天門冬質(zhì)量及RAPD遺傳多樣性研究

徐昌艷 羅忠圣 曹旭林 錢志瑤 李相陵 覃容貴

摘要?[目的]研究天門冬質(zhì)量及RAPD遺傳多樣性，并探索其質(zhì)量與RAPD遺傳多樣性間相關(guān)性。[方法]采用綜合評(píng)分法，以總皂苷、多糖、浸出物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)天門冬進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià);對(duì)天門冬RAPD反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，完成不同居群天門冬RAPD擴(kuò)增，運(yùn)用NTSYS?2.10e軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析及UPGMA系統(tǒng)樹圖構(gòu)建;分析天門冬質(zhì)量與RAPD遺傳多樣性的相關(guān)性。[結(jié)果]18份天門冬樣品質(zhì)量差異較大;18份天門冬多態(tài)性百分率為89.62%，遺傳相似系數(shù)為0.448?1～0.748?6，在閾值0.52處18份天門冬聚為兩大類，其中貴州遵義桐梓天門冬單獨(dú)分為一類，其余聚為一類。[結(jié)論]天門冬質(zhì)量與RAPD遺傳多樣性無顯著相關(guān)性，所建立的天門冬RAPD法可用于其遺傳多樣性研究，可為其良種選育、規(guī)范化種植奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?天門冬;質(zhì)量評(píng)價(jià);RAPD;遺傳多樣性;UPGMA

中圖分類號(hào)?R282.71?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）03-0180-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.048

Abstract?[Objective]The?quality?and?RAPD?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix?were?studied，?and?the?correlation?between?the?quality?and?RAPD?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix?was?explored.?[Method]The?content?of?the?total?saponins，polysaccharide?and?alcoholsoluble?extract?in?Asparagi?Radix?was?taken?as?the?evaluation?index，?and?the?quality?of?Asparagi?Radix?was?evaluated?by?the?comprehensive?scoring?method.We?optimized?the?RAPD?reaction?system?of?Asparagi?Radix，?and?amplified?different?populations?of?Asparagi?Radix，based?on?the?RAPD?band?data，the?genetic?similarity?coefficients?were?analysed?by?NTSYS?2.10e，and?the?UPGMA?dendrogram?were?developed.The?correlation?between?the?genetic?diversity?of?RAPD?and?the?quality?of?Asparagi?Radix?was?analyzed.?[Result]The?quality?of?18?Asparagi?Radix?samples?was?very?different.The?polymorphism?rate?of?18?Asparagi?Radix?was?89.62%，and?the?genetic?similarity?coefficient?was?0.448?1-0.748?6.In?the?UPGMA?analysis，?under?the?threshold?of?0.52，?18?samples?were?divided?into?two?groups，1?sample?from?Zunyi?County?was?clustered?into?one?group，while?the?rest?of?the?17?samples?were?clustered?into?the?other?group.?[Conclusion]There?is?no?significant?correlation?between?the?quality?and?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix.?The?established?RAPD?method?of?Asparagi?Radix?can?be?used?for?the?study?of?its?genetic?diversity，?which?can?lay?the?foundation?for?the?breeding?of?improved?varieties?and?standardized?planting?of?Asparagi?Radix.

Key?words?Asparagi?Radix;Quality?evaluation;RAPD;Genetic?diversity;UPGMA

天門冬（Asparagi?Radix）又名天冬，為《中國藥典》（2015年版）收載品種[1]，不僅直接供中醫(yī)臨床配方使用，還作為“口炎清顆?！薄岸唷薄笆构馔琛焙汀傲缪蚯宸晤w粒”等多種中成藥的主要原料，且天門冬中提取的天門冬甜素被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。據(jù)《中華本草》記載：“貴州、云南、廣西等地為天門冬主產(chǎn)區(qū)，其中貴州地區(qū)產(chǎn)量最大，品質(zhì)最好”[2]。貴州地區(qū)天門冬主要分布于貴陽、余慶、鳳崗、黔西、大方、息烽、天柱、獨(dú)山、荔波、鎮(zhèn)寧、福泉、龍里、榕江、興義、黎平、沿河等地，遵義鳳岡縣有大面積種植[3]。項(xiàng)目組實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州大方、龍里、息烽、興義、遵義等地有野生天門冬分布，遵義鳳岡縣有栽培天門冬;廣西桂林、玉林、南寧等地有野生天門冬分布，玉林、南寧等地有栽培天門冬;四川內(nèi)江地區(qū)為文獻(xiàn)記載的天門冬種植分布區(qū)，但調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于天門冬生長周期長、產(chǎn)地加工方法復(fù)雜，該地區(qū)已少有農(nóng)戶種植;同屬植物羊齒天門冬（A.filicinus?Buch.-Ham.ex?D.Don）、密齒天門冬（A.meioclados?Levl.，異名：小莖葉天冬）及西南天門冬（A.munitus?Wang?et?S.C.Chen）的塊根在部分地區(qū)被誤作天門冬入藥;且《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載的小天冬為密齒天門冬，在貴州省稱為“殼天冬”[4]。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)天門冬質(zhì)量主要受其總皂苷含量影響，其次與其多糖和醇溶性浸出物相關(guān)[5]。

RAPD技術(shù)可以利用隨機(jī)引物對(duì)物種基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測，操作簡便、反應(yīng)迅速、所需DNA量少，被廣泛應(yīng)用于藥用植物遺傳多樣性研究。物種的遺傳多樣性決定其進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的能力，種內(nèi)遺傳多樣性越高，物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[6]。因此，該研究收集了貴州、廣西、云南等主產(chǎn)區(qū)的18份天門冬樣品，以總皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量為指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地天門冬質(zhì)量;優(yōu)化建立天門冬RAPD的最佳反應(yīng)體系，對(duì)不同產(chǎn)地天門冬進(jìn)行RAPD遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，并進(jìn)行天門冬質(zhì)量與RAPD遺傳多樣性的相關(guān)性分析，以期為天門冬種質(zhì)資源篩選和良種選育提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

天門冬樣品均為自采集，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為百合科植物天門冬[Asparagus?cochinchinensis（Lour.）Merr.]，樣品剪取幼嫩葉片后再挖取塊根，其中嫩葉片洗凈，吸水紙吸干表面水分，置于封口袋中，于-20?℃低溫保存;塊根洗凈，置恒溫干燥箱50?℃烘干，并粉碎過60目篩，備用。樣品產(chǎn)地詳見表1。

DNAsecure?plan?tkit新型植物基因組提取試劑盒（DP320，北京TIANGEN生化科技有限公司）;瓊脂糖（西班牙）;GoldView?Ⅰ型核酸染色劑、50×TAE緩沖液（北京索萊寶公司）;RAPD隨機(jī)引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2?不同產(chǎn)地天門冬質(zhì)量評(píng)價(jià)

由于天門冬質(zhì)量主要與其總皂苷、多糖和醇溶性浸出物含量相關(guān)，因此該研究根據(jù)前期研究建立的天門冬總皂苷、多糖含量測定方法[5]及《中國藥典》（2015年版）中天門冬浸出物項(xiàng)下醇溶性浸出物含量測定方法進(jìn)行測定，考慮到總皂苷、多糖、浸出物等成分對(duì)天門冬藥材質(zhì)量的影響程度，分別賦予總皂苷60%、多糖20%、醇溶性浸出物20%的權(quán)重，數(shù)據(jù)處理中引入綜合指標(biāo)“隸屬度”，采用綜合評(píng)分法評(píng)價(jià)天門冬質(zhì)量，綜合分=總皂苷隸屬度×60%+多糖隸屬度×20%+浸出物隸屬度×20%，其中指標(biāo)隸屬度=（指標(biāo)值-指標(biāo)最小值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值），滿分為1.00，計(jì)算得到綜合評(píng)分越高，表示此地天門冬質(zhì)量越好[7-8]。

1.3?天門冬RAPD遺傳多樣性研究

1.3.1?DNA提取與檢測。

按試劑盒法進(jìn)行天門冬基因組DNA提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行天門冬基因組DNA的完整性檢測，然后采用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行天門冬基因組DNA濃度及純度檢測。

1.3.2?RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化。

經(jīng)文獻(xiàn)查閱及預(yù)試驗(yàn)，確定天門冬RAPD初始反應(yīng)體系，再對(duì)天門冬RAPD-PCR擴(kuò)增中影響較大的因素（DNA模板濃度、引物濃度、2×Taq?PCR?MasterMix濃度）進(jìn)行優(yōu)化，每次改變1個(gè)因素時(shí)其他條件不變，最終確定天門冬RAPD最優(yōu)反應(yīng)體系。擴(kuò)增程序：95?℃預(yù)變性5?min;94?℃變性60?s，再50?℃退火70?s，然后72?℃延伸1.5?min，40次循環(huán);最后72?℃延伸10?min;得到的產(chǎn)物于1.6%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離（100?V電壓），1?h后從電泳槽中取出，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯像觀察并記錄拍照[9]。

1.3.3?引物篩選。

分別采用60條RAPD隨機(jī)引物（含10個(gè)堿基的寡核苷酸）進(jìn)行天門冬基因組DNA的RAPD擴(kuò)增，優(yōu)選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物作為天門冬RAPD擴(kuò)增有效引物。

1.3.4?不同產(chǎn)地天門冬RAPD擴(kuò)增。

以RAPD優(yōu)化體系和有效引物分別對(duì)18份不同產(chǎn)地天門冬進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用人工讀取方式進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算條帶多態(tài)性百分率（PPB），采用NTSYS?2.10e軟件獲得不同產(chǎn)地天門冬遺傳相似性系數(shù)矩陣，并采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建不同產(chǎn)地天門冬的親緣關(guān)系。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同產(chǎn)地天門冬質(zhì)量評(píng)價(jià)

以天門冬總皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，引入“隸屬度”進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地天門冬質(zhì)量，綜合評(píng)分見表1。由表1可知，不同產(chǎn)地18份天門冬綜合評(píng)分為0.168?4～0.915?0，其中以S9（貴州開陽龍崗鎮(zhèn)2）綜合評(píng)分最高，為0.915?0，其次是S13（云南昆明2），綜合評(píng)分為0.788?8，S16（貴州省貴安新區(qū)黨武鎮(zhèn)）綜合評(píng)分最低，為0.168?4。表明18份不同產(chǎn)地天門冬質(zhì)量差異較大，其中貴州開陽龍崗鎮(zhèn)2產(chǎn)的天門冬質(zhì)量最好，其次是云南昆明2，而貴州貴安新區(qū)黨武鎮(zhèn)產(chǎn)的天門冬質(zhì)量最差。

2.2?天門冬RAPD遺傳多樣性研究

2.2.1?基因組DNA提取與檢測。

由圖1可見，18份不同產(chǎn)地天門冬的基因組DNA電泳條帶清晰;且天門冬OD260/280值為1.70～1.87，濃度為234.9～253.0?μg/mL，表明提取的天門冬DNA純度高、質(zhì)量好，可用于后續(xù)RAPD擴(kuò)增。

2.2.2?RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化。

由圖2可見，根據(jù)擴(kuò)增條帶清晰度、數(shù)量、明亮程度對(duì)比，選擇條帶清晰、數(shù)量多、明亮的條帶，優(yōu)選出25?μL天門冬RAPD反應(yīng)體系中DNA模板最適用量應(yīng)為48?ng，引物最適用量應(yīng)為1.2?μmol，2×Taq?PCR?MasterMix最適用量應(yīng)為10.5?μL，ddH2O補(bǔ)足。

2.2.3?引物篩選。

從60條RAPD隨機(jī)引物中篩選出的20條有效引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，擴(kuò)增效果見圖3，20條有效引物共擴(kuò)增出164條清晰的多態(tài)性條帶，其PPB為89.62%，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小為100～2?000?bp，平均每條引物擴(kuò)增出9條條帶，每條有效引物的PPB為77.78%～100.00%，表明天門冬有豐富的多態(tài)性。

2.2.4?不同產(chǎn)地天門冬RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析。

18份不同產(chǎn)地天門冬樣品經(jīng)RAPD擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)及PPB結(jié)果見表1。其中S5（廣西南寧長崗村）天門冬的PPB?最低，為42.08%，S15（云南昆明4）天門冬的PPB?最高，為68.31%，貴州天門冬的PPB?平均為53.34%，根據(jù)多態(tài)性百分率就可以看出廣西南寧長崗村的天門冬適應(yīng)環(huán)境的能力稍弱，云南昆明4的天門冬適應(yīng)環(huán)境的能力相對(duì)較強(qiáng)。

2.2.5?不同產(chǎn)地天門冬的相似性及聚類分析。

18份不同產(chǎn)地天門冬通過NTSYS?2.10e軟件進(jìn)行遺傳相似性分析，遺傳相似系數(shù)矩陣結(jié)果見表2。由表2可知，不同產(chǎn)地天門冬的RAPD遺傳相似系數(shù)為0.448?1～0.748?6，說明不同產(chǎn)地天門冬之間存在豐富的遺傳變異。其中S8（貴州開陽龍崗1）樣品與S9（貴州開陽龍崗2）樣品的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.748?6，表明兩者的親緣關(guān)系最近;S11（貴州開陽龍崗4）樣品和S18（貴州遵義桐梓）樣品的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.448?1，表明兩者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

根據(jù)18份不同產(chǎn)地天門冬的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA系統(tǒng)樹圖構(gòu)建，結(jié)果見圖4。在閾值0.52時(shí)，不同產(chǎn)地天門冬聚為兩大類，其中S18單獨(dú)分為第Ⅰ類，其余產(chǎn)地天門冬聚為第Ⅱ類，表明貴州遵義桐梓天門冬與其他產(chǎn)地天門冬間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其間存在一定程度的遺傳變異;其中第Ⅱ類在閾值為0.54時(shí)又可分為2類，第Ⅰ類包括S1（貴州貴陽新場1）、S4（貴州貴陽新場4）、S5（廣西南寧長崗村）、S7（貴州修文六中）、S8（貴州開陽龍崗1）、S9（貴州開陽龍崗2）、S13（云南昆明2）、S15（云南昆明4）、S16（貴州貴安新區(qū)黨武）、S17（貴州關(guān)嶺），其余產(chǎn)地為第Ⅱ類。

2.3?天門冬質(zhì)量與RAPD遺傳多態(tài)性的相關(guān)性分析

利用SPSS?20.0軟件，采用雙變量相關(guān)性法對(duì)天門冬質(zhì)量與RAPD遺傳多樣性多態(tài)性百分率（PPB）的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），天門冬總皂苷含量與RAPD遺傳多樣性的相關(guān)系數(shù)為0.125，對(duì)應(yīng)的顯著性為0.622，在0.05水平上不存在顯著相關(guān)性;天門冬多糖含量與RAPD遺傳多樣性的相關(guān)系數(shù)為0.338，對(duì)應(yīng)的顯著性為0.170，在0.05水平上不存在顯著相關(guān)性;天門冬醇溶性浸出物含量與RAPD遺傳多樣性的相關(guān)系數(shù)為-0.004，對(duì)應(yīng)的顯著性為0.998，在0.05水平上不存在顯著相關(guān)性;天門冬質(zhì)量綜合評(píng)分與其RAPD遺傳多樣性的相關(guān)系數(shù)為0.202，對(duì)應(yīng)的顯著性為0.422，在0.05水平上不存在顯著相關(guān)性。因此，初步推斷天門冬質(zhì)量與RAPD遺傳多態(tài)性無顯著相關(guān)性，質(zhì)量好的天門冬對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力未必強(qiáng)。

3?討論與結(jié)論

由于進(jìn)行權(quán)重的綜合評(píng)分法中權(quán)重具有主觀隨意性，易導(dǎo)致評(píng)價(jià)結(jié)果的不確定性，因此該試驗(yàn)以總皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，引入綜合指標(biāo)“隸屬度”，再綜合評(píng)分進(jìn)行18份不同產(chǎn)地天門冬的質(zhì)量評(píng)價(jià)，此評(píng)價(jià)方法更嚴(yán)謹(jǐn)，評(píng)價(jià)結(jié)果更可靠[7]。18份不同產(chǎn)地天門冬中，貴州開陽龍崗鎮(zhèn)2產(chǎn)的天門冬評(píng)分最高，即質(zhì)量最好，其次是云南昆明2，而貴州貴安新區(qū)黨武鎮(zhèn)產(chǎn)天門冬質(zhì)量最差，究其原因可能是貴州貴安新區(qū)黨武采集地為山坡，土層較薄，具體原因有待進(jìn)一步研究確定。

高質(zhì)量的植物基因組DNA是DNA分子標(biāo)記鑒定的前提，前期研究中分別采用CTAB法和新型植物基因組DNA提取試劑盒法，對(duì)天門冬藥材和幼嫩葉片的基因組DNA提取效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)由于天門冬藥材藥用部位為塊根，其組織可能受烘干或日曬、產(chǎn)地加工等影響，使得天門冬藥材基因組DNA提取難度大[10-12]。

該試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)影響天門冬RAPD-PCR擴(kuò)增的主要因素是模板DNA、引物及Mg2+、Taq?DNA聚合酶和dNTPs濃度，其中模板DNA濃度過低，分子發(fā)生碰撞概率小，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將無或少;而DNA模板的濃度太大，擴(kuò)增產(chǎn)量過大，條帶數(shù)過多，將難以分離，不利于后續(xù)條帶讀取;其次引物濃度過低，將直接影響PCR的產(chǎn)率，可能出現(xiàn)無擴(kuò)增條帶的現(xiàn)象。該試驗(yàn)所用2×Taq?PCR?MasterMix中包括Mg2+、Taq?DNA聚合酶和dNTPs，其濃度直接影響RAPD穩(wěn)定性和多態(tài)性[13]。因此，該試驗(yàn)分別考察了模板DNA、引物及2×Taq?PCR?MasterMix的濃度對(duì)天門冬RAPD擴(kuò)增的影響，建立了天門冬RAPD-PCR擴(kuò)增的最優(yōu)反應(yīng)體系。

植物種間或種內(nèi)個(gè)體間遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，遺傳差異越小;遺傳相似系數(shù)越小，則親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳差異越大[13-15]。不同產(chǎn)地18份天門冬的RAPD遺傳相似系數(shù)為0.448?1～0.748?6，部分貴州不同產(chǎn)地間的天門冬遺傳相似系數(shù)小，其間親緣關(guān)系遠(yuǎn)，而貴州部分地區(qū)與云南昆明的天門冬樣品間遺傳相似系數(shù)大，其間親緣關(guān)系近;廣西南寧與云南昆明部分天門冬樣品間遺傳相似系數(shù)大，其間親緣關(guān)系近。并經(jīng)UPGMA聚類分析，發(fā)現(xiàn)S18樣品單獨(dú)分為一類，其余樣品聚為一類;在閾值為0.54處時(shí)，S1、S4、S5、S7、S8、S9、S13、S15、S16、S17樣品聚為一類，其他7份樣品聚為一類，結(jié)果表明，不同居群天門冬之間存在豐富的遺傳多樣性，天門冬對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng);且遺傳相似系數(shù)和聚類分析的結(jié)果與樣品來源的地理距離并不存在一致性，可能與樣品來源地的地形、氣候等自然因素有關(guān)。

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