海藻酸鈉-納米纖維素膠粒對(duì)乳酸菌胃腸液耐受性的影響

陳秉彥，林曉姿，李維新，林曉婕，鄭寶東，何志剛,*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

近年來(lái)，乳酸菌作為一種功能性益生菌，被廣泛用于發(fā)酵果汁以及各種奶制品（軟硬奶酪、冰淇淋、酸奶、冷凍乳制品甜點(diǎn)）加工。乳酸菌不僅賦予食品特殊的發(fā)酵風(fēng)味，同時(shí)也通過(guò)改善腸道微生物群落平衡，有效抑制有害菌生長(zhǎng)從而有益于宿主健康[1]。有研究表明，至少需要106～107CFU/g的乳酸菌定植于腸道才可以發(fā)揮其對(duì)人體的益生效應(yīng)[2]。然而，人體攝入活性乳酸菌產(chǎn)品時(shí)，菌體在經(jīng)過(guò)低pH值胃酸以及高膽汁酸鹽腸液環(huán)境后活性損失相當(dāng)嚴(yán)重。因此，如何提高乳酸菌在胃腸液中的耐受性受到越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。

微膠囊化是保護(hù)益生菌的有效方法，微膠囊將菌體與外界逆環(huán)境隔離，減少了不利因子對(duì)乳酸菌的干擾及破壞，增加了乳酸菌的穩(wěn)定性。海藻酸鈉的價(jià)格低廉、凝膠條件溫和并具有良好的生物相容性，含有的α-L-古洛糖醛酸可與二價(jià)陽(yáng)離子作用形成“蛋盒”凝膠結(jié)構(gòu)[3]。許多研究都報(bào)道了海藻酸鈉可通過(guò)擠壓滴入法包埋乳酸菌，海藻酸鈉的濃度[4]、分子質(zhì)量與α-L-古洛糖醛酸比例[5]以及交聯(lián)劑[6]都會(huì)改變微膠囊膠粒的尺寸與機(jī)械強(qiáng)度，從而影響乳酸菌的包埋率及保護(hù)效果。然而，海藻酸鈉膠粒表面粗糙、呈現(xiàn)出部分孔狀結(jié)構(gòu)，易受外界環(huán)境因素影響導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度下降[7]，限制了它在食品以及醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。目前，通過(guò)海藻酸鈉與高分子聚合物進(jìn)行復(fù)配凝膠的方式，是修飾海藻酸鈉膠粒結(jié)構(gòu)、提高其機(jī)械強(qiáng)度的有效方法。

納米纖維素是直徑為納米尺寸、具有一定長(zhǎng)徑比的線性或顆粒狀高分子聚合物。根據(jù)微觀形態(tài)的差異，可分為纖維素納米微晶（cellulose nanocrystal，CNC）以及纖維素納米微纖絲（cellulose nanofibrils，CNF）。納米纖維素已被證實(shí)具有多羥基結(jié)構(gòu)[8-9]，可通過(guò)非共價(jià)作用力提高如淀粉[10]、蛋白[11]、果膠[12]等親水膠體的凝膠強(qiáng)度?；诖送茰y(cè)，利用納米纖維素可強(qiáng)化海藻酸鈉膠粒結(jié)構(gòu)，提高膠粒對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果。目前，關(guān)于海藻酸鈉-納米纖維素膠粒對(duì)乳酸菌胃腸液耐受性的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以果蔬加工副產(chǎn)物豆渣為原料，通過(guò)酸法與機(jī)械法分別制備豆渣纖維素納米微纖絲（soybean cellulose nanofibrils，SCNF）與豆渣纖維素納米微晶（soybean cellulose nanocrystal，SCNC），利用不同種類的納米纖維素協(xié)同鈣離子誘導(dǎo)海藻酸鈉溶液形成微膠粒，研究?jī)煞N復(fù)合微膠粒的包埋率、表面形態(tài)、膠體結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步考察兩種微膠粒對(duì)乳酸菌胃腸液逆環(huán)境存活率的影響。本研究有利于拓展果蔬納米膳食纖維在乳酸菌等益生菌保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用，可為構(gòu)建新型載菌遞送體系以提高乳酸菌的胃腸道耐受性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

豆渣由三明市揚(yáng)晨食品有限公司提供。

副干酪乳桿菌R37（CCTCC：M 2012311）由福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，該菌從枇杷果酒中分離得到。

堿性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶（50 000 U/g）江蘇銳揚(yáng)生物有限公司；海藻酸鈉（分析級(jí)）、胰酶（4 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）、膽鹽（純度高于65%） 北京索萊寶生物科技公司；溴化鉀（光譜級(jí)）德國(guó)默克試劑公司；MRS肉湯及培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GM-200型德國(guó)萊馳刀式研磨儀 上海弗爾德儀器有限公司；SPCH-35型超高壓納米均質(zhì)機(jī) 英國(guó)STANSTED儀器公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司；Nova NanoSEM 230場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI儀器公司；TENSOR II型傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)布魯克儀器有限公司；NMI-25型低頻氫譜核磁共振儀 江蘇泰紐科技有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣納米纖維素的制備

采用堿提法[13]制備豆渣纖維素，獲得的纖維素經(jīng)干燥粉碎，密封保存。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以豆渣纖維素粉為原料，采用酸法與微射流均質(zhì)制備SCNC以及SCNF。

參考Yang Xue等的方法[14]并略作修改，通過(guò)酸解制備SCNC：粉碎過(guò)篩的20 g豆渣纖維素粉溶于1 L硫酸中，攪拌降解36 h，加水稀釋為2 倍體積后離心（13 000 r/min、20 min）。沉淀經(jīng)水洗再次離心后調(diào)節(jié)pH值為中性，透析24 h后凍干保存。

參考Wang Yihong等的方法[15]并略作修改，通過(guò)微射流均質(zhì)制備SCNF：粉碎過(guò)篩的20 g豆渣纖維素粉溶于1 L去離子水，經(jīng)微射流均質(zhì)降解（150 MPa，循環(huán)5 次）后凍干保存。

1.3.2 乳酸菌R37的培養(yǎng)

采用MRS肉湯活化培養(yǎng)副干酪乳桿菌R37，接種量為培養(yǎng)基體積的5%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，時(shí)間為24 h?；罹鷶?shù)量采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算（菌量大于108CFU/mL），乳酸菌菌懸液經(jīng)離心（5 000 r/min、5 min）、水洗后收集，用于后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 載菌海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的制備

采用擠壓滴入法制備載菌膠粒：SCNC或SCNF粉末添加至菌懸液使其終質(zhì)量濃度分別為10 g/L與30 g/L，之后添加海藻酸鈉至終質(zhì)量濃度為10 g/L，攪拌水合1 h，擠壓滴入氯化鈣溶液（檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，溶液保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)），硬化20 min，抽濾獲得濕基復(fù)合膠粒，凍干后密封保存。海藻酸鈉-纖維素納米微晶膠粒根據(jù)納米纖維素不同質(zhì)量濃度分別命名為SA-SCNC（10 g/L）與SA-SCNC（30 g/L）；海藻酸鈉-纖維素納米微纖絲膠粒根據(jù)納米纖維素不同質(zhì)量濃度分別命名為SA-SCNF（10 g/L）與SA-SCNF（30 g/L）；未添加納米纖維素粉末的樣品作為對(duì)照。濕基膠粒用于包埋率、低頻氫譜核磁共振、質(zhì)構(gòu)以及胃腸液耐受性的分析，而干基膠粒用于掃描電子顯微鏡觀察以及傅里葉變換紅外光譜的結(jié)構(gòu)分析。

1.3.4 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的乳酸菌包埋率

根據(jù)Darjani等的方法測(cè)定膠粒對(duì)乳酸菌的包埋率[16]。取1 g海藻酸鈉-納米纖維素膠粒，加入9 mL磷酸二氫鈉緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 7.5、37 ℃），漩渦振蕩5 min使膠粒溶解，乳酸菌完全釋放。之后，取1 mL樣液進(jìn)行梯度稀釋，根據(jù)平板計(jì)數(shù)法測(cè)得包埋菌的數(shù)量。海藻酸鈉-納米纖維素膠粒對(duì)乳酸菌的包埋率按照公式（1）計(jì)算。

式中：N為包埋后膠粒釋放的活菌數(shù)量/（CFU/g）；N0為初始活菌數(shù)量/（CFU/g）。

1.3.5 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的微觀形態(tài)觀察

將凍干的膠粒黏附在貼有導(dǎo)電膠的載物平板上，進(jìn)行噴金處理，之后采用Nova NanoSEM 230場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)凍干膠粒的整體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)分別為100 倍與10 000 倍。

1.3.6 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的傅里葉變換紅外光譜分析

采用TENSOR II型傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)凍干膠粒的基團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。凍干粉碎的海藻酸鈉-納米纖維素膠粒25 mg，加入500 mg干燥的光譜純溴化鉀（105 ℃、2 h），快速研磨，之后取少量粉末倒入模板夾具中進(jìn)行壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀通道中進(jìn)行分析。儀器的測(cè)定波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1、分辨率為4 cm-1、掃描32 次。

1.3.7 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的低頻氫譜核磁共振分析

采用NMI-25型低頻氫譜核磁共振對(duì)濕基海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的水分分布進(jìn)行分析，取2 g膠粒于25 mL核磁管中，以CPMG序列進(jìn)行弛豫時(shí)間T2掃描，回聲時(shí)間為400 μs，回聲次數(shù)為8 000 次，等待時(shí)間為8 s，每次測(cè)量掃描8 次，溫度為25 ℃，獲得弛豫時(shí)間曲線。

1.3.8 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的硬度分析

采用TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀，選取TP-2型探頭，觸發(fā)力為1 g，測(cè)前速率1.0 mm/s、測(cè)試速率1.0 mm/s、測(cè)后速率1.0 mm/s、觸發(fā)力5.0 g、壓縮程度30%，每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，用TPA軟件分析海藻酸鈉-納米纖維素膠粒經(jīng)胃腸液消化后的硬度變化。

1.3.9 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒經(jīng)胃腸液消化后的活菌損失量分析

根據(jù)Li Kailing等的方法[17]并稍作修改進(jìn)行胃腸液耐受實(shí)驗(yàn)，取1 g海藻酸鈉膠?；蚝Ｔ逅徕c-納米纖維素膠粒加入9 mL模擬胃液（pH 2，含3 g/L胃蛋白酶）在37 ℃條件下孵化2 h，之后將膠粒轉(zhuǎn)移至9 mL腸液（pH 6.5，含5 g/L胰酶、3 g/L胰蛋白酶、5 g/L膽鹽）中混合均勻，繼續(xù)孵化3 h。待靜置結(jié)束后，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，漩渦振蕩5 min，使膠粒完全溶解，吸取1 mL樣液進(jìn)行梯度稀釋，根據(jù)平板計(jì)數(shù)法測(cè)得活菌數(shù)量。對(duì)照組采用1 g未包埋的菌懸液進(jìn)行模擬胃腸液耐受實(shí)驗(yàn)。乳酸菌的損失量根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式中：C為乳酸菌的損失量（lg（CFU/g））；N為嵌入膠粒的乳酸菌數(shù)量/（CFU/g）；N0為膠粒經(jīng)消化后溶解釋放的乳酸菌數(shù)量/（CFU/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用DPS 9.05軟件中最小顯著性差異法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異；采用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒對(duì)乳桿菌R37的包埋率

不同類型的海藻酸鈉-納米纖維素膠粒對(duì)副干酪乳桿菌R37的包埋率如圖1所示。所有凝膠樣品的初始菌量基本一致，活菌量為9.41（lg（CFU/g））。當(dāng)凝膠與Ca2+交聯(lián)后，不同膠粒對(duì)乳酸菌的包埋程度存在差異。海藻酸鈉膠粒的包埋率為87.51%。當(dāng)海藻酸鈉體系中加入SCNC與SCNF后，膠粒的載菌量與包埋率顯著提高。當(dāng)SCNC或SCNF添加質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，SA-SCNC與SA-SCNF的包埋率分別為92.77%與96.80%。此結(jié)果高于Darjani等報(bào)道的海藻酸鈉-多糖復(fù)合膠粒的包埋率（約90%）[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，提高SCNC與SCNF的添加量對(duì)副干酪乳桿菌R37的包埋率影響不顯著。這些結(jié)果說(shuō)明SCNF的加入能更好地提高海藻酸鈉膠粒的包埋率，這可能與CNF具有更高的比表面積[18]，能夠較大程度地黏附菌體有關(guān)。

圖1 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒對(duì)乳酸菌的包埋率Fig.1 Encapsulation efficiency of LAB in SA-nanocellulose beads

2.2 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的微觀形態(tài)

圖2 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的形態(tài)（×100）及表面結(jié)構(gòu)（×10 000）Fig.2 Morphology (× 100) and microstructure (× 10 000) of SA-nanocellulose beads

不同類型的海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的微觀形態(tài)如圖2所示。副干酪乳桿菌R37呈現(xiàn)乳酸菌典型的棒狀形態(tài)，菌體表面平整，尺寸約為2～5 μm（圖2A）。海藻酸鈉膠粒呈現(xiàn)扁球狀，表面粗糙且伴有孔狀間隙，經(jīng)海藻酸鈉膠粒包埋的乳桿菌R37主要分布于膠粒的表面。當(dāng)SA體系中加入納米纖維素后，膠粒呈現(xiàn)圓球狀，但表面形態(tài)發(fā)生明顯變化，變化程度與納米纖維素的種類有關(guān)。與海藻酸鈉膠粒相比，SA-SCNC膠粒表面缺少孔隙結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)粗糙的表面形態(tài)，大量的乳桿菌R37聚集黏附在膠粒表面。當(dāng)SCNC的添加量為30 g/L時(shí)，SA-SCNC膠粒的表面裂紋消失。另一方面，當(dāng)海藻酸鈉中添加SCNF后，SA-SCNF膠粒表面的粗糙起伏程度變?nèi)酰尸F(xiàn)出更加致密的表面形態(tài)，只有少量的乳酸菌在表面上可觀察到，說(shuō)明大量的乳桿菌R37被包裹在膠粒的內(nèi)部。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，SCNF添加量的增大使得復(fù)合膠粒的表面變得更加光滑平整。這些觀察結(jié)果表明納米纖維素的加入會(huì)優(yōu)化海藻酸鈉膠粒的表面形態(tài)，從而影響乳桿菌R37在膠粒中的分布狀況，相比于添加SCNC，海藻酸鈉能夠與SCNF形成更加致密的微觀結(jié)構(gòu)?；诖?，有必要對(duì)不同形態(tài)膠粒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。

2.3 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)及氫鍵結(jié)合狀態(tài)

不同類型的海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)如圖3A所示。海藻酸鈉膠粒顯示出4 個(gè)明顯的特征峰（1 030、1 430、1 600、3 400 cm-1），其中1 030 cm-1處的特征峰表示鈣離子鹽橋上醚鍵（—O—）的拉伸振動(dòng)[19]，1 430 cm-1與1 600 cm-1處的特征峰表示海藻酸鈉羧酸基團(tuán)（—COOH）的不對(duì)稱振動(dòng)與對(duì)稱拉伸振動(dòng)[20]，而3 400 cm-1處的特征峰表示海藻酸鈉分子間羥基的伸縮振動(dòng)[21]，其強(qiáng)度反映體系中氫鍵的締合程度。所有樣品的傅里葉變換紅外光譜圖在1 700 cm-1處均顯示出一個(gè)明顯的羰基振動(dòng)吸收峰，但該吸收峰可能是來(lái)源于酸度調(diào)節(jié)劑檸檬酸的羧基[22]。當(dāng)海藻酸鈉體系中添加納米纖維素后，這些特征峰的位置并沒(méi)有出現(xiàn)明顯偏移，說(shuō)明在離子交聯(lián)形成膠粒的過(guò)程中未有新的化學(xué)鍵生成。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納米纖維素的添加量增大時(shí)，1 030 cm-1與3 400 cm-1振動(dòng)吸收峰透光率下降，振動(dòng)吸收強(qiáng)度增加。其中SA-SCNF（30 g/L）膠粒顯示出最低的透光率，分別為0.641與0.507，分別是海藻酸鈉膠粒的75.32%與71.10%。這些結(jié)果表明納米纖維素有利于強(qiáng)化海藻酸鈉凝膠體系的鹽橋結(jié)構(gòu)與氫鍵結(jié)構(gòu)，其中纖維素微纖絲比較纖維素微晶發(fā)揮著更加重要的作用。

T2弛豫時(shí)間對(duì)1H原子運(yùn)動(dòng)十分敏感，可間接反映海藻酸鈉凝膠中水分的結(jié)合狀態(tài)，從而判定凝膠體系中的氫鍵形成強(qiáng)弱[23-24]。根據(jù)水分的自由程度差異，水分的結(jié)合狀態(tài)可被大致分為3 類：結(jié)合水（T21：1～10 ms）、束縛水（T22：10～100 ms）、自由水（T23：100～1 000 ms）[25]。海藻酸鈉-納米纖維素膠粒中水分的T2弛豫時(shí)間如圖3B所示。所有膠粒都展現(xiàn)出唯一的單峰形態(tài)，說(shuō)明膠粒的水分分布均一，從而能夠有效束縛溶劑中的水分子。與海藻酸鈉膠粒相比，SA-SCNC膠粒的水分分布向低弛豫時(shí)間轉(zhuǎn)移，且偏移程度隨納米纖維素的添加量增加而增大，SA-SCNF膠粒較SA-SCNC膠粒具有更低的弛豫時(shí)間。當(dāng)SCNF的添加量為30 g/L時(shí)，SA-SCNC膠粒的弛豫時(shí)間為25.53 ms。這些結(jié)果表明納米纖維素的多羥基結(jié)構(gòu)可提高海藻酸鈉體系的成氫鍵能力，從而增強(qiáng)對(duì)自由水的有效束縛。另外，Mishnaevsky等采用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)模擬了納米纖維素結(jié)構(gòu)與高聚物之間的相互作用，確定了納米纖維素的強(qiáng)化機(jī)制不僅與分子間非共價(jià)作用力（氫鍵、范德華力）的強(qiáng)弱有關(guān)，同時(shí)還取決于纖維素是否呈現(xiàn)封閉的微觀形態(tài)[26]。SCNF在形態(tài)上表現(xiàn)為相互纏繞[27]，具有更大的比表面積，在空間內(nèi)能形成更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這可能也是微纖絲能夠提高海藻酸鈉膠粒持水能力的重要原因。此結(jié)果與海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了與SCNC相比，SCNF能夠通過(guò)強(qiáng)化分子間氫鍵相互作用，更好地維持海藻酸鈉凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖3 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒的傅里葉變換紅外光譜圖（A）與低頻氫譜核磁圖（B）Fig.3 Fourier transform infrared spectra (A) and low-frequency 1H nuclear magnetic resonance (B) of SA-nanocellulose beads

2.4 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒經(jīng)胃腸液消化后的硬度變化

不同類型的海藻酸鈉-納米纖維素膠粒經(jīng)胃腸液消化后的硬度差異如表1所示。海藻酸鈉膠粒在模擬胃液消化過(guò)程中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，膠粒的硬度未發(fā)生明顯變化。然而，海藻酸鈉膠粒經(jīng)模擬腸液消化后，硬度下降為初始值的31.1%，這可能是海藻酸鈉分子鏈的—COOH在堿性條件下電離程度下降，分子鏈趨向展開(kāi)所致[28-29]。納米纖維素可顯著增加海藻酸鈉膠粒的硬度并表現(xiàn)出濃度依賴性，SA-SCNC（30 g/L）膠粒與SA-SCNF（30 g/L）膠粒的硬度分別為海藻酸鈉膠粒的153.8%與215.1%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與海藻酸鈉相比，SA-SCNF膠粒經(jīng)胃腸液消化后的硬度變化大幅度減小，這說(shuō)明SCNF的加入更有利于穩(wěn)定海藻酸鈉膠粒的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，避免膠粒經(jīng)胃腸液消化后機(jī)械強(qiáng)度發(fā)生較大程度變化。推測(cè)SCNF具有強(qiáng)氫鍵締合能力[30]，能夠抑制海藻酸鈉的分子鏈在腸液環(huán)境中的快速溶脹。

表1 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒在胃腸液消化后的硬度變化Table 1 Changes in hardness of SA-nanocellulose after digestion in stimulated gastrointestinal fluid

2.5 海藻酸鈉-納米纖維素膠粒在胃腸液消化過(guò)程中的活菌數(shù)量變化

不同類型的海藻酸鈉-納米纖維素膠粒經(jīng)模擬胃腸液消化后活菌損失量如圖4所示。乳酸菌R37經(jīng)模擬胃腸液消化后活菌數(shù)量出現(xiàn)大量損失，由9.27（lg（CFU/g））下降為5.43（lg（CFU/g））。與裸菌相比，海藻酸鈉載菌膠粒經(jīng)模擬胃腸液耐受后活菌數(shù)量由9.25（lg（CFU/g））減少為6.26（lg（CFU/g）），下降了2.99（lg（CFU/g））。此結(jié)果與許多研究報(bào)道相似，證實(shí)了單純采用海藻酸鈉膠粒負(fù)載乳酸菌對(duì)提高其胃腸道耐受能力十分有限[31-32]。當(dāng)納米纖維素的添加質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，SA-SCNC膠粒經(jīng)模擬胃腸液消化后活菌數(shù)量由9.37（lg（CFU/g））減少為7.21（lg（CFU/g）），下降了2.16（lg（CFU/g））；然而，SA-SCNF膠粒的活菌數(shù)量變化幅度更小，由9.32（lg（CFU/g））減少為7.81（lg（CFU/g）），下降了1.51（lg（CFU/g））。這些結(jié)果說(shuō)明納米纖維素的加入對(duì)提高乳酸菌的胃腸道耐受能力有著積極的影響，不同類型的納米纖維素的影響效果不同，添加SCNF比SCNC能更好地改善海藻酸鈉膠粒對(duì)乳酸菌R37的保護(hù)效果。有研究報(bào)道了高聚物膠粒的機(jī)械強(qiáng)度與乳酸菌的胃腸道存活率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[33]。這與本研究結(jié)果一致，增加納米纖維素質(zhì)量濃度有利于提高海藻酸鈉膠粒機(jī)械強(qiáng)度與穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)膠粒對(duì)胃腸液的阻隔效果。

圖4 載菌海藻酸鈉-納米纖維素膠粒經(jīng)模擬胃腸液消化后的活菌數(shù)量變化Fig.4 Changes in viability of LAB in SA-nanocellulose beads after simulated gastrointestinal fluid treatment

3 結(jié) 論

豆渣納米纖維素可改善海藻酸鈉膠粒的表面形態(tài)與分子間作用力，進(jìn)而影響膠粒對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用，其中SCNF較SCNC表現(xiàn)出更好的改性效果。SCNF的加入不僅提高了海藻酸鈉膠粒的包埋率，同時(shí)也降低了膠粒表面的粗糙度，抑制了孔隙產(chǎn)生，賦予膠粒更加致密平整的微觀形態(tài)，這與SCNF能夠提高海藻酸鈉分子鏈的氫鍵締合能力以及增加與Ca2+之間形成鹽橋數(shù)量有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)構(gòu)致密的SA-SCNF膠粒經(jīng)模擬胃腸液消化后能夠更好地維持原有的機(jī)械強(qiáng)度，并對(duì)乳酸菌胃腸道逆環(huán)境起到良好的保護(hù)效果。另一方面，SCNF的添加對(duì)增加乳酸菌胃腸道逆環(huán)境耐受性具有積極影響。SCNF復(fù)合膠粒經(jīng)模擬胃腸液消化后活菌數(shù)量超過(guò)107CFU/g，顯著高于海藻酸鈉載菌膠粒的106CFU/g。