MDM2/MDMX-p53雙靶點蛋白增效厄洛替尼抗胰腺癌活性的研究*

井佳瑜，董丹鳳，樊楊威，吳胤瑛，李恩孝，董旭媛

710061西安，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，患者預(yù)后極差，被稱為“癌癥之王”。大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)發(fā)展為局部晚期或者已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，無法手術(shù)治療。晚期胰腺癌的治療方案是以姑息性化療為主的綜合治療，但以吉西他濱為主單藥或者聯(lián)合其他細胞毒性藥物的化療對胰腺癌的有效率很低，且副作用非常大，耐受性差[1-3]。近些年研究者們在胰腺癌靶向治療領(lǐng)域的探索多以失敗告終，僅EGFR抑制劑厄洛替尼取得了陽性的臨床研究結(jié)果。但其對總生存期(overall survival,OS)的改善僅0.4個月，令厄洛替尼的臨床應(yīng)用備受爭議[4-7]。因此，亟需探索增強厄洛替尼療效的方法，提高患者生存及預(yù)后。

野生型p53在抑制腫瘤的形成中起著重要作用，MDM2/MDMX是p53蛋白的重要負調(diào)控因子，一些惡性腫瘤中高表達的MDM2/MDMX會降低p53蛋白的水平和功能，從而加速腫瘤的形成和進展。通過抑制MDM2和MDMX或可恢復(fù)p53的腫瘤抑制功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。最近有研究報道MDM2抑制劑可通過激活p53誘導(dǎo)DYRK1A降解，降低EGFR的穩(wěn)定性，從而間接抑制EGFR蛋白表達[8-10]。這些研究提示我們抑制MDM2/MDMX可激活p53，同時下調(diào)EGFR表達，有可能與EGFR抑制劑有協(xié)同抗腫瘤作用。

課題組在前期研究中已經(jīng)成功合成了具有透膜性且能靶向阻斷MDM2-p53和MDMX-p53相互作用的重組蛋白,即MDM2/MDMX-p53抑制蛋白，并已發(fā)現(xiàn)該重組蛋白在乳腺癌中具有很好的抗腫瘤活性[11]。本研究主要使用p53野生型胰腺癌細胞株ASPC-1和p53突變型胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1，分別給予厄洛替尼、MDM2-p53抑制劑、MDM2/MDMX-p53抑制蛋白聯(lián)合厄洛替尼、MDM2抑制劑聯(lián)合厄洛替尼等處理。通過MTT、細胞凋亡實驗等體外探討聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白是否可增效厄洛替尼的抗腫瘤活性。進一步構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，探討MDM2/MDMX-p53抑制蛋白能否在體內(nèi)促進厄洛替尼的抗胰腺癌活性。并應(yīng)用Western-blotting等方法對相關(guān)機制進行初步探討，從實驗上探尋提高胰腺癌治療療效的可行性方法。

1 材料與方法

1.1 材料

兩種人胰腺癌細胞株：PANC-1和ASPC-1，前者購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，后者由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供。MDM2/MDMX-p53蛋白抑制劑的制備參考本課題組前期研究文獻[11]。實驗裸鼠(24只)為Balb/c、nu/nu雌性裸鼠，4～8周齡，體重18～22 g，SPF級。

1.2 方法

MTT實驗：細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度梯度的MDM2/MDMX-p53抑制蛋白、MDM2-p53抑制劑(Nutlin-3a)以及Erlotinib，培育48 h；加入MTT溶液20 μL孵育4 h，在酶聯(lián)免疫儀上選擇490 nm波長測定吸光度值，并計算5孔平均值；繪制細胞的生長曲線，了解藥物對細胞活性的影響。

Matrigel transwell小室檢測細胞的侵襲能力：實驗分為6組，處理組1：陰性對照組；處理組2：單用IC50濃度(ASPC-1 細胞3.482 μg/mL；PANC-1細胞4.461 μg/mL)的厄洛替尼組；處理組3：單用IC10濃度(ASPC-1細胞10.08 μg/mL；PANC-1細胞14.072 μg/mL)的MDM2-p53抑制劑Nutlin-3a組；處理組4：單用IC10濃度(ASPC-1細胞5.268 μg/mL；PANC-1細胞6.679 μg/mL)的MDM2/MDMX-p53雙靶點抑制蛋白組；處理組5：聯(lián)合使用IC50濃度的厄洛替尼和IC10濃度的單靶點抑制劑組；處理組6：聯(lián)合使用IC50濃度的厄洛替尼和IC10濃度的雙靶點抑制蛋白組。各組加入相應(yīng)藥物后進行試驗，具體操作參考說明書(BD公司)進行。

Annexin V/7-AAD檢測細胞凋亡：細胞分組及空白對照同前，處理24 h后參照凋亡試劑盒說明書，流式細胞儀檢測凋亡。Western-blotting檢測蛋白的表達水平：細胞分組同前，分別給與不同抑制劑處理后48 h候收集蛋白，各單克隆抗體具體情況如下：p53抗體(Abcam)，稀釋比例1∶1 000；MDM2抗體(Abcam)，稀釋比例1∶1 000；MDMX抗體(Abcam)，稀釋比例1∶1 000；EGFR抗體(CST)，稀釋比例1∶1 000；HRP標記GAPDH(Proteintech)，稀釋比例1∶5 000。HRP標記兔二抗(CST)，稀釋比例1∶10 000。操作步驟同其他Western-blotting試驗步驟。

體內(nèi)實驗：ASPC-1細胞懸液皮下接種于24只裸鼠的右后肢。實驗裸鼠隨機分為4組，每組6只，每組均接受不同藥物干預(yù)，第一組：等體積PBS口服；第二組：MDM2/MDMX-p53抑制蛋白20mg/kg/d，瘤內(nèi)注射；第三組：厄洛替尼50 mg/kg/d，灌胃；第四組：厄洛替尼50 mg/kg/d，灌胃+MDM2/MDMX-p53抑制蛋白20 mg/kg/d，瘤內(nèi)注射。觀察腫瘤的生長情況，每2 d測量腫瘤大小和裸鼠體重變化，以腫瘤體積為縱坐標、時間為橫坐標繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率：抑瘤率(%)=(陰性對照組瘤重-干預(yù)組瘤重)/陰性對照組瘤重×100%。

1.3 統(tǒng)計分析

所有實驗結(jié)果用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差表示。多組間差異的比較采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計分析均為雙側(cè)概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白可更有效地抑制胰腺癌細胞的增殖活性

不同濃度梯度的MDM2/MDMX-p53抑制蛋白、MDM2-p53抑制劑(Nutlin-3a)和厄洛替尼作用于ASPC-1細胞或PANC1細胞48 h，繪制細胞生長抑制曲線，計算其IC50、IC10值。結(jié)果顯示：MDM2/MDMX-p53雙靶點抑制蛋白抑制ASPC1細胞和PANC1細胞增殖活性的能力強于MDM2-p53抑制劑(圖1A、C)。其中雙靶點抑制蛋白、Nutlin-3a分別處理ASPC-1細胞后的IC10為5.27 μg/mL和10.08 μg/mL；而在PANC-1細胞中，雙靶點抑制蛋白、Nutlin-3a分別處理細胞后的IC10為6.68 μg/mL和14.07 μg/mL。為了說明雙靶點抑制蛋白以及單靶點抑制劑可促進厄洛替尼的抗胰腺癌作用，而非其自身抗胰腺癌的活性，我們選取低濃度(IC10)作為聯(lián)合用藥的濃度。結(jié)果顯示：厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白比聯(lián)合單靶點抑制劑能更顯著地抑制ASPC1細胞和PANC1細胞的增殖活性(圖1B、D)。

圖1 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白可顯著抑制胰腺癌細胞增殖活性

2.2 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白抑制胰腺癌細胞的侵襲能力

實驗分組同試驗方法中分組，分別加相應(yīng)藥物干預(yù)處于對數(shù)生長期的ASPC-1胰腺癌細胞株48 h。用Matrigel transwell小室實驗檢測細胞的侵襲能力。在ASPC-1細胞株中(圖2A、B)，不同干預(yù)措施能降低ASPC-1細胞的侵襲能力，各處理組平均穿膜細胞數(shù)依次為：(91.50±2.65)個、(43.75±1.71)個、(41.5±1.29)個、(39.75±1.71)個、(28.50±1.29)個、(19.25±0.96)個，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白干預(yù)后穿膜細胞數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(F=339.858，P<0.01)。在PANC-1細胞株中(圖2C、D)，結(jié)果顯示：各處理組平均穿膜細胞數(shù)為：(71.25±2.63)個、(42.25±2.22)個、(43.25±1.71)個、(37.75±2.06)個、(32.00±1.83)個、(16.75±1.50)個，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白干預(yù)后穿膜細胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=337.089，P<0.01)。

圖2 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白抑制胰腺癌細胞的侵襲能力

2.3 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白促進胰腺癌細胞的凋亡

參照試驗方法中的實驗分組分別干預(yù)處于對數(shù)生長期的ASPC-1細胞株48 h，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。結(jié)果顯示(圖3A)：陰性對照組早期凋亡細胞比例為零，各處理組早期凋亡細胞比例依次為9.53%±1.54%、5.46%±1.64%、2.91%±2.05%、1.83%±0.48%、1.37%±0.53%；各處理組干預(yù)后ASPC-1細胞早期凋亡比例增加，與對照組相比，這種差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=234.198，P<0.05)。對比其他組，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白誘導(dǎo)ASPC-1細胞凋亡的比例更高(P<0.05)。

PANC-1細胞處理48 h后流式細胞儀分析凋亡情況。結(jié)果顯示(圖3B)：陰性對照組無早期凋亡細胞，各處理組早期凋亡細胞比例依次為7.67%±1.42%、4.98%±2.01%、2.62%±1.03%、1.65%±0.55%、1.27%±0.34%；各處理組干預(yù)后PANC-1細胞早期凋亡比例增加，與對照組相比，這種差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=318.710，P<0.05)。對比其他組，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白誘導(dǎo)PANC-1細胞凋亡的比例更高(P<0.05)。

圖3 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白促進胰腺癌細胞的凋亡

2.4 厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53雙靶點抑制蛋白體外抗腫瘤作用機制研究

用Western-blotting方法檢測經(jīng)過處理后胰腺癌細胞中相關(guān)蛋白的表達情況。ASPC-1細胞分別加入DMSO(control)、Erl(厄洛替尼 3.48 μg/mL)、MDM2/MDMX inhibitor(5.27 μg/mL)、Com(厄洛替尼聯(lián)合MDM2-p53抑制蛋白組)，處理48 h后收集細胞蛋白，Western blotting方法檢測p53蛋白、MDM2、MDMX、EGFR蛋白的表達水平。PANC-1細胞分別加入DMSO(control)、Erl(厄洛替尼 4.46 μg/mL)、MDM2/MDMX inhibitor(6.68 μg/mL)、Com(厄洛替尼聯(lián)合MDM2-p53抑制蛋白組)，處理48 h后收集細胞蛋白，Western blotting方法檢測P53蛋白、MDM2、MDMX、EGFR蛋白的表達水平。結(jié)果顯示厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53雙靶點抑制蛋白在兩種胰腺癌細胞中均可下調(diào)MDM2/MDMX表達，上調(diào)p53表達，下調(diào)EGFR表達，在ASPC1細胞中更為顯著(圖4)。

圖4 厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53雙靶點抑制蛋白體外抗腫瘤機制

2.5 厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制劑抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長

按照實驗分組對成瘤裸鼠進行干預(yù)處理，21 d后各處理組荷瘤小鼠如圖所示(圖5A)。各組干預(yù)下裸鼠移植瘤的抑瘤率分別為22.47%、28.41%，55.39%。厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5B)。裸鼠移植瘤的生長曲線顯示，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白組干預(yù)后腫瘤體積縮小；各干預(yù)組裸鼠體重無明顯差異(圖5C)，說明厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX抑制蛋白可安全、顯著地抑制裸鼠移植瘤的生長。

圖5 雙靶點抑制蛋白聯(lián)合厄洛替尼的體內(nèi)抗腫瘤活性

3 討 論

惡性腫瘤的治療已經(jīng)逐漸從“細胞毒藥物為主導(dǎo)的化療”時代向“靶向藥物精準治療”時代轉(zhuǎn)變。作為“癌癥之王”的胰腺癌，其腫瘤細胞與其他惡性腫瘤有一些共同的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移機制，也伴有抑癌基因p53、ATM的失活或原癌基因如CTNNB1、MDM2的異常激活和過表達[8-10]，但又有其獨特性和復(fù)雜性。多年來在胰腺癌內(nèi)科治療領(lǐng)域，尤其是靶向治療領(lǐng)域，一直沒有取得飛躍性的突破[9-10]。2013年一項III期臨床試驗證實，在49%的胰腺癌患者腫瘤組織中存在EGFR過表達[10]。隨后更多研究表明，EGFR的過表達對胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展十分重要，并且影響胰腺癌患者的預(yù)后[9-11]。厄洛替尼可選擇性地抑制細胞內(nèi)的EGFR，阻止其激活和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，胰腺癌患者對厄洛替尼的臨床反應(yīng)較差，僅小部分患者可能受益，使得其應(yīng)用備受爭議。

MDM2/MDMX是p53的負調(diào)控因子，能抑制p53的活性，使用MDM2/MDMX抑制劑能降低MDM2/MDMX的表達水平，減少p53的降解，恢復(fù)p53的轉(zhuǎn)錄活性。并且，MDM2抑制劑能間接負調(diào)控EGFR蛋白水平，降低EGFR蛋白的表達水平[5]。因此，MDM2/MDMX-p53抑制蛋白聯(lián)合厄洛替尼可能起到協(xié)同抗胰腺癌的作用。

我們前期設(shè)計和構(gòu)建了靶向抑制MDM2/MDMX-p53的原核表達載體，可表達高純度、具有透膜性的MDM2/MDMX-p53抑制蛋白[11]。體外研究結(jié)果顯示，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白有抗胰腺癌活性，能抑制p53野生型和p53突變型胰腺癌細胞的增殖、侵襲能力，并且能誘導(dǎo)胰腺癌細胞的凋亡，對比單用厄洛替尼、單用抑制劑、厄洛替尼聯(lián)合MDM2-p53抑制劑，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白的抑制作用更強。Western-blotting方法檢測p53、MDM2、MDMX、EGFR蛋白的表達情況時，p53野生型和p53突變型胰腺癌細胞中蛋白表達情況不一樣，反映了作用機制可能并不相同。p53野生型胰腺癌細胞中p53蛋白表達水平上調(diào)，MDM2、MDMX、EGFR蛋白表達水平下調(diào)，對比單用厄洛替尼組，聯(lián)合使用雙靶點抑制蛋白組EGFR表達水平降低更多。這可能是由于MDM2/MDMX-p53抑制蛋白有效結(jié)合了MDM2、MDMX，降低其表達水平并且阻止其與p53結(jié)合，減少p53降解，而p53能負調(diào)控DYRK1A，促進EGFR降解，從而間接降低了EGFR的表達水平。DYRK1A在腫瘤中高度表達，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[12]，它是一種雙特異性的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶，通過磷酸化EGFR信號調(diào)節(jié)因子而阻止EGFR的降解[13]；同時，EGFR蛋白表達水平下調(diào)會通過PI3K/AKT通路促進MDM2蛋白降解，并抑制MDM2蛋白的泛素促進功能，最終導(dǎo)致p53恢復(fù)抑癌活性，表達水平上調(diào)。在非小細胞肺癌、肝細胞肝癌中，阻斷PI3K/AKT/MDM2通路可抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展[14-15]。結(jié)合既往報道，MDM2/MDMX-p53抑制蛋白與厄洛替尼協(xié)同抗腫瘤的具體機制還需要進一步研究來證實。此外，p53突變型胰腺癌細胞中，厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白處理后，MDM2和MDMX表達水平減低，細胞增殖抑制、侵襲能力降低，但p53和EGFR蛋白的表達水平無明顯變化，提示可能MDM2/MDMX具有不依賴于p53的獨立致癌作用，具體機制有待進一步研究揭示。

本研究進一步探討了雙靶點抑制蛋白聯(lián)合厄洛替尼的體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，對比單用厄洛替尼、雙靶點抑制蛋白，厄洛替尼聯(lián)合雙靶點抑制蛋白對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用更強。說明聯(lián)合治療在體內(nèi)也能發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤活性，且毒副作用可控。然而，盡管體內(nèi)外研究充分肯定了厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白在胰腺癌中抗腫瘤活性以及安全性，但將其應(yīng)用于臨床還需要大量的臨床前研究和臨床試驗來證實。

綜上所述，基于本研究的體外、體內(nèi)實驗結(jié)果，我們有理由相信在未來的胰腺癌治療中，這種協(xié)同抗癌治療效果會表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。而如何篩選出優(yōu)勢人群、如何選擇合適的患者都將是未來可能面臨的問題。進一步深入并在機制方面研究厄洛替尼聯(lián)合MDM2/MDMX-p53抑制蛋白的抗胰腺癌作用，可為我們提供更多的實驗依據(jù)。另外，胰腺癌的異質(zhì)性較大，單一遺傳背景的細胞系可能無法很好地代表胰腺癌本身的生物學(xué)活性，后續(xù)研究中通過構(gòu)建PDX模型，有望更好地模擬胰腺癌的特點，并進一步探討聯(lián)合治療的可行性和有效性。

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