紫花蕓豆蛋白體外消化產(chǎn)物的抗氧化活性及結(jié)構(gòu)特征分析

毛小雨，許馨予，楊鵠雋，賈 斌，左 鋒,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

隨著人們生活節(jié)奏加快，同時(shí)受環(huán)境、飲食、紫外線等各方面影響，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的自由基，這些自由基能夠催生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使人體內(nèi)的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，從而引起各種疾病[1-2]，如衰老、癌癥、多發(fā)性硬化癥、炎癥、冠心病和心血管疾病等慢性疾病[3]。來(lái)源豐富的大豆蛋白、谷物蛋白等植物原料，在消化吸收過(guò)程中能夠降解成相對(duì)分子質(zhì)量小于6 kDa的肽段，這些多肽可以和游離氨基酸結(jié)合并被小腸吸收最終進(jìn)入血循環(huán)[4]，具有促進(jìn)免疫、調(diào)節(jié)激素、抗菌、抗衰老、降血壓、降血脂等作用，因此受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

蕓豆，學(xué)名菜豆（Phaseolus vulgarisL.），是人類主要的食用豆類之一[5]，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，是許多國(guó)家和地區(qū)主要植物蛋白的來(lái)源之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，蕓豆不僅能夠作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源，其產(chǎn)生的肽段也具有較高的抗氧化活性，具有提高人體免疫能力、抑菌和抗病能力等功效[6]。曲柳清等[7]以英國(guó)紅蕓豆蛋白水解液為研究對(duì)象，經(jīng)超濾、葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析后分級(jí)，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量集中在5～3 kDa的多肽具有高抗氧化活性。Roy等[8]對(duì)深紅蕓豆蛋白使用不同種類的酶進(jìn)行水解，探討水解產(chǎn)物的抗氧化活性機(jī)制及抑菌性能，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶水解的蕓豆分離蛋白具有較強(qiáng)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力，且對(duì)大腸桿菌有抑菌作用。Shevkani等[9]將蕓豆蛋白添加到無(wú)麩質(zhì)松餅中，發(fā)現(xiàn)添加蕓豆蛋白不僅可以增強(qiáng)面糊黏彈性等質(zhì)構(gòu)特性，而且使松餅的抗氧化活性有所提升。雖然蕓豆蛋白及其水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，但是蕓豆蛋白在經(jīng)過(guò)人體消化后，其活性及成分組成變化鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬胃部消化環(huán)境，分析蕓豆蛋白在消化過(guò)程中抗氧化活性及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征，探討蕓豆蛋白的消化特性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成對(duì)抗氧化活性的影響機(jī)制，為高品質(zhì)的功能營(yíng)養(yǎng)型植物蛋白食品的開發(fā)和制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆由黑龍江省大慶市國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心提供。

胃蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；鄰二氮菲、VC標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑（上海）有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；鹽酸、氫氧化鈉、三氯化鐵 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

控溫磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE28型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CF-16RN型高速冷凍離心機(jī) 日本Himac公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；U-2019型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Tensor27型傅里葉變換紅外光譜分析儀 德國(guó)Bruker公司；BSA124S型分析天平 賽多利斯（北京）有限公司；BM515超低溫冰箱 法國(guó)Froilabo公司。

1.3 方法

1.3.1 紫花蕓豆蛋白的制備

參照徐清瑩[10]和唐蔚[11]等的方法并略作修改。將紫花蕓豆去皮，50 ℃烘干，粉碎，過(guò)80 目篩，按1∶5（m/V）加入60～90 ℃沸程的石油醚脫脂6 h后，烘干，得到脫脂、脫皮紫花蕓豆粉。將蕓豆粉與去離子水按1∶10（m/V）的比例混合，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0。室溫?cái)嚢杼崛? h后，取上清液置于燒杯中，沉淀與去離子水按固液比1∶8混合，5 000 r/min離心20 min，將兩次上清液混合。上清液用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，沉淀1 h，5 000 r/min離心20 min，棄上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。將含有蛋白的溶液加入去離子水清洗兩次，離心沉淀，經(jīng)冷凍干燥后，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 體外模擬胃部消化

參照Minekus等[12]的方法并略作修改。以脫脂、脫皮紫花蕓豆蛋白粉為原料，進(jìn)行體外模擬胃部消化。將分離蛋白配制成質(zhì)量濃度50 mg/mL的溶液，使用超純水配制0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液作為溶劑，將蛋白混合液與人工模擬胃液以體積比1∶1混合，使用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，隨后在消化液中加入胃蛋白酶使?jié)舛冗_(dá)到2 000 U/mL，將混合液裝入具塞三角瓶中，在水浴振蕩器（37 ℃、180 r/min）中反應(yīng)，消化時(shí)間分別為15、45、60、90、105、120 min，而后收集消化樣品。75 ℃水浴加熱10 min，停止消化后，用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。在4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥，剩余沉淀部分凍干并用于后續(xù)電泳分析。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定

參照Gruener等[13]的方法并略作修改。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 4%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。樣品制備：蕓豆蛋白樣品溶于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）樣品緩沖液（0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液），煮沸3 min后進(jìn)行電泳。上樣量為10 μL，凝膠電泳于恒壓模式下進(jìn)行，開始時(shí)電壓保持在80 V，進(jìn)入分離膠后增至120 V。凝膠染色液采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液，然后脫色。

1.3.4 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物水解度測(cè)定

采用鄰苯二甲醛法對(duì)紫花蕓豆蛋白消化過(guò)程中的水解度進(jìn)行測(cè)定。參照江連洲等[14]的方法，用紫外-可見光分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，應(yīng)確保在反應(yīng)2 min后進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.3.5 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物溶解度測(cè)定

蛋白質(zhì)的溶解度測(cè)定參照Leila等[15]的方法并稍加改動(dòng)。稱取100 mg消化蛋白樣品分散于10 mL去離子水中，室溫下磁力攪拌30 min，然后用1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，攪拌30 min后，12 000×g、20 ℃離心20 min。上清液經(jīng)過(guò)適度稀釋后，采用福林-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的比例。

1.3.6 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 總抗氧化能力測(cè)定

總抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)參見試劑盒說(shuō)明書。

1.3.6.2 鐵離子還原能力測(cè)定

采用Young[16]的方法并略作修改。將模擬消化蛋白凍干粉用超純水配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL的溶液進(jìn)行抗氧化指標(biāo)測(cè)定（下同），在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度表征鐵離子還原能力。

1.3.6.3 羥自由基清除率測(cè)定

參照夏秀芳等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定，將待測(cè)液于536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度AP；以1 mL去離子水代替1 mL H2O2溶液，記為AB；以1 mL蕓豆蛋白模擬消化液代替去離子水，測(cè)定吸光度AS。羥自由基清除率按下式計(jì)算。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

取一小部分KBr，置于50 ℃烘箱內(nèi)短時(shí)間烘干，取200 mg KBr與0.2 g消化凍干粉樣品放置于瑪瑙研缽中混合均勻，研磨充分，取適量樣品放入模具進(jìn)行壓片，壓制成透明均勻的薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)30 次，間隔0.1 s。

1.3.8 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物巰基含量測(cè)定

巰基含量采用經(jīng)Beveridge改進(jìn)后的Elman法[18]。具體操作參照尹壽偉[19]的方法并作適當(dāng)修改。

1.3.9 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物氨基酸含量測(cè)定

參照梁珊[20]的方法進(jìn)行前處理，利用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行含量測(cè)定，氨基酸含量測(cè)定參照GB/T 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》。

1.3.10 掃描電子顯微鏡觀察

用牙簽沾取少量紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物凍干樣品（處理方法見1.3.1、1.3.2節(jié)）后，均勻固定在貼膠的電子顯微鏡進(jìn)樣臺(tái)上，真空條件下進(jìn)行樣品電鍍噴金，按順序取出，固定在載物臺(tái)，調(diào)節(jié)最佳視野和放大倍數(shù)進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2018軟件作圖，PeakFit v4.1.2軟件進(jìn)行紅外光譜數(shù)據(jù)分析，SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性通過(guò)t檢驗(yàn)及單因素方差分析比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE結(jié)果

圖1 紫花蕓豆蛋白及模擬胃部消化不同時(shí)間的SDS-PAGE圖譜Fig.1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of kidney bean protein at different times during simulated digestion

紫花蕓豆蛋白的主要亞基分子質(zhì)量范圍在66～20 kDa，其中，球蛋白作為紫花蕓豆蛋白的主要貯藏蛋白[21]，其分子質(zhì)量為45 kDa，紫花蕓豆蛋白及模擬消化不同時(shí)間蛋白消化產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜如圖1所示。紫花蕓豆蛋白在31、20 kDa處存在幾條亞基條帶，這可能是凝集素或小分子球蛋白，Byanju等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蕓豆蛋白在33、20 kDa附近的亞基條帶主要由11S球蛋白、3S球蛋白組成。紫花蕓豆蛋白在模擬消化期間由于酶解作用的發(fā)生，蕓豆球蛋白含量減少，但是在消化120 min時(shí)仍然顯示較清晰的條帶，這是由于蕓豆球蛋白在一定的離子強(qiáng)度下及pH 1.0～3.0時(shí)，以三聚體形式存在并具有較強(qiáng)的疏水性[23]，在模擬消化過(guò)程中未充分水解，而在31、20 kDa處存在的幾條亞基條帶在消化過(guò)程中被完全水解成分子質(zhì)量小于14.4 kDa的肽段。

2.2 溶解度及水解度測(cè)定結(jié)果

圖2 紫花蕓豆蛋白模擬胃部消化不同時(shí)間的溶解度及水解度Fig.2 Solubility and DH of kidney bean protein at different times during simulated digestion

紫花蕓豆蛋白模擬胃部消化不同時(shí)間的溶解度及水解度如圖2所示。在模擬胃部消化的條件下，由于受到胃蛋白酶的作用而發(fā)生水解，表現(xiàn)為水解度在消化過(guò)程中隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，模擬消化90 min時(shí)水解作用基本完成。紫花蕓豆蛋白水解后，蛋白質(zhì)中肽鏈斷裂形成多肽和小分子物質(zhì)，親水性增加，從而使水解產(chǎn)物具有更好的溶解性[24]。雖然在模擬胃部條件下由于較低的pH值使蕓豆蛋白與消化產(chǎn)物相比溶解度相對(duì)較低，但在模擬消化過(guò)程中，酶解作用使得紫花蕓豆蛋白親水性增加從而導(dǎo)致溶解度顯著增加，但不同消化時(shí)間的模擬消化產(chǎn)物之間溶解度差異并不明顯。

2.3 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

蛋白在水解過(guò)程中產(chǎn)生低分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物，不僅使水解產(chǎn)物具有更好的溶解性，而且也會(huì)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能[25]。蕓豆蛋白在消化過(guò)程中其消化產(chǎn)物的抗氧化活性變化如圖3所示。

由圖3 A 可知，紫花蕓豆蛋白總抗氧化能力為（0.66±0.03）mg/mL，在消化結(jié)束時(shí)，總抗氧化能力提高了296.97%。經(jīng)胃部模擬的消化產(chǎn)物總抗氧化能力隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，模擬消化90 min時(shí)，其總抗氧能力達(dá)到（2.45±0.05）mg/mL，繼續(xù)延長(zhǎng)消化時(shí)間總抗氧化能力無(wú)顯著變化，紫花蕓豆蛋白消化產(chǎn)物的總抗氧化能力與其水解度變化（圖2）呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，盧陽(yáng)等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)植物蛋白抗氧化能力隨水解度的增加而增強(qiáng)，這可能與水解過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、多肽鏈的長(zhǎng)度以及多肽中氨基酸排序有關(guān)。

由圖3B可知，紫花蕓豆蛋白消化產(chǎn)物的鐵離子還原能力變化趨勢(shì)與其溶解度變化趨勢(shì)一致（圖2）。紫花蕓豆蛋白鐵離子還原能力為0.1 8 7±0.0 0 2，經(jīng)胃部模擬消化產(chǎn)物的鐵離子還原能力顯著提高（P＜0.05），消化產(chǎn)物的鐵離子還原能力約是蕓豆蛋白的1.5 倍，提高了54.01%。這主要是由于紫花蕓豆蛋白在消化過(guò)程中，蛋白表面更多地暴露了含組氨酸、蘇氨酸等非特異性的蛋白組分[27]，這些組分能夠?qū) e3+還原成F e2+，并儲(chǔ)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊中。

由圖3C可知，紫花蕓豆蛋白羥自由基清除率為（20.51±1.01）%，消化結(jié)束時(shí)，羥自由基清除率為（23.96±1.12）%，即隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，紫花蕓豆蛋白羥自由基清除率雖然有所增加但無(wú)顯著性差異。這主要是由于胃蛋白酶作用使蛋白在消化過(guò)程中分子質(zhì)量降低，但也暴露出更多的疏水性氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)[28]，限制了羥自由基與多肽的自由結(jié)合，Zhu Lijuan等[29]對(duì)蛋白胃部模擬消化產(chǎn)物進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果表明蛋白消化產(chǎn)物在模擬胃部消化期間羥自由基清除率無(wú)顯著性變化，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與其結(jié)果一致。

圖3 紫花蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物的總抗氧化能力（A）、鐵離子還原能力（B）和羥自由基清除率（C）Fig.3 Total antioxidant capacity (A), ferric ion reducing power (B)and hydroxyl radical scavenging rate (C) of kidney bean protein and digestion products

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)是具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，由氨基酸經(jīng)肽鍵連接而成[30]，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)在1 600～1 700 cm-1之間，與酰胺I帶重疊[31]。紫花蕓豆蛋白經(jīng)消化后的傅里葉變換紅外光譜見圖4。在1 500～2 000 cm-1波段有明顯特征吸收峰，選取1 600～1 700 cm-1波段，采用PeakFit軟件進(jìn)行曲線擬合，經(jīng)去卷積化處理，得到紫花蕓豆蛋白及模擬消化產(chǎn)物的酰胺I帶圖譜（圖5）。通過(guò)圖5得到紫花蕓豆蛋白及模擬消化產(chǎn)物峰值面積，進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)成分分析，得到蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量信息（表1）。

圖4 紫花蕓豆蛋白及模擬消化產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of digestion products of kidney bean protein in simulated gastric environment

圖5 紫花蕓豆蛋白及模擬消化產(chǎn)物酰胺I帶圖譜Fig.5 Amide I bands of kidney bean protein and digestion products in simulated gastric environment

表1 酰胺I帶擬合蕓豆蛋白及消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure contents of kidney bean protein and digestion products in simulated gastric environment

由表1可知，紫花蕓豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲為主，相對(duì)含量分別為41.14%、21.06%，這與馮玉超等[32]的研究結(jié)果一致。酶解作用開始時(shí)，由于紫花蕓豆蛋白經(jīng)胃蛋白酶及消化液的作用，穩(wěn)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和靜電作用發(fā)生變化，同時(shí)肽鏈排序與氨基酸的種類發(fā)生變化，從而影響蛋白的空間構(gòu)象，使得蕓豆蛋白消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)重新發(fā)生變化。在模擬消化期間，為提高蕓豆蛋白消化產(chǎn)物的穩(wěn)定性，消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋相對(duì)含量不斷提高，同時(shí)多肽鏈反轉(zhuǎn)180°形成β-轉(zhuǎn)角，使消化期間蕓豆蛋白消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加[33]，總體的紫花蕓豆蛋白消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊相對(duì)含量減少。

2.5 巰基含量測(cè)定結(jié)果

圖6 紫花蕓豆蛋白及模擬胃部消化產(chǎn)物巰基含量Fig.6 Sulfhydryl group contents in kidney bean protein and digestion products in simulated gastric environment

暴露巰基含量與總巰基含量的比值可反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的解折疊程度，蛋白質(zhì)的解折疊程度越強(qiáng)，分子結(jié)構(gòu)越趨于暴露式[34]。紫花蕓豆蛋白在模擬胃部消化期間的暴露巰基、總巰基含量變化如圖6所示。紫花蕓豆蛋白的暴露巰基、總巰基含量分別為（9.68±0.27）、（11.31±0.50）μmol/g，經(jīng)模擬胃部消化后的蕓豆蛋白消化產(chǎn)物暴露巰基、總巰基含量的下降幅度均較大，這主要是由于消化過(guò)程引起蛋白分子間的相互聚集和交互作用，使巰基被氧化成二硫鍵，形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致暴露巰基、總巰基含量下降[35]。在模擬消化期間暴露巰基、總巰基含量有所增加但上升緩慢，這主要是由于消化過(guò)程引起蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，使原本埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸殘基上的巰基逐漸暴露出來(lái)[36]。

2.6 游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

表2 紫花蕓豆蛋白及模擬胃部消化產(chǎn)物游離氨基酸含量Table 2 Free amino acid contents in kidney bean protein and digestion products in simulated gastric environment

由表2可知，蕓豆蛋白中天冬氨酸及蘇氨酸含量較高，必需氨基酸占總氨基酸含量的比例為36.092 3%，含硫氨基酸總量為2.727 1 μg/g，經(jīng)模擬消化后，酶解作用使蕓豆蛋白消化產(chǎn)物水解出更多的游離氨基酸，并且其中的必需氨基酸總量大幅增加，含硫氨基酸由于參與蛋白分子間的聚集作用而有所減少。與蕓豆蛋白相比，消化產(chǎn)物的疏水性氨基酸如脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸含量明顯增加，這些氨基酸能夠增強(qiáng)肽與自由基的相互作用，從而增強(qiáng)植物蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化能力[37]。

2.7 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖7 紫花蕓豆蛋白（A）及模擬胃部消化120 min蕓豆蛋白（B）掃描電子顯微鏡圖Fig.7 SEM images of kidney bean protein (A) and digestion products after 120 min simulated digestion (B)

紫花蕓豆蛋白及模擬消化產(chǎn)物的掃描電子顯微鏡圖見圖7。紫花蕓豆蛋白呈現(xiàn)密實(shí)的光滑立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)胃部模擬消化120 min后，由于酸性條件下會(huì)使蛋白分子間的靜電排斥力減小[38]，同時(shí)酶解期間蛋白的解聚以及重新聚合作用使消化產(chǎn)物呈現(xiàn)顆粒狀，且無(wú)序排列形成細(xì)密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由此可知，經(jīng)過(guò)消化后，蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，微觀鏡像下顯示蕓豆蛋白消化產(chǎn)物變成絮狀顆粒，表面的孔隙增加，使蕓豆蛋白在酶解過(guò)程中因表面積增大更易與酶接觸從而發(fā)生相互作用，孔隙結(jié)構(gòu)以及表面積的增加有利于酶進(jìn)入內(nèi)部結(jié)構(gòu)中[39]，使消化產(chǎn)物中肽鍵斷裂，形成更多小分子肽段，小分子肽段數(shù)量的增加有利于水解度的增加，且該狀態(tài)下有利于消化產(chǎn)物與自由基相互結(jié)合，進(jìn)一步提升消化產(chǎn)物的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)蕓豆蛋白進(jìn)行體外模擬胃部消化，分析植物蛋白在消化期間抗氧化活性及結(jié)構(gòu)變化，蕓豆蛋白在消化期間的酶解作用將蕓豆蛋白由大分子蛋白降解成小分子質(zhì)量多肽，且水解能力增強(qiáng)、溶解度增大；與蕓豆蛋白相比，模擬消化產(chǎn)物的總抗氧化能力、鐵離子還原能力顯著提高（P＜0.05），但羥自由基清除率的增強(qiáng)并不顯著。蕓豆蛋白消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量持續(xù)增加，β-折疊相對(duì)含量減少，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量無(wú)明顯變化規(guī)律。在模擬消化過(guò)程中，蛋白分子間發(fā)生了相互聚集和交互作用，內(nèi)部表現(xiàn)為巰基被氧化成二硫鍵，重新形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，外部表現(xiàn)為消化后產(chǎn)物聚集呈現(xiàn)顆粒狀，且無(wú)序排列形成細(xì)密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。