2株生防細(xì)菌協(xié)同拮抗馬鈴薯瘡痂病及其防治效果研究

李麗艷 孫杉杉 章孜亮 楊娜 戚家明 杜迎輝

摘要?為篩選出對馬鈴薯瘡痂病具有顯著拮抗作用且較強(qiáng)田間防效的生防細(xì)菌，采用室內(nèi)平皿拮抗及田間防效應(yīng)用試驗，檢測菌株對馬鈴薯瘡痂病的抑制效果。采用對峙培養(yǎng)試驗確定了熒光假單孢菌、解淀粉芽孢桿菌菌體及其發(fā)酵菌液對馬鈴薯瘡痂病菌均有明顯抑菌效果，抑菌圈直徑分別為11、5 mm和15、9 mm;將2種菌株發(fā)酵菌液按照1∶1、2∶1復(fù)配后，抑菌圈直徑分別提高至17、28 mm，說明2種菌液復(fù)配對馬鈴薯瘡痂病菌的抑制作用可以起到一定增效效果。通過田間防效試驗驗證了單一菌肥施用及2種菌肥混合施用對馬鈴薯瘡痂病的防治效果。單一菌肥對馬鈴薯瘡痂病的防效熒光假單孢菌（73.18%）優(yōu)于解淀粉芽孢桿菌（49.31%），而2種菌肥配施防效顯著優(yōu)于單一菌肥，防效達(dá)91.7%。說明熒光假單孢菌及解淀粉芽孢桿菌2種菌肥配施可以有效防治馬鈴薯瘡痂病，在田間應(yīng)用及推廣過程中具有巨大的潛力。

關(guān)鍵詞?熒光假單孢菌;解淀粉芽孢桿菌;馬鈴薯瘡痂病;防效

中圖分類號?S435.32?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.032

Abstract?In order to screen out biocontrol bacteria that have a significant antagonistic effect on potato scab and have a strong field control effect，indoor plate resistance and field control effect tests were used to detect the inhibitory effect of the strain on potato scab. The confrontation culture test was used to determine that Pseudomonas fluorescens，Bacillus amyloliquefaciens and their fermentation broth had obvious antibacterial effects on potato scab bacteria，and the diameters of the inhibition circles were 11，5 mm and 15，9 mm; after the fermentation liquid of the two strains was compounded according to 1∶1 and 2∶1，the diameter of the bacteriostatic circle was increased to 17 and 28 mm，indicating that the combination of the two bacterial liquids could inhibit the potato scab.The effect could play a certain synergistic effect. The control effect of single bacterial fertilizer application and mixed application of two bacterial fertilizers on potato scab was verified through field control efficacy tests. The control effect of single bacterial fertilizer on potato scab （Pseudomonas fluorescens （73.18%） was better than Bacillus amyloliquefaciens （49.31%），and the combined control effect of the two bacterial fertilizers was significantly better than the single bacterial fertilizer，the control effect reached 91.7 %. It showed that the combined application of Pseudomonas fluorescens and Bacillus amyloliquefaciens fertilizer could effectively control potato scab，and it had great potential for application and promotion in the field.

Key words?Pseudomonas fluorescens;Bacillus amyloliquefaciens;Potato scab;Control effect

近年來由瘡痂鏈霉菌 （Streptomyces scrabies） 引起的馬鈴薯瘡痂病日益嚴(yán)重，直接影響馬鈴薯的品質(zhì)，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。該病病原瘡痂鏈霉菌可在植物病殘體或土壤中存活多年，一旦條件適宜就會侵染馬鈴薯塊莖，致馬鈴薯表面形成凹陷或凸起的瘡痂狀粗糙硬斑塊，嚴(yán)重影響馬鈴薯的外觀品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值[1-2]。對于該病目前尚缺乏安全有效的防治方法，大多采用化學(xué)農(nóng)藥的方法，雖然短期內(nèi)有一定防治效果，但長期使用不僅污染環(huán)境、危害人類健康，還會造成土壤中菌群失調(diào)，病害日益加重[3]。生物防治未來將成為馬鈴薯瘡痂病防治的熱點和趨勢，該方法主要是利用微生物及其代謝產(chǎn)物來抑制病害的發(fā)生，是一種環(huán)境友好型的病害防治方法。近年來，已有諸多學(xué)者篩選出了對馬鈴薯瘡痂病具有防治效果的生防菌株[4-7]，但單一微生物菌劑往往存在功能單一、適應(yīng)能力差、防效不穩(wěn)定等問題[8]。將不同功能菌株組合，得到比單一微生物菌劑促生能力更強(qiáng)、更穩(wěn)定的微生物復(fù)合菌劑，是微生物菌劑發(fā)展的趨勢[9-11]，Siddiqui 等[12]利用熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescens）和根瘤菌（Rhizobium sp.）配制的復(fù)合菌劑防治豌豆枯萎病，與單一菌劑相比，豌豆枯萎病發(fā)病率顯著降低。但迄今未見利用2種生防菌株協(xié)同防治馬鈴薯瘡痂病的報道。筆者通過室內(nèi)拮抗及田間防效試驗，旨在篩選出對馬鈴薯瘡痂病菌防效顯著的生防菌株，以期為馬鈴薯瘡痂病優(yōu)良生防菌劑的開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試菌株?熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescens）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、病原菌瘡痂鏈霉菌（S.scabies），均為領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司微生物實驗室保存菌株。

1.2?拮抗菌株的抑菌能力測定?參考郭鳳柳等[7]的紙碟法對拮抗菌株的抑菌能力進(jìn)行測定，略有改動。將瘡痂病菌制成 5×106 CFU/mL的孢子懸液，取 50 μL 均勻涂布于 PDA平板上，挑取一環(huán)拮抗菌株涂在已涂布瘡痂病菌孢子懸液的PDA 培養(yǎng)基平板上，不接種的平板為對照，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中生長4 d 后，觀察抑菌圈并測量其直徑。

1.3?拮抗菌株發(fā)酵菌液及無菌濾液的抑菌活性測定?參考文獻(xiàn)[13]的方法制備拮抗菌株發(fā)酵液及無菌濾液。挑取一環(huán)拮抗菌株接種于 100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28?℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h后為發(fā)酵菌液。將發(fā)酵菌液于高速冷凍離心機(jī)上 4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，上清用 0.22 μm 細(xì)菌濾膜過濾除菌，得到其無菌濾液。采用平板打孔法[14]測定拮抗菌株發(fā)酵菌液及無菌濾液對馬鈴薯瘡痂病的抑菌能力，以加入等量無菌水為對照，30 ℃恒溫培養(yǎng) 4 d 后，測定抑菌圈直徑。

1.4?拮抗菌株及其發(fā)酵菌液的解磷能力測定

參考王效禹[15]的方法測定拮抗菌株的解磷能力。挑取一環(huán)拮抗菌株涂在蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察并測量溶磷圈直徑;制備拮抗菌發(fā)酵菌液，按照5%的接種量轉(zhuǎn)接入蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基上，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，取5 mL培養(yǎng)液，于12 000 r/min、4 ℃下離心5 min，上清液采用鉬銻抗比色法測定解磷量。

1.5?2種菌肥對馬鈴薯瘡痂病的防治效果

試驗在河北省昌黎泥井長年種植馬鈴薯區(qū)域開展。對照：空白處理;處理①：熒光假單孢菌發(fā)酵菌液75 L/hm2;處理②：37.5 L/hm2解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵菌液;處理③：熒光假單孢菌發(fā)酵菌液75 L/hm2+37.5 L/hm2解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵菌液，各處理均按照常規(guī)種植措施管理。待馬鈴薯收獲后進(jìn)行馬鈴薯瘡痂病病害分級鑒定，計算病情指數(shù)和防治效果[16]。

2?結(jié)果與分析

2.1?拮抗細(xì)菌對馬鈴薯瘡痂病菌的抑菌活性?分別測定了熒光假單孢菌和解淀粉芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂病菌的抑菌活性。測定結(jié)果表明，2株拮抗菌對瘡痂病菌均有一定的抑制能力，抑菌圈直徑分別為11和5 mm（圖1b、c），說明菌株熒光假單孢菌對馬鈴薯瘡痂病菌的室內(nèi)拮抗效果更好。

2.2?發(fā)酵菌液及無菌濾液的抑菌活性

采用平板打孔法測定單一菌株發(fā)酵菌液、無菌濾液及復(fù)合發(fā)酵菌液的抑制效果，結(jié)果見圖2。由圖2可知，2種菌株的發(fā)酵菌液對瘡痂病菌均有明顯的抑菌效果，但無菌濾液沒有抑制作用;將2種菌株發(fā)酵按照1∶1、1∶2復(fù)配后，抑菌圈直徑分別由單一菌株的9、15 mm提高至17、28 mm（表1）。說明熒光假單孢菌與解淀粉芽孢桿菌2種發(fā)酵菌液復(fù)配對馬鈴薯瘡痂病菌的抑制作用可以起到一定增效效果。

2.3?拮抗菌株及其發(fā)酵菌液的解磷能力?分別測定了2株拮抗菌株的解磷能力。結(jié)果表明，熒光假單孢菌對無機(jī)磷有較明顯的溶解作用（5 mm），而解淀粉芽孢桿菌未見明顯解磷能力;采用鉬銻抗比色法測定了熒光假單孢菌的解磷能力，對照有效磷濃度為0.55 mg/L，熒光假單孢菌溶液中有效磷濃度為395.78 mg/L，說明熒光假單孢菌對無機(jī)磷具有較強(qiáng)降解能力（圖3）。

2.4?2種菌肥對馬鈴薯瘡痂病的防治效果

于8月收獲期調(diào)查馬鈴薯瘡痂病發(fā)病情況。結(jié)果表明，單一菌肥施用及2種菌肥混合施用均對馬鈴薯瘡痂病有顯著防效，單一菌肥防效處理①優(yōu)于處理②（表2），而2種菌肥配施處理防效優(yōu)于單一菌肥處理，防效可達(dá)91.7%。說明熒光假單孢菌菌劑及解淀粉芽孢桿菌菌劑2種菌肥配合施用可以有效防治馬鈴薯瘡痂病。

3?結(jié)論與討論

隨著植物病害的日趨嚴(yán)重，生物防治已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點。其中熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescens）及解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）作為非常重要的根際促生菌，在防治植物土傳病害、增加作物產(chǎn)量以及防病、定殖機(jī)理方面已有諸多報道[17-22]。在防治馬鈴薯病害方面，蔣繼志等[23]從馬鈴薯根際土壤中篩選出了顯著拮抗致病疫霉且離體防病效果顯著的熒光假單孢菌M15，菌液在馬鈴薯塊莖切片上對晚疫病的預(yù)防效果為65.06%;高同國等[24]篩選得到 1 株對馬鈴薯瘡痂病拮抗活性明顯的解淀粉芽孢桿菌12-82。除上述報道外，國內(nèi)關(guān)于利用熒光假單孢菌或解淀粉芽孢桿菌防治馬鈴薯病害特別是馬鈴薯瘡痂病的研究較少。

該研究利用筆者所在實驗室保存菌株篩選出了對馬鈴薯瘡痂病具有顯著拮抗作用且較強(qiáng)田間防效的生防細(xì)菌熒光假單孢菌、解淀粉芽孢桿菌，2種菌株發(fā)酵菌液按照1∶1、2∶1復(fù)配后，抑菌圈直徑分別由單一菌株15、9 mm提高至17、28 mm;田間防效試驗表明單一菌肥對馬鈴薯瘡痂病的防效熒光假單孢菌（73.18%）優(yōu)于解淀粉芽孢桿菌（49.31%），2種菌肥配施防效顯著優(yōu)于單一菌肥（防效91.7%）。說明熒光假單孢菌及解淀粉芽孢桿菌2種菌肥配施可以有效防治馬鈴薯瘡痂病，在田間應(yīng)用及推廣過程中具有巨大的應(yīng)用潛力。

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