(jìn)行稱重并計(jì)算平均重和均增重，然后對(duì)每組鵝進(jìn)行采血，分離血清測(cè)定HI抗體，同時(shí)每組每次取2羽鵝剖檢觀察注射部位的疫苗吸收狀況。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1免疫后鵝的死亡情況見(jiàn)表2。

表2 免疫后鵝的死亡情況

三組疫苗在腿部肌肉注射后的存活率均為100%，A、B疫苗在胸部和頸部肌肉注射的存活率分別為100%、100%、而C疫苗在胸部和頸部肌肉注射的存活率均為90%。

3.2免疫后增重見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，各免疫組與對(duì)照組的體重增長(zhǎng)基本無(wú)太大的差距，注射疫苗后疫苗接種組和沒(méi)有接種疫苗組鵝群的精神狀態(tài)無(wú)顯著差異(P>0.05)，免疫鵝精神食欲良好，無(wú)不良反映。

不同白油佐劑制備的疫苗在“腿部肌肉注射”的增重排序B1>C1>A1；不同白油佐劑制備的疫苗在“胸部肌肉注射”的增重排序A2>C2>B2；不同白油佐劑制備的疫苗在“頸部皮下注射”的增重排序C3>B3>A3；其中B2組的鵝在免后21 d狀態(tài)不佳，部分鵝有嘔吐粘液，所以B2組的鵝體重增長(zhǎng)最差。

表3 免疫后鵝的增重情況

3.3鵝血清HI-GMT(nlog2)抗體結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4和圖1。

圖1 A、B、C三組試驗(yàn)苗免疫后鵝血清HI-GMT抗體變化

肉鵝在免疫前，H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7N9H7-Re2幾何平均抗體滴度均達(dá)到4log2 以上，說(shuō)明這批試驗(yàn)肉鵝有著比較強(qiáng)的母源性抗體。對(duì)禽流感疫苗免疫肉鵝21 d后，H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7N9H7-Re2的幾何平均抗體滴度均達(dá)到6log2 以上，符合中華人民共和國(guó)重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活疫苗(H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re2株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程的要求。

在整個(gè)免疫期，三種抗體水平綜合評(píng)估由高到低分別是：B>C>A。不同免疫途徑的抗體水平由高到低分別是：頸部皮下注射>腿部肌肉注射>胸部肌肉注射。

表4 免疫后鵝血清HI-GMT抗體水平

圖2 免疫21 d后頸部皮下、腿部肌肉和胸部肌肉(自左至右)解剖情況

3.4解剖觀察疫苗的吸收情況 免后21 d，頸部皮下和腿部肌肉有少量疫苗殘留，而胸部肌肉基本無(wú)疫苗殘留；免疫28 d后均無(wú)疫苗殘留痕跡。

4 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明三種白油佐劑制備的重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活疫苗安全性和免疫效果都很好。肉鵝對(duì)疫苗的吸收從優(yōu)到差分別是：A>B>C；不同免疫途徑肉鵝對(duì)疫苗的吸收從優(yōu)到差分別是：胸部肌肉注射>腿部肌肉注射>頸部皮下注射。肉鵝免疫后存活率從高到低分別是：B=A>C；不同免疫途徑肉鵝免疫后存活率從高到低分別是：腿部肌肉注射>胸部肌肉注射=頸部皮下注射。疫苗使肉鵝產(chǎn)生HI抗體水平整體由高到低為：B>C>A。不同免疫途徑肉鵝免疫后產(chǎn)生HI抗體水平從高到低分別是：頸部皮下注射>腿部肌肉注射>胸部肌肉注射。

綜合評(píng)估B組(試2020005批)疫苗即使用100%道達(dá)爾EOLANE150：D3901F29白油佐劑制備的重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活疫苗對(duì)肉鵝的安全性和免疫效果最好，且最優(yōu)的免疫途徑頸部皮下注射能更好地使肉鵝產(chǎn)生更高滴度的HI抗體和降低肉鵝對(duì)疫苗產(chǎn)生的免疫副反應(yīng)。