良惡性肺結(jié)節(jié)CD31表達水平的影像空間異質(zhì)性差異

洪俊杰，劉博樂，陳瑤，唐坤，薛蓓慧，吳孫婕，鄭祥武

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.放射科；2.病理科

影像學檢查是肺結(jié)節(jié)診斷的主要手段。肺結(jié)節(jié)的及時檢出，尤其是良惡性準確鑒別診斷，是肺癌早期診斷與治療的關(guān)鍵[1-2]。前期研究發(fā)現(xiàn)良惡性結(jié)節(jié)的空間異質(zhì)性差異可作為定性診斷重要依據(jù)，并推測肺結(jié)節(jié)內(nèi)血供分布的差異是其病理基 礎(chǔ)[3-5]，但目前有關(guān)肺結(jié)節(jié)近遠心端空間異質(zhì)性影像學特征尚缺乏病理學的依據(jù)。本研究旨在探討良惡性肺結(jié)節(jié)CD31表達水平相關(guān)的微血管密度 （microvascular density，MVD）近遠心端空間異質(zhì)性差異，從而為良惡性肺結(jié)節(jié)的影像學空間異質(zhì)性差異特征提供病理學依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2016年5月至2017年9月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行肺結(jié)節(jié)根治術(shù)患者的石蠟組織標本35例。所有病例均經(jīng)手術(shù)和病理證實，術(shù)前均未接受過放化療。35例中，男20例，女15例；年齡42～77歲，平均65歲；肺結(jié)節(jié)最大徑1～3 cm，平均2.2 cm；其中鱗癌7例，腺癌23例，炎性結(jié)節(jié)5例。所有患者術(shù)后的肺結(jié)節(jié)標本，根據(jù)肺門與肺動脈血管走行方向，分別取其近心端與遠心端兩處的部分病理組織，然后用10%中性甲醛溶液固定4～ 8 h，再行常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 研究方法 采用SP法檢測所有標本CD31（武漢塞維爾生物科技有限公司）的表達水平。采用已知表達抗體做陽性對照，枸櫞酸緩沖液代替一抗作為陰性對照，染色方法和步驟均按說明書進行。CD31陽性反應(yīng)物為淺棕至深棕色顆粒，分布在血管內(nèi)皮細胞。任何被抗體染色的單個內(nèi)皮細胞或細胞團，不管是否形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤細胞和其他連接組織有清楚界限，都認為是一個可計數(shù)的微血管。根據(jù)Weidner校正方法[6]，在顯微鏡下對所有染色的切片進行微血管計數(shù)。每個切片首先在低倍鏡下觀察，找到切片微血管密集的區(qū)域，然后擴大至高倍鏡下觀察，隨機選取5個視野進行微血管計數(shù)，取其平均值記為該病例近或遠心端的CD31-MVD值。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS23.0軟件進行分析。計量資料以±s 表示，采用配對t 檢驗及獨立樣本t 檢驗分析良惡性結(jié)節(jié)近心端與遠心端MVD組內(nèi)及組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

CD31 在所有病例中均呈陽性表達，陽性反應(yīng)物為淺棕至深棕色顆粒，主要存在于血管內(nèi)皮細胞，見圖1。在惡性結(jié)節(jié)中，結(jié)節(jié)的近心端與遠心端的MVD差異顯著，近心端的MVD明顯高于遠心端（19.2±8.6 vs. 13.3±6.8，P ＜0.05)。在炎性結(jié)節(jié)中，近遠心端的MVD差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。良惡性結(jié)節(jié)組間，在近心端，惡性與炎性結(jié)節(jié)之間的微血管數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在遠心端，炎性結(jié)節(jié)的MVD高于惡性結(jié)節(jié)，差異有統(tǒng)計學意義（28.2±10.0 vs. 26.8±3.0，P＜0.05）。

圖1 CD31在良惡性肺結(jié)節(jié)中的表達（SP染色，×400）

3 討論

肺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別診斷一直是臨床與影像關(guān)注的重點與難點。早期明確病變性質(zhì)對于臨床的決策至關(guān)重要。既往，在肺結(jié)節(jié)良惡性的影像學鑒別診斷中，PET以及CT增強的相關(guān)研究多數(shù)著重于結(jié)節(jié)代謝水平、強化程度、結(jié)節(jié)血供情況及其與時間的動態(tài)關(guān)系等特征，協(xié)助鑒別結(jié)節(jié)性質(zhì)[7]。然而，良惡性結(jié)節(jié)的CT形態(tài)學征像及其強化特征仍有較多重疊，炎性肉芽腫類疾病也常在PET上表現(xiàn)出類似惡性結(jié)節(jié)的高代謝，使其鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性的能力受限[8-9]。近年來，影像組學在醫(yī)學影像學領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注，它通過提取感興趣區(qū)內(nèi)的高維度特征數(shù)據(jù)如紋理、組織直方圖、分形維等，來定量描述病變的異質(zhì)性[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)不均質(zhì)的紋理特征一定程度上可以反映腫瘤缺氧變性及壞死、腫瘤血管生成等腫瘤生物學特性，且與腫瘤葡萄糖代謝水平及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等分期相關(guān)，并認為該分析手段在腫瘤的定性、分級與分期等方面均具有潛在的應(yīng)用價值[14-16]。然而，尚未見有直接涉及與腫瘤血供方向相關(guān)的腫瘤影像空間特征研究。2015年，我們關(guān)于孤立性肺結(jié)節(jié)的放射性活性分布的研究發(fā)現(xiàn)，良惡性肺結(jié)節(jié)內(nèi)18F-FDG的代謝空間分布明顯不同：惡性結(jié)節(jié)呈近心端高代謝，而良性結(jié)節(jié)，尤其是炎性結(jié)節(jié)趨向遠心端高代謝并可作為定性診斷重要依據(jù)[3]。2017年周妮娜等[17]關(guān)于分析良惡性結(jié)節(jié)病變代謝分布差異的研究也報道了相似的結(jié) 果。2018年，我們在能譜CT中也發(fā)現(xiàn)了惡性結(jié)節(jié)的碘濃度水平在近心端顯著高于遠心端的現(xiàn)象，并推測其可能與良惡性結(jié)節(jié)近遠心端血供差異相關(guān)[4]。

盡管如此，目前，有關(guān)肺結(jié)節(jié)近遠心端異質(zhì)性研究均僅有影像學觀察性分析，尚缺乏相關(guān)的病理學研究佐證。為進一步分析良惡性肺結(jié)節(jié)近遠心端空間異質(zhì)性差異的病理機制，本研究嘗試用CD31免疫組化染色來對肺結(jié)節(jié)內(nèi)的微血管進行計數(shù)，并分析良惡性肺結(jié)節(jié)MVD近遠心端的差異。本研究發(fā)現(xiàn)惡性結(jié)節(jié)近心端的MVD顯著高于遠心端，這一結(jié)果支持我們前期研究中關(guān)于惡性病灶代謝和碘濃度空間分布不同的結(jié)論。腫瘤是一種血管生成依賴性疾病，腫瘤的MVD與一系列腫瘤生物學行為密切相關(guān)，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[18-19]。惡性結(jié)節(jié)與炎性結(jié)節(jié)的血供模式不同，惡性結(jié)節(jié)血供豐富，異常吻合多，血管基底膜不完整，主要由降主動脈的支氣管動脈供血[7，20]。惡性腫瘤細胞由于有趨向血供的特點，在生長時會向血供豐富的方向（即近心端）發(fā)展。因此腫瘤近心端的血供更加豐富。不過，本組炎性結(jié)節(jié)較少，其近遠心端的微血管數(shù)目之間并不具有顯著的差異，還有待進一步加大樣本驗證。另外，本研究還比較了炎性結(jié)節(jié)與惡性結(jié)節(jié)組間近遠心端的MVD差異，結(jié)果顯示炎性結(jié)節(jié)遠心端的MVD較惡性結(jié)節(jié)高，且差異具有統(tǒng)計學意義。本研究的創(chuàng)新處在于通過檢測良惡性結(jié)節(jié)近遠心端CD31-MVD表達水平，分析良惡性肺結(jié)節(jié)近遠心端血供空間異質(zhì)性特征，為影像學良惡性肺結(jié)節(jié)的空間異質(zhì)性差異提供病理學依據(jù)。與影像組學通過高維度特征數(shù)據(jù)來描述腫瘤空間異質(zhì)性的方法相比，本研究的優(yōu)勢在于更簡便直觀，臨床易于應(yīng)用。然而，本研究的不足之處在于樣本量較小，尤其是炎性結(jié)節(jié)樣本更少。另外，在標本處理時，對近心端與遠心端的選擇具有一定主觀性，今后有必要進一步增加臨床樣本，甚或建立動物實驗?zāi)Ｐ陀枰则炞C。

綜上所述，本研究一定程度上表明了良惡性肺結(jié)節(jié)CD31-MVD表達水平存有近遠心端空間異質(zhì)性的差異，惡性結(jié)節(jié)近心端MVD高于遠心端，炎性結(jié)節(jié)遠心端MVD較惡性結(jié)節(jié)高，可為影像學良惡性肺結(jié)節(jié)的空間異質(zhì)性差異特征提供病理學依據(jù)。