雷公藤甲素對(duì)2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用

扶玉珍 姚方輝

（1 湖北醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2 十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院）普外科，十堰 442000）

糖尿病性耳聾是一種以高頻聽(tīng)力下降為主的感音神經(jīng)性耳聾，長(zhǎng)期高血糖及糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）的不斷聚積導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可激活多種凋亡信號(hào)通路造成耳蝸毛細(xì)胞的不可逆性損害[1]。雷公藤甲素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。雷公藤甲素對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用[5]，但是雷公藤甲素對(duì)糖尿病耳蝸毛細(xì)胞的影響研究較少。本研究建立了2型糖尿病小鼠模型，觀察雷公藤甲素對(duì)2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用并探討了其作用機(jī)制，旨在為糖尿病耳蝸病變的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

雷公藤甲素（購(gòu)于成都普思生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma 公司）；小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（上海朗頓有限公司）；琥珀酸鈉（武漢博士德生物工程有限公司）；氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT（美國(guó)Amresco 公司）；磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphoextracellular signal-regulated kinase，p-ERK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)p-ERK 的總蛋白（ERK）、E2 核因子相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor-2，Nrf2）、硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）及p-JNK、cleaved-caspase-3 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司）；

1.2 2型糖尿病小鼠模型建立及給藥方法

SPF級(jí)Balb/c雄性小鼠，4～5周，體質(zhì)量22～25 g，（湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心）。隨機(jī)分為正常組（Control）、糖尿病組（T2DM）和雷公藤甲素組（T2DM+TPL），每組10只。3組均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。1 周后對(duì)照組喂以基礎(chǔ)飼料，2型糖尿病模型組喂以高脂高糖飼料（48.50%基礎(chǔ)飼料，20.00%蔗糖，20.00%蛋黃粉，10.00%熟豬油，1.00%膽固醇，0.50%脫氧膽酸鈉）[6]。各組喂養(yǎng)相應(yīng)飼料4 周后均禁食不禁水12 h，2型糖尿病模型組1%鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg 腹腔注射1次，1 周后相同條件下2型糖尿病模型組第2次腹腔注射STZ 40 mg/kg。對(duì)照組相對(duì)應(yīng)腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。于第2次STZ 注射后每隔5 d 小鼠尾靜脈取血測(cè)空腹血糖值（FBG），監(jiān)測(cè)血糖及體質(zhì)量。并采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定小鼠胰島素（FINS）水平，按小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。以小鼠尾靜脈空腹血糖值大于11.1 mmol/L 及出現(xiàn)胰島素抵抗為建模成功[7]。2型糖尿病動(dòng)物模型建立成功后1 周，雷公藤甲素組小鼠給予雷公藤甲素 0.1 mg/kg 灌胃，連續(xù)治療6周，正常組和糖尿病組小鼠每天給予等體積生理鹽水灌胃1次。

1.2 耳蝸基底膜琥珀酸脫氨酶（SDH）染色及耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)

4%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后4～5 min，在解剖顯微鏡下用解剖鑷迅速開(kāi)顱，打開(kāi)聽(tīng)泡取出耳蝸，用細(xì)針尖挑破圓窗膜及摘除鐙骨，開(kāi)放前庭窗和圓窗。從蝸?lái)斻@一小孔，將NBT 工作液（0.05 mol/L 琥珀酸鈉溶液，0.05 mol/L 磷酸緩沖液，0.1%NBT 按1：1：2 配制）從圓窗內(nèi)緩慢灌入耳蝸內(nèi)，可見(jiàn)工作液從蝸?lái)數(shù)男】變?nèi)流出，即為耳蝸蝸管內(nèi)灌注成功，繼之將耳蝸置于該NBT工作液中37℃孵育1 h；將耳蝸置于10%福爾馬林內(nèi)室溫固定2 d，再將耳蝸放于7% EDTA 二鈉脫鈣液中（pH6.9），室溫下直到耳蝸軟化。體視顯微鏡下分離耳蝸基底膜，平鋪基底膜于滴有甘油的載玻片上，覆蓋蓋玻片封片。最后，將基底膜鋪片置于光學(xué)顯微鏡下（放大200倍）以相等的距離200 μm 從耳蝸?lái)敾刂恋谆厝?5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行活外（OHC）、活內(nèi)（IHC）毛細(xì)胞計(jì)數(shù)（n=3），統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 小鼠耳蝸中氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路、抗氧化蛋白分子及凋亡分子的蛋白表達(dá)檢測(cè)

分離耳蝸組織，加入裂解液提取總蛋白，進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)后，進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，PBS 洗滌3次，加入脫脂牛奶封閉1 h，然后加入ERK、p-ERK、Nrf2、Trx 和p-JNK、cleaved-caspase-3 的一抗，室溫孵育過(guò)夜，第2 天應(yīng)用 TBST 洗滌3次。并加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，應(yīng)用TBST 進(jìn)行3次洗膜。最后進(jìn)行熒光顯色操作。ECL 發(fā)光法進(jìn)行顯影并采集圖像，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò) SPSS 19.0 for Windows 軟件，先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，行t檢驗(yàn)及單向方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 FBG 與HOMA-IR 監(jiān)測(cè)

結(jié)果顯示（圖1），糖尿病模型小鼠第2次STZ腹腔注射第5天，F(xiàn)GB及HOMA-IR均值與正常組（5.86±0.64）mmol/L、2.58±0.21相比開(kāi)始升高（8.15±0.82）mmol/L、3.96±0.22，HOMA-IR的變化與FGB呈正相關(guān)。至ST 注射后第20天，糖尿病小鼠模型建立成功，此時(shí)糖尿病組小鼠FGB、HOMA-IR 基本達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)（11.15±1.82）mmol/L、5.14±0.36。至STZ 注 射后第35天，糖尿病組FBG 和HOMA-IR值達(dá)實(shí)驗(yàn)最高值（32.60±0.73）mmol/L，17.10±0.25。

2.2 各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)及缺失數(shù)量

耳蝸基底膜SDH 染色觀察（圖2），T2DM 小鼠耳蝸毛細(xì)胞與正常Control組相比，體積減小，數(shù)量減少，排列不規(guī)則。耳蝸?lái)敾刂恋谆叵嗟染嚯x（200 μm）內(nèi)、外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，糖尿病組小鼠耳蝸毛細(xì)胞與正常組相比，外毛細(xì)胞缺失顯著（P＜0.01），內(nèi)毛細(xì)胞亦有減少（P＜0.05），說(shuō)明2型糖尿病耳蝸毛細(xì)胞退化，且以底回外毛細(xì)胞損傷為主（圖 2）。雷公藤甲素 0.1 mg /kg 處理后T2DM+TPL組與T2DM組相比，內(nèi)、外毛細(xì)胞數(shù)量均有不同程度增加（P＜0.05），提示雷公藤甲素可以減輕2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷，對(duì)毛細(xì)胞退化起保護(hù)作用。

2.3 各組小鼠p-ERK/Nrf2/Trx 蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖3），T2DM組和T2DM+TPL組小鼠耳蝸中Trx、Nrf2 和p-Erk 的蛋白表達(dá)量有不同程度低于對(duì)照組，且T2DM組低于T2DM+TPL組（相應(yīng)P值為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。而T2DM組和T2DM+TPL組小鼠耳蝸中p-JNK 的蛋白表達(dá)量均有不同程度的高于對(duì)照組，且T2DM組高于T2DM+TPL組（P＜0.01）。各組小鼠ERK、JNK 的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 FBG 與HOMA-IR 分析

圖2 各組小鼠耳蝸基底膜SDH 染色鋪片（A-C，×200）及耳蝸外毛細(xì)胞（D）、內(nèi)毛細(xì)胞（E）計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

2.4 各組小鼠凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖4），T2DM組和T2DM+TPL組小鼠耳蝸中cleaved-caspase-3 的蛋白表達(dá)量有不同程度的高于對(duì)照組，且T2DM組高于T2DM+TPL組（P＜0.01）。

3 討論

神經(jīng)退行性病變是一種緩慢進(jìn)展性疾病，包括糖尿病性耳聾、視網(wǎng)膜色素變性、帕金森病等，主要病理變化是神經(jīng)元的退行性變性和凋亡。其發(fā)病機(jī)制研究表明，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)度氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧化還原失衡在神經(jīng)元損傷、死亡中起重要作用[8-9]。2型糖尿病長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致晚期AGEs生成增加，AGEs通過(guò)與其主要的受體RAGEs結(jié)合產(chǎn)生大量ROS促發(fā)氧化應(yīng)激[10-11]。許多研究表明ROS在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)病過(guò)程中起著不可忽視的作用[12]。耳蝸內(nèi)有用來(lái)滅活自由基的高水平的抗氧化酶類(lèi)，其中硫氧還蛋白Trx與硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及NADPH 共同構(gòu)成硫氧還蛋白系統(tǒng)（Trx系統(tǒng)）。Trx系統(tǒng)在清除體內(nèi)過(guò)量ROS的過(guò)程中起到了非常重要的作用[13]，消除耳蝸處于自由基的高代謝水平。另一方面，外毛細(xì)胞側(cè)面含有的獨(dú)特結(jié)構(gòu)（囊腔結(jié)構(gòu)）是氧自由基產(chǎn)生的關(guān)鍵場(chǎng)所及受累的部位[14]。ROS增加導(dǎo)致毛細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡及丟失[15]。Cleaved-caspase-3表達(dá)水平的高低直接反映細(xì)胞凋亡程度[16-17]。

Keap1-Nrf2-ARE 通路是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的一個(gè)最重要的抗氧化防御機(jī)制之一，在生理狀態(tài)下，胞質(zhì)中Keap1-Nrf2 與核心泛素結(jié)構(gòu)CUI3-Rbx1 相互作用，Keap1 作為E3 泛素連接酶，靶向引導(dǎo)Nrf2 的泛素化和降解[18]。氧化應(yīng)激時(shí)Nrf2 被磷酸化或者Keap1 的構(gòu)象發(fā)生變化，Nrf2 核轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)下游抗氧化蛋白的表達(dá)。研究表明Nrf2-ARE 途徑調(diào)節(jié)了Trx 和TrxR 的基因表達(dá)[19]。

圖3 各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)抗氧化分子蛋白電泳圖（A）；B：Trx 蛋白表達(dá)的IOD值分析；C：Nrf2 蛋白表達(dá)的IOD值分析；D：p-JNK蛋白表達(dá)的IOD值分析；E：p-ERK蛋白表達(dá)IOD值分析；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖4 各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)凋亡分子蛋白電泳圖（A）和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)的IOD值分析（B）；＊＊P＜0.01

凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1），屬于絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）家族成員，c-jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是ASK1 下游的重要凋亡分子。ASK1-JNK信號(hào)通路是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

正常條件下Trx與Ask1的N末端結(jié)合形成Trx-ASK1 復(fù)合物抑制Ask1 的活性及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在氧化應(yīng)激時(shí)，Trx 從Trx-Ask1 的復(fù)合物中釋放，活化的Ask1 激活下游凋亡信號(hào)通路，引起細(xì)胞凋亡和炎癥[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)Trx 通過(guò)其氧化還原作用抑制凋亡信號(hào)途徑，從而對(duì)視網(wǎng)膜起到神經(jīng)保護(hù)作用[21]。

本研究結(jié)果表明，糖尿病組小鼠耳蝸毛細(xì)胞與正常組比較體積小、數(shù)量少，排列松散且不規(guī)則；Trx表達(dá)降低，而凋亡分子cleaved-caspase-3表達(dá)升高。提示糖尿病長(zhǎng)期高血糖及AGEs 聚積所致的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)退行性變性和凋亡，引起耳蝸毛細(xì)胞損傷。同時(shí)抗氧化相關(guān)信號(hào)通路Nrf2/Erk1/2 被抑制，而JNK信號(hào)通路被激活。

同時(shí)，雷公藤甲素組小鼠耳蝸毛細(xì)胞與糖尿病組比較體積增大，數(shù)量增多，排列規(guī)則；耳蝸組織中的抗氧化分子ERK 磷酸化、Nrf2、Trx表達(dá)升高，JNK 磷酸化和凋亡分子cleaved-caspase-3表達(dá)降低。表明雷公藤甲素可通過(guò)激活 p-ERK 和Nrf2 /Trx 抗氧化信號(hào)通路，抑制JNK信號(hào)減輕糖尿病高血糖所致的耳蝸毛細(xì)胞氧化應(yīng)激延緩耳蝸毛細(xì)胞的凋亡，對(duì)耳蝸毛細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，雷公藤甲素能減輕糖尿病耳蝸毛細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能調(diào)控了ERK、JNK 和Nrf2信號(hào)通路有關(guān)，有望成為治療2型糖尿病耳蝸毛細(xì)胞損傷的有效藥物。