沉默HMGA基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制

李斌武，葉振悅，楊思嘉

1.寧波市奉化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科，浙江 寧波 315500；2.中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院 呼吸科， 浙江 寧波 315010

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）是最常見的肺癌類型，占肺癌的80%～85%[1-2]?；熓欠伟┲饕闹委煼绞?，但化療藥物存在不良反應(yīng)大、易復(fù)發(fā)、易產(chǎn)生耐藥性等多方面的局限[3-4]。盡管以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑為代表的各類靶點(diǎn)抑制劑在治療晚期及復(fù)發(fā)性肺癌上效果優(yōu)于傳統(tǒng)的鉑類化療方案，但依舊存在耐藥性、適應(yīng)證窄等問題[5-7]。因此，尋找新的靶蛋白并闡明其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，可以為肺癌早期診斷和優(yōu)化治療方案上提供思路。

高遷移族蛋白A（high-mobility group A，HMGA）蛋白家族是一類結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子，其通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等相關(guān)基因的表達(dá)[8-10]。HMGA蛋白分為HMGA1和HMGA2兩種亞型，其中HMGA2蛋白的過度表達(dá)被證明與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-13]。因此，研究HMGA蛋白如何調(diào)節(jié)NSCLC增殖和侵襲轉(zhuǎn)移可以為NSCLC的治療提供新的思路?；诖耍覀兺ㄟ^沉默HMGA1和HMGA2基因在A549細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，初步探究了HMGA1和HMGA2在NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人NSCLC細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。RPMI1640完全培養(yǎng)基、胰酶、Annexin V-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒、MTT及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。siRNA-NC、siRNA-HMGA1、siRNA-HMGA2、Opti-MEM及l(fā)ipofectamine2000 均購自上海愛丁堡生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框M1（Forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）、c-Myc、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、β-actin一抗及鼠二抗、兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。實(shí)時(shí)定量PCR（realtime quantitative PCR，Q-PCR）試劑盒/SYBR Green Realtime PCR Master Mix、RIPA細(xì)胞裂解液及血清均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。RNAiso Plus RNA提取試劑盒及FOXM1、c-Myc、ECadherin、N-Cadherin、Vimentin、β-actin引物均購于大連寶生物科技技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及基因沉默：A549細(xì)胞株置于含10%胎牛血清，100 mg/L鏈霉素，100 kU/L青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔板培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置對照組（Control組）、陰性對照組（siRNA-NC組）、siRNAHMGA1組和siRNA-HMGA2組。其中Control組為A549細(xì)胞，siRNA-NC組為轉(zhuǎn)染無序siRNA的A549細(xì)胞，siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2組分別為轉(zhuǎn)染了siRNAHMGA1和siRNA-HMGA2的A549細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中通過 lipofectamine2000將相應(yīng)siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞生長活力：將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以4×104個(gè)/mL接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。之后分別將siRNA-NC、siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至各孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待對應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染6 h之后，更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。之后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h顯色。隨后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩60 s之后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對照組吸光度值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞凋亡由Annexin VFITC和PI凋亡雙染檢測試劑盒染色，通過流式細(xì)胞儀測定。將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/mL接種在6孔板上。待培養(yǎng)細(xì)胞過夜之后，用siRNANC、siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2干擾細(xì)胞48 h，隨后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞按照試劑盒說明書分別用Annexin V-FITC和PI染色，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。FlowJo 7.6軟件用于統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)：將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以5× 105個(gè)/mL接種在6孔板上，待細(xì)胞貼壁之后，在無血清的培養(yǎng)基中饑餓處理細(xì)胞12 h，之后用無菌槍頭進(jìn)行垂直劃痕并用PBS洗去脫落的細(xì)胞。隨后，用siRNA-NC、siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2干擾細(xì)胞48 h，觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.5 Q-PCR測定mRNA：將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種在6孔板上，待細(xì)胞生長至70%左右，將siRNANC、siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2轉(zhuǎn)染至各孔并培養(yǎng)細(xì)胞48 h。收集各組細(xì)胞，用RNAiso Plus試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，RNA的純度和濃度均由微量核酸儀測定。Q-PCR完全按照說明書設(shè)置對應(yīng)參數(shù)，并進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環(huán)40 次。各基因?qū)?yīng)的引物由大連寶生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因及引物序列

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)：待siRNA-NC、siRNAHMGA1和siRNA-HMGA2轉(zhuǎn)染至數(shù)生長期的A549細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h并收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并收集上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整各組蛋白濃度后進(jìn)行上樣。各組蛋白上樣量均為25.0 μg，經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳分離后，目標(biāo)蛋白通過濕法電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。膜上的蛋白用5%（w/v）脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后用一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育 1.5 h。最后，PVDF膜上的蛋白用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色，檢測系統(tǒng)檢測后，用Image J分析條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Bonferroni t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默HMGA1和HMGA2基因可抑制A549細(xì)胞生長

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染siRNA-HMGA1或siRNAHMGA2 24、48、72 h后，與siRNA-NC組比，siRNAHMGA1組和siRNA-HMGA2組A549細(xì)胞生長活力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與siRNAHMGA1組比，siRNA-HMGA2組細(xì)胞的生長活力有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 沉默HMGA1和HMGA2基因可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

HMGA1和HMGA2基因沉默后，A549細(xì)胞凋亡情況由Annexin V-FITC和PI雙染凋亡檢測試劑盒測定。Q2處在Annexin V-FITC（+）/PI（+）象限，代表細(xì)胞處在 凋亡中晚期；Q3處在Annexin V-FITC（+）/PI（-）象限，代表細(xì)胞處在早期凋亡階段。凋亡細(xì)胞數(shù)為處于Annexin V-FITC（+）/PI（+）象限和Annexin V-FITC（+）/ PI（-）象限的細(xì)胞總和[14]。與Control組相比，當(dāng)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-NC 48 h后，細(xì)胞凋亡不顯著，凋亡細(xì)胞百分含量分別為9.2%±2.1%（Control組）和11.7%±1.9%（siRNA-NC組）。而siRNA-HMGA1組和siRNA-HMGA2組的細(xì)胞凋亡率分別為24.1%±3.1%、31.9%±3.8%。siRNA-HMGA1組和siRNA-HMGA2組的細(xì)胞凋亡率高于siRNA-NC組，且siRNA-HMGA2組高于siRNA-HMGA1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 沉默HMGA1和HMGA2基因誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制 待A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2之后培養(yǎng)48 h，Q-PCR檢測結(jié)果顯示，siRNA-HMGA1組和siRNA-HMGA2組A549細(xì)胞FOXM1和c-Myc mRNA的表達(dá)量低于siRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與siRNA-HMGA1組相比，siRNA-HMGA2組中c-Myc mRNA的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖1 HMGA1和HMGA2基因沉默對A549細(xì)胞生長活力的影響

圖2 HMGA1和HMGA2基因沉默對A549細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Q-PCR分析沉默HMGA1和HMGA2基因?qū)549細(xì)胞FOXM1和c-Myc mRNA的調(diào)節(jié)作用

Western blot測定結(jié)果顯示，Control組和siRNA-NC組細(xì)胞FOXM1和c-Myc的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA-HMGA1組和siRNAHMGA2組FOXM1和c-Myc蛋白表達(dá)量顯著低于siRNANC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），且siRNAHMGA2組c-Myc的蛋白表達(dá)量低于siRNA-HMGA1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4 沉默HMGA1和HMGA2基因?qū)549細(xì)胞遷移的影響 A549細(xì)胞具有較高的遷移能力，在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h之后，可導(dǎo)致劃痕顯著愈合。siRNA-NC轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞內(nèi)后并不能顯著抑制細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)A549細(xì)胞HMGA1基因沉默之后，細(xì)胞遷移能力依舊不能被顯著抑制。但是，當(dāng)沉默HMGA2基因在A549細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)后，細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制（見圖5）。

2.5 沉默HMGA2基因抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制

Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-HMGA2沉默其在A549細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)48 h之后，與siRNA-NC組比，siRNAHMGA2組E-Cadherin的mRNA表達(dá)量顯著增加，NCadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖4 沉默HMGA1和HMGA2基因?qū)549細(xì)胞FOXM1和c-Myc蛋白水平的調(diào)節(jié)作用

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)測定HMGA1和HMGA2基因沉默對A549細(xì)胞遷移能力的影響（×4）

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組和siRNA-NC組E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是，當(dāng)HMGA2基因沉默之后，與siRNA-NC組比，siRNAHMGA2組E-Cadherin的蛋白表達(dá)量顯著增加，NCadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。

3 討論

圖6 Q-PCR分析HMGA2基因沉默對A549細(xì)胞內(nèi)E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin mRNA的調(diào)節(jié)作用

圖7 HMGA2基因沉默對A549細(xì)胞內(nèi)E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白水平的調(diào)節(jié)作用

NSCLC是最常見的肺癌類型，也是病死率非常高的肺癌類型。由于缺乏早期診斷靶標(biāo)，大多數(shù)患者確診的時(shí)候都已經(jīng)處于晚期，導(dǎo)致其治療難度增加[1-2]，不論是傳統(tǒng)的鉑類藥物化療方案還是現(xiàn)有的小分子抑制劑，都存在患者容易產(chǎn)生耐藥性、易復(fù)發(fā)等多種局限[4-7]。因此，尋找新的與NSCLC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的靶標(biāo)，并研究其在NSCLC內(nèi)發(fā)揮生物功能的分子機(jī)制，可為NSCLC的早期診斷和臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。非組蛋白染色體蛋白HMGA1和HMGA2被證明在大多數(shù)NSCLC細(xì)胞內(nèi)存在異常表達(dá)[11-13]。HMGA1和HMGA2的異常表達(dá)被證明參與調(diào)控DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等多種通路促進(jìn)NSCLC的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[12-13]。本研究通過siRNA特異性干擾HMGA1和HMGA2的表達(dá)，觀察并分析HMGA1和HMGA2基因沉默對NSCLC細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，不論是沉默HMGA1基因的表達(dá)還是沉默HMGA2基因的表達(dá)，A549細(xì)胞的生長均受到抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HMGA1或者HMGA2基因的沉默均可導(dǎo)致A549細(xì)胞顯著凋亡。與HMGA1基因沉默組相比，HMGA2基因的沉默更容易導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡。有研究表明，HMGA2的表達(dá)與NSCLC的惡性程度密切相關(guān)，NSCLC細(xì)胞惡性增殖能力越強(qiáng)，其表達(dá)量越高[12]。HMGA1和HMGA2通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)及上調(diào)促癌基因如c-Myc等的表達(dá)維持癌細(xì)胞惡性增殖[10，15]。轉(zhuǎn)錄因子FOXM1被證明與HMGA1共同參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)[16-17]。因此，我們通過Q-PCR和Western blot從mRNA和蛋白水平分析了HMGA1和HMGA2基因沉默后FOXM1和c-Myc的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGA1和 HMGA2基因的沉默均可以顯著下調(diào)FOXM1和c-Myc的表達(dá)。與HMGA1基因沉默組相比，HMGA2基因的沉默可顯著下調(diào)c-Myc的表達(dá)，但FOXM1在兩組中的表達(dá)沒有顯著性差異。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HMGA1基因的沉默并不能顯著抑制A549細(xì)胞的遷移能力，但是HMGA2基因沉默后，A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著降低。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial interstitial transformation，EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)時(shí)，常表現(xiàn)為上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)的減少和間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-Cadherin、Vimentin表達(dá)的增多[18]。為了探究HMGA2基因沉默影響A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制，我們用Q-PCR和Western blot評價(jià)了HMGA2沉默后，E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HMGA2基因的沉默，會導(dǎo)致N-Cadherin和Vimentin表達(dá)的下調(diào)，ECadherin表達(dá)的上調(diào)。

綜上所述，沉默HMGA1和HMGA2基因的表達(dá)可顯著抑制NSCLC細(xì)胞株A549的惡性增殖，并通過下調(diào)FOXM1和c-Myc的表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。同時(shí)，沉默HMGA2基因的表達(dá)可顯著下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志蛋白 N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)，上調(diào)上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin的表達(dá)來抑制A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。HMGA 蛋白在NSCLC發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移上的促進(jìn)作用表明，HMGA蛋白可能可作為NSCLC診斷和治療的靶標(biāo)。