橙花破布木染色體制片及核型分析

陳意蘭 廖海民 王崢峰 黃向旭 劉東明*

（1. 中國科學院華南植物園，中國科學院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院，廣州 510650；2. 貴州大學生命科學學院/農業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，山地生態(tài)與農業(yè)生物工程協同創(chuàng)新中心，貴陽 550025）

橙花破布木（Cordia subcordata）屬紫草科（Boraginaceae）破布木屬（CordiaL.）植物，喬木或灌木。破布木屬在全世界有250～300 種，分布在美洲、非洲、亞洲和大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］，我國只有6 個種，分別為越南破布木（C.cochinchinensis）、臺灣破布木（C. cumingiana）、破布木（C.dichotoma）、二叉破布木（C. furcans）、毛葉破布木（C.myxa）和橙花破布木（C.subcordata），分布在西南、華南及中國臺灣等地，尤以海南島分布最為普遍［2］。Chromosome Counts Database（CCDB）共報道了全世界35 種破布木屬植物的染色體數目為2n=16、18、28、30、32、36、48、50、70、80和104條，均為二倍體植物。其中，破布木的染色體數目為2n=48、50，毛葉破布木的染色體數目為2n=48，其余3種我國有分布的破布木屬植物染色體數目未見報道。所有報道過染色體數目的破布木屬植物的核型均未見報道。

橙花破布木被列為熱帶珊瑚島植被恢復的良好工具種和園林綠化特色種之一［3］，其根系發(fā)達，對土壤適應能力強，對高溫、強光、干旱、貧瘠具有較強的適應能力［4］，又具有很強的抗風能力，適合種植在海島砂質土上綠化環(huán)境。此外，橙花破布木全年開花，花序為聚傘花序或圓錐花序，有淺綠色的花萼和橙色的花冠，花色艷麗，樹冠寬大而密集，可種植為觀賞樹和遮蔭樹［5］。國內外關于橙花破布木的研究大多集中在花粉的形態(tài)結構［6～7］、提取物的藥用活性［8］、引種栽培［9］、生物學特性［4］等方面，核型分析仍處于空白，遺傳背景尚不清楚。

染色體是遺傳信息的載體，對染色體的數目、形態(tài)、“解剖學”特征和分子特征進行定性、定量的分析稱為核型分析［10］。遺傳物質在細胞層面上的表型特征反映在核型上，能揭示物種在染色體層面上的所有特性，為研究物種起源、演化、親緣關系、遺傳進化等提供極其重要的細胞學依據［11］。染色體制片技術是核型分析的前提，在染色體制片環(huán)節(jié)中，取材和預處理至關重要。為了解橙花破布木的遺傳信息，本試驗以橙花破布木根尖為材料，著重對取材和預處理兩個步驟進行探索，選取30個以上染色體分散較好的中期細胞確定染色體數目，并對5 個染色體形態(tài)清晰、濃縮程度一致的細胞進行核型分析，以期為破布木屬植物染色體制片技術及核型分析提供參考，為橙花破布木基因進行染色體定位等細胞遺傳學及表觀遺傳學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：根尖來源于從南海諸島采摘的橙花破布木種子萌發(fā)的胚根或種子萌發(fā)生長一年的幼苗白嫩根。

試劑：飽和對二氯苯、0.002 mol·L-18-羥基喹啉、1 mol·L-1HCl、無水乙醇、冰乙酸、卡寶品紅染色液。

1.2 儀器與設備

儀器：玻璃棒、燒杯、量筒、鑷子、解剖針、刀片、膠頭滴管、載玻片、蓋玻片、濾紙。

設備：RCQ-360N 人工氣候箱、BCD-258WTPZM（E）冰箱、精科HH.S21-N18B 恒溫水浴鍋、B×43生物顯微鏡。

1.3 試驗方法

1.3.1 染色體制片

取材：用剪刀將橙花破布木干果果皮及硬核夾開剝出種子萌發(fā)，待胚根長出后取材或將一年生苗木從種植袋中拔出，用鑷子截取白嫩根1cm左右放入預處理液中預處理。取完材料后將幼苗放回袋中種植，日常澆水養(yǎng)護，以便下次取材。取材時間為8：00～11：00和14：00～16：00兩個時間段。每次取材時間均根據上一次細胞分裂情況進行調整。

預處理：預處理試劑分別為飽和對二氯苯和0.002 mol·L-18-羥基喹啉。預處理時間均設置3個，分別為飽和對二氯苯預處理1.5 h、2 h、3 h，0.002 mol·L-1、8-羥基喹啉預處理2 h、3 h、4 h。其目的是比較兩種預處理試劑對橙花破布木染色體制片效果的影響，比較同種試劑不同預處理時間對橙花破布木染色體制片效果的影響。

固定：固定液為卡諾I（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1），冰水混合物中固定30 min。

解離：1 mol·L-1HCl 60℃水浴鍋中解離3～4 min。解離前先將HCl預熱。

染色：卡寶品紅染色液染色大于2 h。

以上環(huán)節(jié)中，每個處理前均用清水將根尖上的殘留液清洗掉，固定完成后可將材料轉入70%酒精中保存，但保存時間不宜過長。

壓片：將染色好的根尖置于載玻片上，用解剖針刮取少量根尖，加一滴染液，蓋上蓋玻片壓片。若染色時間過長，染色體著色過深，可用45%乙酸壓片。

拍照：將玻片置于光學顯微鏡下進行觀察，選取染色體分散良好的細胞進行拍照。

1.3.2 核型分析

根據李懋學和陳瑞陽［12］提出的標準，以30 個細胞以上，其中85%以上的細胞具恒定一致的染色體數，即可認為是該植物的染色體數目，選取5個分散良好、染色體縱向收縮程度均勻一致、縊痕區(qū)顯示清晰的染色體中期細胞用Photoshop 圖像進行核型分析。染色體形態(tài)依據Levan 等［13］的方法歸類，核型對稱性按Stebbins［14］的標準劃分。

2 結果與分析

2.1 染色體制片

2.1.1 取材時間對染色體制片效果的影響

結果（見表1，圖1）顯示，9：30 以前取材的根尖細胞大部分處于有絲分裂間期、前期和前中期，該時間段的細胞分裂不旺盛，染色體呈點狀（見圖1A）、絲狀（見圖1B）或開始縮短變粗纏繞在一起（見圖1C）。10：30 和14：30 以后取材的根尖細胞大部分處于有絲分裂后期、末期，此時間段的染色體著絲粒分開，染色體向兩極移動（見圖1E）或已經移動到了兩極（見圖1F）。9：30～10：00 和14：00～14：30為最佳取材時間，這兩個時間段的根尖細胞分裂旺盛，中期細胞多，染色體分散，形態(tài)數目清晰（見圖1D）。

表1 取材時間對染色體制片效果的影響Table 1 Effects of different radicle lengths on chromosome preparation during sampling

2.1.2 預處理試劑及時間對染色體制片效果的影響

結果（見表2，圖2）表明，飽和對二氯苯和0.002 mol·L-18-羥基喹啉兩種預處理試劑及預處理時間對橙花破布木染色體的分散效果、濃縮程度、清晰度均有一定的影響。預處理時間過長，染色體濃縮嚴重（見圖2：A3），預處理時間不足，染色體粘連不分散（見圖2：A1，B1）。飽和對二氯苯和0.002 mol·L-18-羥基喹啉相比，飽和對二氯苯預處理效果較好，染色體濃縮較快，形態(tài)結構較清晰（見圖2：A2）。0.002 mol·L-18-羥基喹啉預處理效果不佳，預處理3 h、4 h，染色體形態(tài)仍然不清晰（見圖2：B2～3）。

表2 不同預處理試劑對染色體制片效果的影響Table 2 Effects of different pretreatment reagents on chromosome preparation

2.2 核型分析

通過對橙花破布木中期分裂相的細胞進行觀察統(tǒng)計，橙花破布木染色體數目為32，共16 對染色體，為二倍體植物。核型公式為2n=2X=32=32m，全部為中部著絲粒染色體（m），未見隨體。染色體組絕對長度變異范圍為0.38～0.69 μm，相對長度（%）變化范圍為4.48～8.24，相對長度組成為2n=2L+14M1+14M2+2S。最長染色體與最短染色體之比為1.84，臂比變化范圍為1.22～1.53，最長染色體與最短染色體之比小于2，臂比小于2，核型屬于“1A”型。核型不對稱系數（As.K%）為58.40%。染色體形態(tài)及核型見圖3，核型模式見圖4，染色體核型參數見表3。

表3 橙花破布木染色體核型參數Table 3 Chromosome karyotype parameters of C.subcordata

3 討論

取材是染色體制片的基礎，預處理是染色體制片的關鍵。取材時間決定細胞分裂程度以及中期細胞數量，預處理試劑及時間決定染色體的分散效果、濃縮程度以及清晰度。雷文英［15］等在白刺花染色體壓片技術優(yōu)化研究中設置8：00 以前、8：00～9：00、9：00～10：00 共3 個時間段取材，結果表明白刺花最佳取材時間為9：00～10：00。何倚漣［16］等在北柴胡根尖染色體制片技術研究中設置取材時間為8：00～18：00，每1 h 為1 個時間段取材，結果表明北柴胡最佳取材時間為9：00～10：00和16：00～17：00兩個時間段。本研究中，8：30～9：00取材，大量細胞還處于間期（見圖1A）、前期（見圖1B）和前中期（見圖1C），15：00～15：30取材，大量細胞處于后期（見圖1E）、末期（見圖1F），說明8：30～9：00取材時間較早，應往后推遲取材時間，15：00～15：30 取材時間較晚，應提前取材。于是分別將8：30～9：00 和15：00～15：30 兩個時間段推遲和提前30 min，然后根據細胞分裂程度及分裂狀態(tài)又將取材時間分別推遲和提前30 min，最終得出9：30～10：00 和14：00～14：30 為橙花破布木染色體制片最佳取材時間。這兩個時間段取材的細胞分裂旺盛，中期細胞多，染色體分散，形態(tài)數目清晰（見圖1D）。常用的預處理試劑有秋水仙素、飽和對二氯苯和8-羥基喹啉，3種預處理試劑藥性最強的是秋水仙素，對具有大型染色體的植物根尖的預處理效果最好［17］，其次是飽和對二氯苯，最弱的是8-羥基喹啉，這兩種試劑常用于具有中小型染色體的植物根尖預處理，離體處理的效果比較好［18］。橙花破布木染色體較小，應選擇藥性較溫和的預處理試劑。本實驗中，飽和對二氯苯和0.002 mol·L-18-羥基喹啉相比，飽和對二氯苯預處理2 h 效果較好，染色體濃縮較快，形態(tài)結構較清晰（見圖2：A2）。

核型分析可以反映染色體的短臂、長臂、縊痕、隨體等特征，主要從核型公式、核型分類、核型不對稱系數幾個方面體現。核型公式、核型不對稱系數、核型類型分別反映染色體組的結構組成、染色體組臂比的變化以及染色體組內各臂比值的比例。核型公式越簡單、核型不對稱系數越小、各臂比值比例越均等物種進化越原始，反之越進化［19］。本研究首次對橙花破布木的染色體數目及核型進行報道。研究表明，橙花破布木染色體較小，共32 條（見圖3），與報道過的Cordia dentata、Cordia boissieri、Cordia angiocarpa、Cordia leucosebestera、Cordia sebestena染色體數目一致［20～22］。核型公式為2n=2X=32=32m，全部為中部著絲粒染色體，未見隨體。核型屬于“1A”型，核型不對稱系數（As.K%）為58.40%。因此，橙花破布木染色體組的結構組成比較簡單，臂比值比例比較均等，核型不對稱系數較小，對稱性較強，說明其進化趨勢比較原始。本研究結果可為破布木屬植物染色體制片技術及核型分析提供參考，為橙花破布木基因進行染色體定位等細胞遺傳學及表觀遺傳學研究奠定基礎。