2種鎂基材料的體內(nèi)外生物相容性研究

陸 華 隋佰延 劉 昕 孫 皎

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔材料室，上海生物材料研究測(cè)試中心，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011）

近年來，醫(yī)用純鎂及鎂合金作為一類新型可降解醫(yī)用金屬材料受到了極大的關(guān)注。對(duì)于預(yù)期應(yīng)用于口腔、心血管領(lǐng)域和骨科的可降解類生物材料[1-3]，必須具備良好的生物相容性。其中細(xì)胞毒性試驗(yàn)是首要考慮內(nèi)容，因?yàn)樗茉诙唐趦?nèi)檢出材料對(duì)細(xì)胞新陳代謝功能的影響。基于醫(yī)用鎂及鎂合金類材料目前仍然存在一些問題，如植入物釋放出來的金屬離子誘導(dǎo)炎癥或引起過敏等[4-5]、金屬腐蝕和磨損等造成的直接或間接的影響[6]，鎂離子及合金元素離子溶出，其一旦進(jìn)入組織液會(huì)引發(fā)機(jī)體的組織反應(yīng)、免疫反應(yīng)、局部和全身反應(yīng)等[7]。因此，為了預(yù)測(cè)醫(yī)用鎂及鎂合金在與人體接觸使用過程中的潛在危害性，將可能出現(xiàn)的不安全風(fēng)險(xiǎn)減少到最低程度，有必要對(duì)其進(jìn)行一系列的生物學(xué)性能評(píng)價(jià)研究。本研究擬通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激、致敏試驗(yàn)及肌肉植入試驗(yàn)來評(píng)價(jià)高純鎂（high purity Magnesium，HP-Mg）和鎂-1鈣（Mg-1Ca）合金的體內(nèi)外生物相容性。

1 材料和方法

1.1 試樣制備

1.1.1 高純鎂 由上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供，鎂純度99.99 wt%（0.002 wt%的Si；0.0015 wt % 的 Fe；0.0008 wt % 的 Al；0.0008 wt%的Mn），肌肉植入試樣為直徑1 mm、長(zhǎng)度為10 mm的小棒；浸提液的制備均采用厚度為0.5 mm的小圓片。

1.1.2 鎂-1鈣合金 由北京大學(xué)工學(xué)院提供，鎂純度 98.8 wt%（0.003 8 wt % Si，0.027 wt % Fe），添加1.14 wt %Ca的擠壓態(tài)Mg-1Ca合金，植入和浸提液的制備試樣大小同高純鎂。

1.2 主要儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-17AIC，三洋，日本）；多功能顯微成像系統(tǒng)（DM6000B； Leica；）：精密恒溫恒濕箱（JHS-080，上海精宏設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；酶標(biāo)儀（Multiskan FC型，美國(guó)熱電）；電感耦合等離子光譜儀（ICPOES，VISTAPRO，安捷倫，美國(guó)）；pH計(jì)（Seven Compact S220，Inlab Solid， METTLER TOLEDO，瑞士）。

1.3 試驗(yàn)方法

本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.3.1.1 MTT試驗(yàn) 根據(jù)ISO10993.12-2012[8]方法，無菌操作下以含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，按照3 cm2/mL 比例，37 ℃、24 h分別制備高純鎂及Mg-1Ca合金的浸提液。試驗(yàn)組選擇100%浸提液作為浸提原液，下設(shè)75%、50%、25%的稀釋浸提液組。采用同批浸提介質(zhì)作為空白對(duì)照組。參照ISO 10993.5-2009[9]方法，選用L929 細(xì)胞，分別以不同濃度的試樣浸提液接觸細(xì)胞24 h，通過MTT方法來評(píng)估細(xì)胞的活力，如細(xì)胞存活率小于空白對(duì)照的70%，則視為材料具有潛在的細(xì)胞毒性。

1.3.1.2 鎂離子濃度和pH值測(cè)定 采用ICP分別測(cè)定2種材料浸提原液和對(duì)照液中的Mg2+濃度。用pH計(jì)測(cè)定2種材料浸提原液及對(duì)照液的pH值。

1.3.1.3 pH值對(duì)細(xì)胞活力的影響 取2種材料的同批浸提原液，用1M的HCl調(diào)整pH值到7.4。同法接觸細(xì)胞24 h，通過MTT方法評(píng)估細(xì)胞活力，研究pH值對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1.3.2 遺傳毒性研究

1.3.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)） 以0.9%氯化鈉注射液（SC）為浸提介質(zhì)，按照3 cm2/mL的浸提比例、37℃、72 h制備材料浸提液。選擇100%浸提液作為浸提原液，下設(shè)3個(gè)稀釋濃度組（50%、25%、12.5%）。陰性對(duì)照組采用同批浸提介質(zhì)同條件制備。參照ISO 10993.3-2014[6]方法選用TA97、TA98、TA100、TA102的菌株組合采用平板摻入法進(jìn)行Ames試驗(yàn)。

1.3.2.2 體外哺乳細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)（MLA試驗(yàn)） 采用含10%馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按照3 cm2/mL的浸提比例，37℃、72 h制備浸提液。選擇100%浸提液作為浸提原液，下設(shè)2個(gè)倍比稀釋濃度組（50%、25%）。陰性對(duì)照組采用同批浸提介質(zhì)同條件制備。參照ISO 10993.3-2014[10]的方法采用小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y TK+/-）進(jìn)行96孔平板法試驗(yàn)。

1.3.3 急性全身毒性 選擇雄性ICR小鼠30只，重量18～22 g，隨機(jī)分為6組，每組5只小鼠。分別以0.9%氯化鈉注射液（SC）和棉籽油（CSO）為浸提介質(zhì)，按照3 cm2/mL的浸提比例，在37℃、72 h條件下制備2種材料的SC浸提液和CSO浸提液，對(duì)照組分別采用同批浸提介質(zhì)（同條件制備）。參照ISO 10993.11-2017方法，分別將各組SC浸提液直接注入ICR小鼠的尾靜脈；各組CSO浸提液注入小鼠的腹腔內(nèi)，觀察注射后即刻、4 h、24 h、48 h 及72 h 內(nèi)發(fā)生的不良反應(yīng)，根據(jù)毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)，評(píng)價(jià)2種材料對(duì)生物體潛在的急性危害。

1.3.4 皮內(nèi)刺激試驗(yàn) 參照ISO 10993.10-2010[11]的方法，使用健康、初成年雄性的白化兔6只，2.5～3.0 kg，分別在兔的脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射SC浸提液或CSO浸提液，設(shè)同批浸提介質(zhì)（SC和CSO）為同體對(duì)照。注射后即刻、 24 h、48 h 和72 h 觀察各注射部位皮膚組織的紅斑和水腫反應(yīng)，并分別計(jì)算2種材料組和對(duì)照組的綜合平均記分。

1.3.5 致敏試驗(yàn) 選擇豚鼠55只，體重300～350 g，雄性。參照ISO 10993.10-2010[11]的方法，采用最大劑量法，觀察去除豚鼠腹部斑貼后24 h、48 h的紅斑、水腫情況，評(píng)價(jià)2種材料浸提液引起的皮膚的病理性免疫反應(yīng)（Ⅳ型免疫變態(tài)反應(yīng)）。

1.3.6 肌肉植入試驗(yàn) 參照ISO 10993.6-2016[12]標(biāo)準(zhǔn)，選用新西蘭兔，體重2.2～2.5 kg，每只兔子的左側(cè)背部分別植入4個(gè)試驗(yàn)樣品，右側(cè)背部分別植入不銹鋼試樣作為同體對(duì)照。分別于術(shù)后4 w，12 w，26 w 臨床觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況，肉眼觀察植入部位材料情況和組織反應(yīng)的特性和程度。運(yùn)用組織病理學(xué)技術(shù)，對(duì)局部肌肉組織的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞類型、新血管形成及纖維囊腔形成等反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05 時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外細(xì)胞毒性

2.1.1 細(xì)胞存活率變化 2種材料浸提原液經(jīng)梯度稀釋后的細(xì)胞存活率結(jié)果見圖1。由圖1可見： 除Mg-1Ca合金100%濃度組的細(xì)胞存活率為（54.1±3.8）%之外，其余各組均大于70%，無細(xì)胞毒性；且細(xì)胞活力均隨著浸提液稀釋濃度的增大而遞增；在100%和75%濃度下，高純鎂的細(xì)胞存活率優(yōu)于鎂-1鈣合金（P＜0.05）。

2.1.2 鎂離子濃度及pH分析 MTT試驗(yàn)中2種材料浸提原液中的鎂離子濃度和pH值的測(cè)定結(jié)果見表1。Mg-1Ca合金組的鎂離子濃度及pH值均大于高純鎂組，且前者細(xì)胞活力略低于后者，提示鎂離子濃度和pH值都有可能影響細(xì)胞活力。

圖1 不同濃度浸提液接觸24 h后的細(xì)胞存活率

圖2 pH值調(diào)整前后的細(xì)胞存活率

表1 浸提原液中的Mg2+濃度、pH值和細(xì)胞存活率

2.1.3 不同pH值對(duì)細(xì)胞活力的影響 浸提原液在調(diào)與不調(diào)pH的條件下細(xì)胞活力比較見圖2。結(jié)果顯示：未調(diào)整pH值時(shí)Mg-1Ca合金組細(xì)胞活力小于高純鎂組（P＜0.05）。當(dāng)調(diào)整材料浸提原液的pH值為7.4之后，細(xì)胞活力均上升至70%以上，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示在鎂離子濃度不變的情況下，pH值是引起細(xì)胞活力下降的主要原因。

2.2 遺傳毒性

2.2.1 Ames試驗(yàn) 結(jié)果顯示，2種材料浸提液在有或無代謝活化條件下，各試驗(yàn)菌株的自發(fā)回變數(shù)均在范圍內(nèi)，2組材料浸提液的各劑量組回變菌落數(shù)均未超過陰性對(duì)照組的2倍以上，且無劑量相關(guān)性趨勢(shì)，結(jié)果為陰性（見表2～3）。提示2種材料對(duì)鼠傷寒沙門氏菌均無致突變性。

2.2.2 MLA試驗(yàn) 在無代謝活化條件下，2種材料的浸提原液與懸浮生長(zhǎng)的小鼠淋巴瘤細(xì)胞交換24 h后的結(jié)果顯示：100%浸提液組的細(xì)胞不成簇，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，有一定的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞相對(duì)存活率低于10%而無法鋪板。其余各濃度組在有或無代謝活化條件下，高純鎂組的突變頻率在（96.5～169.4） ×10-6之間 ；Mg-1Ca合金組的突變頻率在（93.3～152.0） ×10-6之間。與陰性對(duì)照組相比，2種材料浸提液各濃度組的突變頻率未見明顯增高，結(jié)果為陰性，提示2種材料浸提液均未引起體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變。

2.3 急性全身毒性

在注射各組浸提液后的72 h觀察期內(nèi)，試驗(yàn)組動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡；小鼠體重增長(zhǎng)正常；呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)等臨床癥狀均未見異常；生物學(xué)反應(yīng)均不大于介質(zhì)對(duì)照組。提示2種材料浸提液未引起急性的全身毒性反應(yīng)。

表2 純鎂浸提液的Ames結(jié)果（）

表2 純鎂浸提液的Ames結(jié)果（）

鼠傷寒沙門氏菌株組別TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 12.5% 109±12 123±16 23±2 20±3 115±8 123±13 289±22 286±38 25% 110±14 113±9 20±2 28±2 112±8 116±11 299±28 300±30 50% 107±6 114±9 21±5 26±3 114±8 126±15 278±20 275±21 100% 100±9 113±11 20±2 19±4 113±10 125±14 275±22 294±21陰性 105±9 125±7 21±4 26±4 121±8 132±15 288±22 296±26陽性 1139±112 1159±119 502±23 829±51 1286±101 1349±116 1391±106 1456±118

表3 Mg-1Ca合金浸提液的Ames結(jié)果（）

表3 Mg-1Ca合金浸提液的Ames結(jié)果（）

鼠傷寒沙門氏菌株TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 12.5% 114±9 125±9 38±5 35±3 150±11 142±9 312±25 317±28 25% 116±13 125±14 31±7 38±9 133±7 125±7 331±27 321±23 50% 108±14 123±10 25±4 33±3 134±9 138±11 311±32 316±24 100% 118±11 124±8 36±4 36±6 139±16 136±11 285±31 311±27陰性 105±9 125±7 21±4 26±4 121±8 132±15 288±22 296±26陽性 1139±112 1159±119 502±23 829±51 1286±101 1349±116 1391±106 1456±118組別

2.4 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)

在 72 h 觀察期內(nèi)，所有動(dòng)物浸提液注射區(qū)域的紅斑、水腫反應(yīng)記分均為0，材料組和對(duì)照組的平均記分之差均為0（不大于1.0），提示2種材料的浸提液不會(huì)產(chǎn)生皮內(nèi)刺激反應(yīng)。

2.5 致敏試驗(yàn)

在去除浸提液貼敷片后的48 h觀察期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組所有動(dòng)物的腹部皮膚均未見紅斑、水腫等明顯改變， Magnusson 和Kligman分級(jí)記分均為0，皮膚致敏反應(yīng)不大于對(duì)照組。研究表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，2種材料浸提液未引起豚鼠病理性免疫反應(yīng)（Ⅳ型免疫變態(tài)反應(yīng)），無致敏性。

2.6 肌肉植入試驗(yàn)

大體解剖觀察顯示：4 w、12 w的局部肌肉組織中明顯包裹著透明空腔，26 w時(shí)仍可見局部氣腔。固定后切開肌肉組織橫截面發(fā)現(xiàn)內(nèi)部有大小不一、不規(guī)則的蜂窩狀氣孔存在。4 w時(shí)2組植入物的大小、形狀基本未見異常改變，12 w時(shí)2組植入物變細(xì)，表面有缺損、形狀不規(guī)則，且植入物表面出現(xiàn)白色粉末狀物質(zhì)。26 w時(shí)高純鎂組多數(shù)植入物變細(xì)變短，局部缺損或斷裂；Mg-1Ca合金組多數(shù)殘余植入物出現(xiàn)明顯斷裂或消失。

光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組26 w時(shí)材料植入處未見炎性浸潤(rùn)。纖維囊壁薄，由纖維細(xì)胞和膠原蛋白構(gòu)成（見圖3A）。高純鎂組4 w時(shí)的材料植入處見少量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見異物巨細(xì)胞；纖維囊大小不一，膨脹成不規(guī)則形狀，周圍肌纖維部分?jǐn)嗔眩?2 w時(shí)纖維囊大小、形狀不一，囊壁變??；26 w時(shí)材料植入處基本未見炎癥反應(yīng)；囊壁極薄，可見較多的脂肪組織增生（見圖3B）。Mg-1Ca合金組各期的組織學(xué)表現(xiàn)與高純鎂組基本相似（見圖3C）。高純鎂及Mg-1Ca合金與陰性對(duì)照組相比的組織學(xué)平均記分之差均為0，可判定為無刺激性。

3 討論

MTT試驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞活性的有效方法，它具有靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性的檢測(cè)評(píng)價(jià)。在本研究中，由于鎂基材料的降解行為導(dǎo)致細(xì)胞活力發(fā)生一定程度的下降，這可能是細(xì)胞受到降解產(chǎn)物鎂離子和培養(yǎng)液pH值變化兩方面的影響所致。為了進(jìn)一步解釋這一問題，我們一方面通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，另一方面測(cè)定浸提液中的鎂離子濃度，結(jié)果顯示：與Mg-1Ca合金相比，高純鎂由于所含鎂的純度高而腐蝕速度較慢，產(chǎn)生Mg2+相對(duì)較少，因此高純鎂浸提液接觸細(xì)胞后的細(xì)胞存活率明顯高于Mg-1Ca合金組，2組浸提液的pH值均為堿性（9.0～9.1）。調(diào)整浸提液pH值為7.4后的MTT試驗(yàn)結(jié)果表明：在保持Mg2+濃度不變的情況下，Mg-1Ca的細(xì)胞活力大大提高，2組的細(xì)胞活力均接近80%，揭示細(xì)胞活力可能更依賴于酸堿環(huán)境。因此，我們推測(cè)，Mg2+的釋放不是影響其細(xì)胞活力的單一因素，調(diào)整pH值到7.4可能更能模擬體內(nèi)真實(shí)環(huán)境。

圖3 肌肉植入后4 w，12 w，26 w組織病理學(xué)表現(xiàn)（×50）

一般體外細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)是在非生理?xiàng)l件下或不受控制的pH值下進(jìn)行的[13-14]，由于鎂金屬的快速降解已明確地會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基的pH升高，及其降解產(chǎn)物濃度升高可能會(huì)改變體外試驗(yàn)系統(tǒng)的pH值和/或滲透壓?？紤]到體內(nèi)生理?xiàng)l件下機(jī)體有一定的緩沖能力，即體內(nèi)存在循環(huán)系統(tǒng)和碳酸鹽平衡的生理性調(diào)節(jié)功能，因此，在本實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)?shù)卣{(diào)整浸提液的pH值到7.4作為體外試驗(yàn)系統(tǒng)的一種緩沖補(bǔ)償后進(jìn)行細(xì)胞活力評(píng)價(jià)。

細(xì)胞DNA損傷和基因突變是引起癌癥的一個(gè)重要因素，因此對(duì)于長(zhǎng)期應(yīng)用于人體的高純鎂和鎂合金類可降解材料，有必要進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)來檢測(cè)是否存在材料導(dǎo)致的DNA損傷。本研究采用ISO10993-3推薦的Ames試驗(yàn)和MLA試驗(yàn)的組合來評(píng)價(jià)高純鎂和Mg-1Ca合金潛在的致突變性。Ames試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出大多數(shù)致癌物質(zhì)所產(chǎn)生的相關(guān)基因改變；MLA試驗(yàn)的遺傳學(xué)終點(diǎn)是胸苷激酶（thymidinek inase，TK）基因的突變，且常染色體上TK基因位點(diǎn)的突變?cè)囼?yàn)可用于評(píng)價(jià)染色體畸變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：2種材料均未引起鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變和小鼠淋巴瘤基因突變，提示無潛在的致突變性。在本實(shí)驗(yàn)條件下，除了100%浸提液24 h組顯示有一定的細(xì)胞毒性之外，其余稀釋濃度組的突變頻率均在正常范圍之內(nèi)。

全身毒性反應(yīng)是生物材料臨床應(yīng)用前必須研究的項(xiàng)目之一。高純鎂及Mg-1Ca合金作為可降解的植入材料，當(dāng)其降解成分被釋放進(jìn)入體內(nèi)后，有可能會(huì)引起全身毒性反應(yīng)。因此，本研究首先對(duì)這2種材料進(jìn)行了急性全身毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示它們均未引起小鼠急性全身毒性反應(yīng)。同時(shí)也未引起局部皮內(nèi)反應(yīng)以及誘發(fā)豚鼠皮膚超敏反應(yīng)，這與王飛等的動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果一致[15]。

本研究的肌肉植入實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種鎂基材料均具有良好的組織相容性，盡管植入早期（4 w）的組織學(xué)上顯示有輕微的炎癥反應(yīng)，但12 w和26 w時(shí)均未見局部肌肉組織的炎癥反應(yīng)，材料植入點(diǎn)的囊壁纖維化反應(yīng)與對(duì)照組之間沒有明顯差異，說明鎂基可降解材料在試驗(yàn)期間可以被機(jī)體所耐受[16]。然而，研究也發(fā)現(xiàn)：在4 w、12 w的局部肌肉組織中均存在明顯的氣體腔隙，且到26 w時(shí)氣腔仍存在，俞懿強(qiáng)等[17]的長(zhǎng)期骨植入試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了局部產(chǎn)氣現(xiàn)象也未見明顯的炎性反應(yīng)。有報(bào)道認(rèn)為氫氣在血液、肌肉中都有一定的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)[18]，能夠依靠溶解、擴(kuò)散被周圍組織吸收，但是氫氣在肌肉和骨組織中的擴(kuò)散、吸收的機(jī)理尚不清楚。因此，本文提示未來臨床研究中有必要關(guān)注局部的產(chǎn)氣問題，該氣體的持續(xù)存留是否會(huì)影響局部組織的長(zhǎng)期愈合以及對(duì)局部肌肉運(yùn)動(dòng)有無影響等尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，高純鎂的細(xì)胞存活率優(yōu)于鎂-1鈣合金，Mg2+的釋放不是影響其細(xì)胞活力的單一因素，在一定的Mg2+濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞活力可能更依賴于其酸堿環(huán)境；2種鎂基材料無遺傳毒性、無急性全身毒性、無刺激性和致敏性，具有良好的組織相容性。