26份水稻材料白葉枯病和稻飛虱病抗性基因檢測與分析

宗凱 盛旋 呂俠影 程瀟 李云飛 孫娟娟 李克娟 余曉峰 姚劍

摘要?對26份水稻材料進(jìn)行抗病基因檢測，包括8個白葉枯病抗性基因（Xa1、 xa5、 Xa7、xa13、 Xa21、 Xa23、 Xa26、 Xa27）和2個稻飛虱病抗性基因（Bph14、 Bph15）。其中23份水稻材料中含有Xa1基因材料20份，含xa5基因材料20份，含Xa7基因材料23份，含xa13基因材料12份，含 Xa21基因材料9份，含 Xa23基因材料23份，其中抗性4份，感性19份，含Xa26基因材料23份，含Xa27基因材料21份，其中抗性5份，感性16份。另有3份材料進(jìn)行稻飛虱病抗性基因Bph14、Bph15檢測，檢測結(jié)果表明這3份材料均含有Bph14、Bph15基因。選取13個已報道的基因標(biāo)記或連鎖標(biāo)記檢測26份雜交稻材料，初步確定了其抗白葉枯病和抗稻飛虱病等位基因分布和利用情況，為水稻基礎(chǔ)材料的篩選、親本材料的選擇及育種應(yīng)用提供了良好的參考。

關(guān)鍵詞?水稻品系;抗性基因;白葉枯病;鑒定

中圖分類號?S435.11?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）01-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.023

Abstract?Twenty-six rice varieties were tested for disease resistance genes， including eight bacterial blight resistance genes （Xa1， xa5， Xa7， xa13， Xa21， Xa23， Xa26， Xa27） and two rice planthopper disease resistance genes （Bph14， Bph15）. Among them， 23 rice materials contained 20 Xa1 genetic materials， 20 xa5 genetic materials， 23 Xa7 genetic materials， 12 xa13 genetic materials， 9 Xa21 genetic materials， 23 Xa23 genetic materials， including 4 resistance， 19 susceptibility， 23 Xa26 genetic materials and 21 Xa27 genetic materials， including 5 resistance and 16 susceptibility. Three other materials were tested for Bph14 and Bph15 genes of rice planthopper disease resistance. The results showed that all the three materials contained Bph14 and Bph15 genes. The distribution and utilization of alleles for resistance to bacterial blight and rice planthopper disease in 26 hybrid rice materials were preliminarily determined by screening 13 reported gene markers or linkage markers， which provided a good reference for screening basic rice materials， selection of parent materials and breeding application.

Key words?Rice strains;Resistance gene;Bacterial blight;Identification

水稻是我國重要的主糧之一，而白葉枯病和稻飛虱病是水稻生產(chǎn)中重要的，也是常見的病蟲害[1-2]，針對這2種病蟲害的抗性基因定位和克隆一直備受關(guān)注。目前已有超過26個白葉枯病抗性基因和20個褐稻飛虱病抗性基因被定位，其中7個白葉枯病抗性基因和1個褐稻飛虱病抗性基因已經(jīng)被克隆，與此同時，與這些抗性基因緊密連鎖或者共分離的分子標(biāo)記被開發(fā)出來，利用這些已鑒定的分子標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確地篩選和鑒定出水稻材料中所含的抗性基因類型，輔助水稻育種親本材料的篩選，顯著加速育種過程。該研究篩選8個白葉枯病抗性基因（Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27）和2個稻飛虱病抗性基因（Bph14、Bph15）的分子標(biāo)記，對26份雜交稻親本材料所含抗性基因以及其等位基因分布情況進(jìn)行鑒定和分析，以期為水稻后續(xù)育種提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

水稻材料由安徽袁氏農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，共計26個水稻品系種子（美1、孟R、9311、578、513、小提供灰21、OM6162、繁殖1、繁殖2、馬粘、玉香、AD2168、NGGYEN、巴馬、華素、泰早、孟紅、鎮(zhèn)稻18、豐兩優(yōu)秀1號、豐兩優(yōu)秀6號、豐兩優(yōu)秀4號、鎮(zhèn)稻19、普通野生稻、W644、S234、234）。

1.2?儀器與設(shè)備

PCR儀，美國ABI公司;DNA/RNA分析系統(tǒng)，德國QIAGEN公司。

1.3?方法

鑒定白葉枯抗性基因Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27這8個基因所用分子標(biāo)記來自文獻(xiàn)[3，5]（表1）。鑒定2個稻飛虱病抗性基因Bph14、Bph15所用分子標(biāo)記來自文獻(xiàn)[6-7]（表2）。種子DNA提取采用磁珠全自動核酸提取儀。

2?結(jié)果與分析

2.1?23份水稻材料白葉枯病抗性基因檢測結(jié)果

Xa1是已克隆的NBS-LRR類白葉枯病抗性基因，在NCBI中基因ID為AB002266.1，采用Xa1-F和Xa1-R這對連鎖標(biāo)記對23個水稻品系進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1（A）。除9號、10號、13號未檢測到抗性基因外，其他均檢出Xa1抗性基因。其中1號擴出2條目的帶，一條與抗性等位基因目的帶在相同位置，另一條則比抗性等位基因目的帶大約100 bp。11號、12號、19～21號、23號均存在2條目的帶，推測除檢出與抗性對照等位基因的目的帶外還存在另一等位基因。

xa5位于5號染色體，cDNA全長906 bp，包含3個外顯子，編碼一個由106個氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，xa5是一個隱性抗病基因，其基因結(jié)構(gòu)與其他典型抗病基因的結(jié)構(gòu)都不一樣。xa5序列在抗病和感病品種中有2個堿基的差異（GTC→GAG），導(dǎo)致第39位氨基酸的改變[纈氨酸（V）變成谷氨酸（E）]。xa5所用的分子標(biāo)記檢出除2～4號未擴出，其他均擴出，見圖1（B）。經(jīng)測序1號、5～23號在第39位編碼的是纈氨酸（V），為抗性品系。

1～23份水稻材料均擴出抗性基因Xa7，見圖1（C），11～12號樣品產(chǎn)物條帶較淡，5～7號擴增產(chǎn)物大小與其他不一致，對5～7號樣品擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)5號和7號樣品產(chǎn)物測序比對后基因序列基本一致，6號在2個位置與5號、7號存在差異，在接近5端6號多1個G，在接近3端6號與5號、7號存在微略差異：“CCCCGTCCGGCATCTA” →“GCCCGCCCGGCAT”。

xa13是1個隱性抗白葉枯病基因，cDNA 全長1 516 bp，包含5個外顯子，編碼1個由307個氨基酸組成、含有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白產(chǎn)物。所采用的分子標(biāo)記能通過擴增目的帶片段長度區(qū)分抗與感系品種，經(jīng)檢測6號、9～16號、19～20號均為感系品種。其他樣品未擴出目的基因，見圖1（D）。

Xa21編碼產(chǎn)物是1個由1 025個氨基酸組成的類受體蛋白激酶，采用Xa21-F和Xa21-R分子標(biāo)記擴增Xa21抗性基因產(chǎn)物長度為1 399 bp，感性基因擴增產(chǎn)物長度為1 274 bp，經(jīng)基因測序判斷，樣品1號、3號、5～6號、8～9號、13號、17號、22號均檢出感性等位基因，見圖1（E）。

Xa23基因來自普通野生稻的抗白葉枯病基因，具有廣譜抗性。Xa23-P23F 和Xa23-P23R這對分子標(biāo)記擴增抗性基因片段為474 bp，感性基因為600 bp，通過電泳結(jié)果可以判斷8號、14號、22～23號檢出抗性基因，其他樣品含感性基因，見圖1（F）。

Xa26基因所用分子標(biāo)記對23個品系水稻進(jìn)行檢測均擴出目的帶，見圖1（G），部分品系存在多條目的帶，部分條帶存在深淺差異，挑取部分樣品進(jìn)行測序（1～6號、9～10號、18號、22號），經(jīng)比對測序序列同源性在95%以上。

Xa27cDNA 全長2 361 bp，僅含有1個外顯子，編碼1個由113個氨基酸組成的亞基，Xa27的編碼序列在感病品種IR24 和抗病品種IRBB27 中完全一樣，只是啟動子區(qū)有2處差別，與IRBB27 相比，IR24 中的Xa27啟動子在ATG 上游1.4 kb 左右多出一段10 bp 的序列，另外在TA 框前多出25 bp 的序列，Xa27所用分子標(biāo)記正好設(shè)計在這個位置，可以通過擴增片段差異區(qū)別抗、感性基因，1號、6號、14號、17～18號檢出抗性等位基因，3～5號、7～13號、15～16號、19～21號、23號檢出感性等位基因，見圖1（H）。

2.2?3份水稻材料稻飛虱抗性基因檢測結(jié)果

W644、S234、234這3份樣品經(jīng)Bph14和Bph15這5對分子標(biāo)記檢測，均擴出目標(biāo)抗性基因（圖2），W644與S234、234在Bph15-F和Bph15-R這對分子標(biāo)記擴增下存在多態(tài)性。

從表3可以看出，23份水稻材料中含Xa1和xa5抗性基因的各有20份，占比87.0%;含有Xa7和Xa26基因的均為23份，占比100%;含xa13基因12份，占比52.2%，均為感性基因;含Xa21基因9份，占比39.1%，均為感性基因;含有Xa23抗性基因4份，感性基因19份，分別占比17.4%和82.6%;含有Xa27抗性基因5份，感性基因16份，分別占比21.7%和69.6%。另外3份水稻均含有抗稻飛虱Bph14和Bph15基因。

從表3還可以看出，大部分水稻材料均含有2個以上的白葉枯病抗性基因，其中美1、小提供灰21、繁殖1、巴馬、孟紅、鎮(zhèn)稻18、鎮(zhèn)稻19、普通野生稻等含有5個以上白葉枯病抗性基因（Xa1、xa5、Xa7、Xa23、Xa26和Xa27），513、OM6162、玉香、AD2168、華素、泰早、豐兩優(yōu)秀1號、豐兩優(yōu)秀6號、豐兩優(yōu)秀4號等含有4個白葉枯病抗性基因，孟R、9311、578、繁殖2、馬粘、NGGYEN含有3個白葉枯病抗性基因。

3?結(jié)論

分子標(biāo)記是一種非常方便、簡單、準(zhǔn)確有效的篩選抗病基因的方法，對于現(xiàn)代育種意義重大[8-9]，它可以縮短育種周期，篩選育種親本和后代，給水稻育種提供明確的育種方向和指導(dǎo)。該研究選取多個白葉枯病抗性基因和稻飛虱抗性基因特異性分子標(biāo)記，對26份水稻材料中含有抗性基因類型進(jìn)行檢測，為后續(xù)水稻常規(guī)育種中親本選擇、育種組合配置以及不同抗性基因聚合等奠定了基礎(chǔ)[10-11]。

參考文獻(xiàn)

[1]李棟.海南普通野生稻對白葉枯病抗性評價與分子鑒定[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2017.

[2]李西明，熊振民，閔紹楷，等.四個云南水稻品種對白背飛虱的抗性遺傳分析[J].中國水稻科學(xué)，1990，4（3）：113-116.

[3]張莉莉，嚴(yán)群芳，王恬.大豆生物活性肽的分離及其抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2007，28（5）：208-211.

[4]王禎，樊葉楊，莊杰云，等.103個雜交稻親本白葉枯病和稻瘟病抗性基因型檢測[J].中國稻米，2016，22（6）：20-24.

[5]CHEN S，HUANG Z H，ZENG L X，et al.High-resolution mapping and gene prediction of Xanthomonas oryzae pv.oryzae resistance gene Xa7[J].Mol Breeding，2008，22（3）：433-441.

[6]邢佳鑫，陳玲，李維蛟，等.云南野生稻抗褐飛虱評價及其抗性基因鑒定[J].西北植物學(xué)報，2015，35（12）：2391-2398.

[7]THI P，MAI P T，THI H，et al.Bphl4 gene determining brown-planthopper（Nilaparvata lugens Stal）resistance in rice varieties（Oryza sativa L.）[J].Annals of biological research，2012，3（3）：1424-1433.

[8]金國光，趙亞東，金京花，等.196份吉林省水稻材料的稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記檢測[J].北方水稻，2017，47（2）：5-12，17.

[9]謝倩鳳，郭建夫，楊仕華，等.82份水稻種質(zhì)資源的稻瘟病抗性評價與抗性基因鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42（14）：31-35.

[10]李進(jìn)波，夏明元，戚華雄，等.水稻抗褐飛虱基因Bph14和Bph15的分子標(biāo)記輔助選擇[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（10）：2132-2137.

[11]DU B，ZHANG W L，LIU B F，et al.Identification and characterization of Bph14，a gene conferring resistance to brown planthopper in rice[J].Proceedings of the national academy of sciences，2009，106（52）：22163-22168.