煙草自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白基因家族的鑒定與分析

陳邦蘭 翟夢(mèng)倩 龍濤 趙順程 劉娟 尹茂靈 萬(wàn)心言 王治杰 劉繼愷

摘要?自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural?resistance?associated?macrophage?proteins，NRAMPs）是一類(lèi)高度保守的二價(jià)金屬跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在調(diào)控生物體內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。為了探究煙草NRAMP基因的多樣性，該研究根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)信息，利用生物信息學(xué)方法對(duì)煙草NRAMP基因家族成員進(jìn)行了鑒定，對(duì)其基本信息、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、蛋白理化性質(zhì)及保守序列、啟動(dòng)子元件和組織表達(dá)模式等進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：煙草基因組含有9個(gè)NtNRAMP基因，分別命名為NtNRAMP1.1～6.2，其編碼氨基酸長(zhǎng)度為500～542?aa，蛋白分子量為54.31～59.11?kD，等電點(diǎn)為5.09～8.73，總平均親水性為0.475～0.604;除了NRAMP6.1和6.2不含有motif4外，其余NRAMP蛋白都含有motif1～motif10。順式作用元件分析表明所有NtNRAMP基因啟動(dòng)子中均含有參與基因轉(zhuǎn)錄、非生物脅迫、植物激素響應(yīng)和光應(yīng)答途徑的元件，部分基因含有生物脅迫、次生代謝、組織表達(dá)和結(jié)合位點(diǎn)的元件。染色體定位發(fā)現(xiàn)，6個(gè)NtNRAMP基因分別分布在5條煙草染色體上。表達(dá)分析表明：NtNRAMP基因組織表達(dá)模式差異較大，其中NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2基因表達(dá)具有組織特異性。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究煙草NtNRAMP基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白;煙草;基因家族;表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)?S572?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）03-0100-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.027

Abstract?Natural?resistance?associated?macrophage?proteins?（NRAMPs）?are?highly?conserved?bivalent?metal?transporters?that?play?an?important?role?in?regulating?heavy?metal?homeostasis.?In?order?to?explore?the?diversity?of?the?NRAMP?gene?in?tobacco，?this?study?identified?the?members?of?the?NRAMP?gene?family?of?tobacco?by?using?bioinformatics?methods?based?on?the?genome?data?of?N.?tabacum，?and?analyzed?the?basic?information，?structural?features，?physicochemical?parameters，?conserved?motifs，?cisacting?elements，?tissue?expression?pattern?of?these?NtNRAMP?genes.?The?results?showed?that?N.?tabacum?genome?contained?9?NtNRAMP?genes?which?were?designated?as?NtNRAMP1.16.2.?The?length?of?NtNRAMP?proteins?ranged?from?500?to?542?amino?acid;the?relative?molecular?weight?ranged?from?54.31?to?59.11?kD;the?predicted?pI?ranged?from?5.09?to?8.73，?and?the?predicted?GRAVY?ranged?from?0.475?to?0.604.?Except?for?NRAMP6.1?and?NRAMP?6.2，?which?did?not?contained?motif4，?all?NtNRAMP?proteins?contained?motif1motif10.?Cisacting?regulatory?element?prediction?showed?that?all?NtNRAMP?genes?contained?elements?involved?in?gene?transcription，?abiotic?stress，?plant?hormone?response?and?light?response?pathways，?however，?some?genes?contained?elements?involved?in?biological?stress，?secondary?metabolism，?tissue?expression?and?binding?sites.?Chromosomal?localization?revealed?that?6?of?9?NtNRAMP?genes?were?located?in?5?tobacco?chromosomes.?The?tissue?expression?profile?analysis?showed?diverse?tissue?expression?patterns?of?NtNRAMPs，?and?NtNRAMP6.1?and?NtNRAMP6.2?showed?tissue?specific?expression?patterns.?These?results?laid?a?foundation?for?further?functional?characterization?of?NtNRAMP?genes.

Key?words?Natural?resistance?associated?macrophage?proteins;Nicotiana?tabacum;Gene?family;Expression?analysis

Cu、Fe、Mn和Zn等過(guò)渡金屬是生物體重要的微量元素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝中起著關(guān)鍵作用[1]。但同時(shí)，這些金屬含量又必須保持在合理水平，一旦過(guò)量則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害。還有一些金屬，如Cd、Pd和Hg等，它們雖然不是必需元素，但也可以被植物吸收，對(duì)植物造成負(fù)面影響[2]。為了適應(yīng)環(huán)境變化，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一套復(fù)雜且精密的調(diào)控過(guò)程以保證體內(nèi)重金屬的穩(wěn)態(tài)，而重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在這一調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。

自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural?resistance?associated?macrophage?proteins，NRAMPs）是一類(lèi)高度保守的二價(jià)金屬跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、果蠅、人類(lèi)和植物中[4]。NRAMP基因最早在老鼠中被克隆，該基因在老鼠抵御分枝桿菌過(guò)程中起到重要作用[5]。目前，科學(xué)家們已克隆到多個(gè)植物NRAMP基因，并對(duì)部分NRAMP基因進(jìn)行了功能研究。模式植物擬南芥有6個(gè)NRAMP基因（AtNRAMP1～6）。已有研究發(fā)現(xiàn)，AtNRAMP1是定位于擬南芥根細(xì)胞質(zhì)膜上的高親和性Mn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白負(fù)責(zé)擬南芥在低Mn環(huán)境對(duì)Mn的吸收[6]。AtNRAMP2是一種定位于反面高爾基網(wǎng)絡(luò)（TransGolgi?Network）的Mn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)Mn的正常分布以及Mn缺乏條件下根的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[7-8]。與AtNRAMP1和AtNRAMP2不同，AtNRAMP3和AtNRAMP4蛋白定位于液泡膜上，是Fe和Mn的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，調(diào)控Fe缺乏下的種子萌發(fā)以及Mn缺乏下植物的光合作用和生長(zhǎng)[9-11]。AtNRAMP6定位于擬南芥?zhèn)雀陀啄廴~片細(xì)胞的高爾基體或反面高爾基網(wǎng)絡(luò)上，是Cd和Fe的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12-13]。

煙草是我國(guó)重要的非食品性經(jīng)濟(jì)作物，易吸收和富集重金屬，這些重金屬可通過(guò)吸煙進(jìn)入人體，危害人體健康[14]。對(duì)煙草金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行鑒定和功能研究對(duì)于進(jìn)一步闡明煙草對(duì)重金屬的吸收富集機(jī)制，保證煙葉安全性是十分必要的。之前在煙草中鑒定到26個(gè)金屬耐受蛋白（metal?tolerance?protein，MTP）編碼基因，并發(fā)現(xiàn)NtMTP?8.1、NtMTP8.4和NtMTP11.1可以在酵母中轉(zhuǎn)運(yùn)Mn[15]。該研究采用生物信息學(xué)手段對(duì)煙草NRAMP基因家族進(jìn)行鑒定，并對(duì)它們的基因特征和組織表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為煙草NRAMP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?煙草NRAMP基因的鑒定

以擬南芥中6個(gè)NRAMP蛋白氨基酸序列作為查詢(xún)序列，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Nitab?v4.5?cDNA?Edwards，2017，https：∥solgenomics.net/）中進(jìn)行TBLASTN比對(duì)搜索。去除冗余序列后，將得到的序列用InterProScan（http：∥www.ebi.ac.uk/interpro/）工具驗(yàn)證是否屬于NRAMP家族（IPR001046）[16]。經(jīng)驗(yàn)證后的序列為煙草NtNRAMP蛋白序列，下載對(duì)應(yīng)的基因號(hào)、基因組位置等信息。將獲得的NtNRAMP蛋白序列在NCBI中分別與擬南芥6個(gè)AtNRAMP蛋白序列作比對(duì)，綜合序列一致性和覆蓋度結(jié)果對(duì)NtNRAMP基因進(jìn)行命名。

1.2?煙草NRAMP蛋白生化參數(shù)和結(jié)構(gòu)特征

利用ProParam工具預(yù)測(cè)煙草NRAMP蛋白的分子量、等電點(diǎn)和親水性[17]，利用PlantmPloc預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位[18]，利用TMHMM?Server?V.2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域[19-20]，利用MEME程序預(yù)測(cè)保守基序（motif）[21]。

1.3?煙草NRAMP基因結(jié)構(gòu)和染色體定位分析

利用Sol?Genomics?Network（SGN）網(wǎng)站（https：∥solgenomics.net/）煙草基因組注釋信息分析煙草NRAMP基因結(jié)構(gòu)和染色體定位。最后，運(yùn)用TBtools軟件進(jìn)行外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)和染色體定位作圖[22]。

1.4?煙草NRAMP基因順式作用元件及組織表達(dá)特性分析

在上述SGN網(wǎng)站的煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Nitab?v4.5?Genome?Scaffolds?Edwards，2017）中搜索獲得煙草NRAMP基因上游1?500?bp序列，利用在線(xiàn)網(wǎng)站PlantCARE對(duì)獲得的序列進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測(cè)[23]。為了研究煙草NRAMP基因的組織表達(dá)模式，從GenBank?Sequence?Read?Archive（SRA）上下載煙草TN90的RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登記號(hào)SRP029183），分析目的基因在8個(gè)不同煙草組織中的相對(duì)表達(dá)量并用TBtools軟件作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?煙草NRAMP基因的鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

利用生物信息學(xué)方法在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，共鑒定出9個(gè)NtNRAMP基因，綜合這9個(gè)基因編碼蛋白序列與擬南芥AtNRAMP序列的比對(duì)結(jié)果，分別將它們命名為NtNRAMP1.1、1.2、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、6.1、6.2（表1）。

利用在線(xiàn)軟件對(duì)NtNRAMP基因及其編碼蛋白進(jìn)行理化特性分析，結(jié)果表明（表2），NtNRAMP基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding?sequence，CDS）長(zhǎng)度在1?503?bp（NtNRAMP6.2）～2?024?bp（NtNRAMP3.1），平均為1?691?bp;氨基酸個(gè)數(shù)在500?aa（NtNRAMP6.2）～542?aa（NtNRAMP2.2）;相對(duì)分子質(zhì)量介于54.31～59.11?kD;等電點(diǎn)為5.09～8.73，其中NRAMP1.1、1.2、6.1、6.2為堿性蛋白，其余為酸性蛋白;總平均親水性為0.475～0.604;跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane?domain，TMD）數(shù)目相近，NRAMP2.1、2.2、6.1、6.2有10個(gè)TMD，NRAMP2.3、3.1和3.2有11個(gè)TMD，NRAMP1.1和1.2有12個(gè)TMD;值得注意的是，9個(gè)NtNRAMP蛋白均被預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞膜。

2.2?煙草NRAMP基因的染色體分布

對(duì)NtNRAMP基因的染色體定位進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖1），6個(gè)NtNRAMP基因分布于5條煙草染色體上（分別是3、4、6、12、17號(hào)染色體），其中12號(hào)染色體含有2個(gè)NtNRAMP基因（NtNRAMP2.1和NtNRAMP6.1），其余4條染色體各含有1個(gè)NtNRAMP基因。

2.3?煙草NRAMP基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守序列分析

利用NtNRAMP基因的注釋信息和TBtools軟件分析煙草NRAMP的基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖2所示，NRAMP2.1、2.2、2.3、3.1、3.2基因具有相同的外顯子數(shù)目（4個(gè)），NRAMP6.1和6.2基因具有12個(gè)外顯子，NRAMP1.1和1.2基因具有13個(gè)外顯子，其中NRAMP1.1、1.2、3.1、3.2基因存在上游和下游非翻譯區(qū)（UTR）。蛋白質(zhì)保守序列分析結(jié)果顯示：除了NRAMP6.1和6.2不含有motif4外，所有NRAMP蛋白都含有motif1～motif10。

2.4?煙草NRAMP基因家族順式作用元件分析

通過(guò)分別對(duì)9個(gè)NtNRAMP基因上游1?500?bp序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其可能含有的順式作用元件。結(jié)果顯示（表3），所有NtNRAMP基因均含有參與基因轉(zhuǎn)錄、非生物脅迫、植物激素響應(yīng)、光應(yīng)答途徑的元件，其中含有涉及基因轉(zhuǎn)錄的作用元件最多（45～72個(gè)）;此外，NRAMP1.1和1.2還各含有1個(gè)生物脅迫元件，NRAMP3.2、6.1、6.2各含有1個(gè)次生代謝元件，除NRAMP2.3和3.1外，其余基因啟動(dòng)子中均含有1～2個(gè)組織表達(dá)元件，除NRAMP1.1、2.3、3.2外，其余基因啟動(dòng)子中均含有1～2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)元件。

2.5?煙草NRAMP基因組織表達(dá)模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析煙草NRAMP基因分別在幼嫩/成熟的花、幼嫩/成熟/衰老的葉、干燥的蒴果、根、莖8個(gè)組織中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，NRAMP1.1基因的表達(dá)在整體上均高于NRAMP1.2，NRAMP1.1基因在根中的表達(dá)量最高，而NRAMP1.2基因在莖中表達(dá)量最高，在干燥的蒴果里幾乎不表達(dá);NRAMP2.1和2.2在煙草各組織中均有表達(dá)，具有相似的組成型表達(dá)模式;NRAMP2.3與NRAMP2.1和2.2相比，在各組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，特別在根、干燥的蒴果、成熟/衰老的葉中表達(dá)量很低;NRAMP3.1和3.2基因的組織表達(dá)模式相似，在煙草各組織中均有表達(dá)，且在幼嫩的葉中表達(dá)量最高;NRAMP6.1和NRAMP6.2基因的表達(dá)具有組織特異性，NRAMP6.1基因只在根和成熟的花中表達(dá)，而NRAMP6.2基因還在幼嫩的花中表達(dá)，這2個(gè)基因在其余組織中均無(wú)表達(dá)或表達(dá)量極低。

3?討論

金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，比如NRAMP，是生物體金屬特異轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要組成部分，在維持細(xì)胞及其細(xì)胞器內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，隨著植物基因組學(xué)研究的不斷深入，研究者們利用比較基因組學(xué)等方法成功對(duì)水稻、大豆和可可中的NRAMP基因家族進(jìn)行了鑒定分析[24-26]。該研究利用同樣的方法在煙草基因組中鑒定到9個(gè)NtNRAMP基因，同時(shí)運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)這些基因的基本信息、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、蛋白理化性質(zhì)及保守序列、啟動(dòng)子元件和組織表達(dá)模式等進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，這些結(jié)果將為煙草NRAMP基因家族功能研究以及其分子調(diào)控機(jī)制的闡明提供理論依據(jù)。

水稻含有7個(gè)NRAMP基因，這些基因編碼蛋白的分子量在55.81～59.71?kD，含有10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，且全部定位于質(zhì)膜上[25]。大豆基因組包含13個(gè)NRAMP，它們的分子量在55.44～64.39?kD，GmNRAMP1a～GmNRAMP4b定位于液泡膜，GmNRAMP5a～GMNRAMP7定位于質(zhì)膜[24]。擬南芥有6個(gè)NRAMP，它們分別在質(zhì)膜、液泡膜和高爾基體上發(fā)揮作用。研究中，煙草NtNRAMP的分子量為54.31～59.11?kD，跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)?0～12，定位于細(xì)胞膜。通過(guò)比較這些結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，不同植物中NRAMP蛋白的分子量大小和跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目比較相似，但在亞細(xì)胞定位方面卻存在差異。亞細(xì)胞定位是闡釋金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物學(xué)功能的重要數(shù)據(jù)，因此下一步有必要利用試驗(yàn)技術(shù)，如熒光蛋白表達(dá)結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察、免疫印跡等，對(duì)煙草NRAMP各成員的亞細(xì)胞定位進(jìn)行深入研究。

為了探索調(diào)控NtNRAMP基因表達(dá)的潛在機(jī)制，該研究對(duì)煙草NtNRAMP基因上游的順式作用元件進(jìn)行了分析，共鑒定到656個(gè)順式作用元件。其中，所有NtNRAMP基因啟動(dòng)子中都含有參與非生物脅迫、植物激素響應(yīng)、光應(yīng)答途徑的順式作用元件，表明NtNRAMP基因廣泛參與到這些生物過(guò)程中。值得注意的是，和其他NRAMP基因相比，僅NRAMP1.1和1.2各含有1個(gè)生物脅迫元件，NRAMP3.2、6.1、6.2各含有1個(gè)次生代謝元件，說(shuō)明這些基因還可能特異性地在生物脅迫響應(yīng)和次生代謝途徑中發(fā)揮作用。

煙草NRAMP基因在幼嫩/成熟的花、幼嫩/成熟/衰老的葉、干燥的蒴果、根、莖8個(gè)組織中有不同程度的表達(dá)，但組織表達(dá)模式差異較大，其中NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2基因只在根和花中表達(dá)，其表達(dá)具有組織特異性。最近的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNRAMP6基因能夠調(diào)控Fe缺乏情況下擬南芥?zhèn)雀纳L(zhǎng)，而對(duì)主根沒(méi)有影響[13]。因此，NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2可能會(huì)通過(guò)調(diào)控根和花細(xì)胞中金屬穩(wěn)態(tài)從而影響煙草根和花的生長(zhǎng)發(fā)育。

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