胺碘酮對(duì)大鼠睪丸形態(tài)和功能的影響及其作用機(jī)制*

胡文芳 劉 飄 吳洪潤 李 洋 胡媛媛 楊 丹

（貴州醫(yī)科大學(xué)，1 藥學(xué)專業(yè)2017級(jí)本科生，2 全科醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級(jí)研究生，3 全科醫(yī)學(xué)專業(yè)2017級(jí)研究生，4 外科學(xué)教研室，貴陽 550004）

胺碘酮作為一種廣譜抗心律失常藥，屬Ⅲ類抗心律失常藥物，是當(dāng)前最常用的抗心律失常藥物之一[1]。胺碘酮具有轉(zhuǎn)復(fù)房顫，改善竇性心律的作用，可通過延長(zhǎng)旁道的不應(yīng)期治療預(yù)激綜合征伴房顫，治療效果安全有效。胺碘酮對(duì)心肌具有保護(hù)效應(yīng)，通過降低血壓及竇房自律性來減輕心肌耗氧量及外周阻力，使心力衰竭患者心功能改善。但胺碘酮對(duì)男性生殖系統(tǒng)有損害，Gasparich等[2]臨床觀察發(fā)現(xiàn)胺碘酮可導(dǎo)致附睪炎及性功能障礙。Nikolaou等[3]報(bào)道隨胺碘酮?jiǎng)┝吭黾?，其可在附睪積累。國內(nèi)外雖已經(jīng)就胺碘酮對(duì)大鼠睪丸的影響進(jìn)行了一定的研究，但胺碘酮對(duì)睪丸組織的具體影響及其機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過對(duì)雄性大鼠灌胃給予胺碘酮連續(xù)用藥，研究胺碘酮對(duì)大鼠睪丸質(zhì)量、形態(tài)、酶活性的影響，探討胺碘酮對(duì)睪丸及男性生殖功能的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

30只8周齡健康成年雄性SD大鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量220～260 g。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（0 mg·kg-1·d-1）、低劑量組（20 mg·kg-1·d-1）和高劑量組（200 mg·kg-1·d-1），每組10只。采取灌胃方式給予葡萄糖胺碘酮溶液，灌胃量為1.0 mL/kg（每周測(cè)量體質(zhì)量），每天分2次給藥，連續(xù)給藥4 周。每日觀察動(dòng)物的精神、飲食、毛色及活動(dòng)等一般情況。

1.2 測(cè)定大鼠睪丸質(zhì)量

在對(duì)大鼠末次給藥24 h，使用10%水合氯醛麻醉后脫頸法處死大鼠?？焖俳馄嗜〕鲭p側(cè)睪丸及附睪，分離周圍脂肪組織，漂洗，將睪丸進(jìn)行稱重。

1.3 精液樣本制備及精子活力測(cè)定

取出右側(cè)附睪組織為標(biāo)本，用眼科剪刀剪開，將精液加入生理鹽水1 mL 稀釋，制作成精子懸液，把稀釋后的精子懸液制作精子涂片，低倍鏡下選擇合適視野，要求保持精子清晰可見、無明顯重疊區(qū)域；然后在高倍鏡（400倍）下觀察精子活力。

1.4 睪丸組織病理學(xué)觀察

睪丸組織經(jīng)4%甲醛液給予固定12 h，轉(zhuǎn)至30%蔗糖溶液脫水24 h，經(jīng)用OCT 包埋劑包埋樣本，冰凍切片，蘇木精-伊紅（H-E）染色法進(jìn)行染色，再應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠睪丸組織形態(tài)改變，且拍照保存。

1.5 睪丸組織勻漿制備

稱量大鼠睪丸組織質(zhì)量后再將睪丸組織剪碎，按照質(zhì)量比例為1∶9 加入生理鹽水，制備成10%的睪丸組織勻漿，取勻漿上清液待行酶活性檢測(cè)。

1.6 睪丸組織乳酸脫氫酶（LDH）活性、琥珀酸脫氫酶（SDH）活性、一氧化氮合酶（NOS）活性和一氧化氮（NO）含量的測(cè)定

分別按照LDH 試劑盒、SDH 試劑盒、NOS 試劑盒和NO 試劑盒檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-Way ANOVA）。采用SNK 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胺碘酮對(duì)大鼠一般情況的影響

對(duì)照組大鼠被毛光澤，飲食、活動(dòng)正常。給藥后，高劑量組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)灰暗、活動(dòng)減少現(xiàn)象，但攻擊性行為增強(qiáng)。

2.2 胺碘酮對(duì)大鼠睪丸質(zhì)量的影響

對(duì)照組、低劑量組、高劑量組睪丸質(zhì)量分別為（3.42±0.25）g、（3.35±0.32）g、（3.22±0.28）g，低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 胺碘酮對(duì)大鼠精子活力的影響

對(duì)照組、低劑量組、高劑量組精子活動(dòng)分別為（58.12±12.58）%、（51.36±11.25）%、（42.64±13.20）%，低劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 胺碘酮對(duì)大鼠睪丸組織形態(tài)的影響

對(duì)照組大鼠睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)完整，生精上皮完整，層次較清晰（圖1A）；低劑量組大鼠睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)完整，生精上皮細(xì)胞排列較規(guī)則（圖1B）；高劑量組大鼠睪丸部分曲細(xì)精管外壁出現(xiàn)褶皺，生精上皮細(xì)胞排列不規(guī)則（圖1C）。

2.5 胺碘酮對(duì)大鼠睪丸組織LDH活性的影響

對(duì)照組、低劑量組、高劑量組睪丸組織LDH活性分別為（1 023.34±102.41）、（992.18±98.56）、（978.45±106.25）U/gport，低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 胺碘酮對(duì)大鼠睪丸組織SDH活性的影響

對(duì)照組、低劑量組、高劑量組睪丸組織SDH活性分別為（15.72±2.21）、（14.86±1.74）、（14.21+1.96）U/mgprot，低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.7 胺碘酮對(duì)大鼠睪丸組織NOS活性的影響

對(duì)照組、低劑量組、高劑量組睪丸組織NOS活性分別為（2.92±0.28）、（3.11±0.27）、（3.40±0.46）U/mgprot，低劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠睪丸組織形態(tài)觀察，H-E染色，×400

2.8 胺碘酮對(duì)大鼠睪丸組織NO含量的影響

對(duì)照組、低劑量組、高劑量組睪丸組織NO含量分別為（2.72±0.21）、（2.84±0.16）、（3.02±0.30）μmol/gprot，低劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

3.1 胺碘酮對(duì)大鼠一般情況、睪丸質(zhì)量及形態(tài)的影響

本研究表明高劑量胺碘酮對(duì)成年雄性大鼠的一般狀況可產(chǎn)生消極影響，主要表現(xiàn)為高劑量組大鼠普遍精神狀態(tài)欠佳、活動(dòng)減少，原因可能是胺碘酮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)[4]的副作用所致。范甜甜等[5]對(duì)小鼠施加農(nóng)達(dá)（200 mg/kg）藥物后，顯示睪丸及附睪質(zhì)量均明顯下降，農(nóng)達(dá)對(duì)睪丸有損傷效應(yīng)；據(jù)報(bào)道高脂飲食會(huì)使睪丸質(zhì)量下降，是由于高脂飲食誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡[6]。本研究表明胺碘酮對(duì)睪丸質(zhì)量沒有明顯影響，考慮可能是胺碘酮實(shí)驗(yàn)作用時(shí)間較短的原因；高劑量組大鼠睪丸部分曲細(xì)精管外壁出現(xiàn)褶皺，生精上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，其具體機(jī)制國內(nèi)外未見報(bào)道，本課題將進(jìn)一步研究。

3.2 胺碘酮對(duì)LDH、SDH 的影響

睪丸組織內(nèi)存在有多種酶，其中LDH、SDH是參與睪丸代謝的重要酶。LDH 主要參與糖酵解和糖異生過程中催化乳酸和丙酮酸之間氧化還原反應(yīng)[7]，通過催化丙酮酸接受酰胺嘌呤二核苷酸中的氫轉(zhuǎn)化為乳酸，產(chǎn)生氧化狀態(tài)的輔酶Ⅰ（NAD），形成酸性內(nèi)環(huán)境和提升糖酵解速率，從而維持糖酵解ATP 的持續(xù)生成，使細(xì)胞進(jìn)行糖酵解[8]。據(jù)報(bào)道睪丸損傷后，LDH 活性顯著降低[9]。本研究表明胺碘酮對(duì)睪丸內(nèi)LDH 沒有產(chǎn)生明顯影響，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。SDH 屬于細(xì)胞色素氧化酶，是三羧酸循環(huán)中唯一一個(gè)整合于線粒體內(nèi)膜上的多亞基酶，為連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一[10]。在睪丸中，SDH 主要分布在睪丸曲細(xì)精管生精細(xì)胞的線粒體內(nèi)，可把果糖轉(zhuǎn)化為山梨醇，再轉(zhuǎn)化為葡萄糖，供應(yīng)能量消耗，對(duì)睪丸成熟、精子能量代謝、功能成熟和形態(tài)完善起重要作用。據(jù)報(bào)道SDH 活力降低可造成精子成熟障礙[11]。本研究表明胺碘酮對(duì)睪丸內(nèi)SDH 沒有產(chǎn)生明顯影響，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 胺碘酮對(duì)NOS、NO 及精子活力的影響

NOS 廣泛分布于動(dòng)物睪丸、附睪、輸精管和前列腺中[12]。睪丸NOS 活性是判斷藥物對(duì)雄性大鼠睪丸生殖毒性的較敏感指標(biāo)。NOS 參與睪丸微動(dòng)脈血流調(diào)節(jié)、精子發(fā)生過程及睪酮分泌，并且在精子的退化和凋亡中也具有重要作用[13]。NO 是一種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要信使分子，參與細(xì)胞內(nèi)重要的生理和病理活動(dòng)。NO 是一種重要的炎癥遞質(zhì)，在病理狀態(tài)下，通過脂多糖、干擾素等炎癥趨化因子，與線粒體內(nèi)氧自由基等反應(yīng)生成活性氮氧化合物，作用于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA 等大分子物質(zhì)，抑制呼吸鏈傳導(dǎo)，抑制ATP 的合成，抑制DNA 合成，造成細(xì)胞DNA 損傷，從而引起細(xì)胞凋亡[14]。NO可直接或間接損傷雄性生殖系統(tǒng)，使精子運(yùn)動(dòng)能力及速率減慢，影響精子發(fā)生和獲能過程[15]。本研究表明高劑量胺碘酮引起睪丸細(xì)胞NOS 活性增高，進(jìn)一步使睪丸組織生成NO 的能力增強(qiáng)。增加的NO 結(jié)構(gòu)上具有活性很強(qiáng)的自由基，增強(qiáng)了細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，生成細(xì)胞毒性更大的過氧亞硝酸根，誘發(fā)睪丸細(xì)胞壞死和凋亡[16]。本研究結(jié)果表明高劑量胺碘酮導(dǎo)致精子活力降低，其可能的原因是睪丸組織NO 作用于正常生理狀態(tài)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使血管擴(kuò)張，血流量增加[17]，微循環(huán)得到改善，使細(xì)胞毒性物質(zhì)的毒性作用減少；但由于高劑量胺碘酮引起睪丸細(xì)胞NOS 活性增高，使睪丸組織生成NO 的能力增強(qiáng)，造成血管持續(xù)舒張，組織耗氧量和細(xì)胞通透性增加，加重生殖系統(tǒng)的器官和組織的缺氧程度，降低細(xì)胞內(nèi)ATP 水平，抑制能量的生成，最終造成生殖系統(tǒng)的損傷及功能障礙。另外，精子富含不飽和脂肪酸[18-19]，易受NO 引起的脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞膜的損傷，抑制精子的活力，導(dǎo)致精子功能障礙。

綜上所述，高劑量胺碘酮導(dǎo)致成年雄性大鼠睪丸形態(tài)改變、NOS 活性增高、NO含量增加，精子活力下降，從而影響男性生殖功能。