CPP-ACP聯(lián)合氟化物用于釉質(zhì)再礦化研究進(jìn)展

徐煜 鄒慧儒，2，3

1天津市口腔醫(yī)院中心實驗室，南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 300041；2天津市口腔功能重建重點實驗室 300041；3藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室（南開大學(xué)），天津 300071

0 引 言

牙釉質(zhì)主要由羥基磷灰石（hydroxyaptite，HA）組成。在多種致齲因素作用下，釉質(zhì)脫礦形成白斑，需要進(jìn)行再礦化治療。如何促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化、逆轉(zhuǎn)齲病進(jìn)展成為當(dāng)前研究熱點。大量研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)氟化物可促進(jìn)釉質(zhì)再礦化，并通過替代HA結(jié)構(gòu)中的羥基形成氟磷灰石，進(jìn)而降低釉質(zhì)表面溶解度，阻止釉質(zhì)脫礦。然而，上述過程極度依賴口腔環(huán)境中的鈣離子和磷酸根離子[1]。酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）是一種源自牛奶的活性多肽，可穩(wěn)定高濃度的鈣離子、磷酸根離子，形成酪蛋白磷酸肽-無定形磷酸鈣（casein phosphopeptideamorphic calcium phosphate，CPP-ACP），從而抑制釉質(zhì)脫礦并促進(jìn)再礦化[2]。CPP-ACP 與氟化物聯(lián)用可形成酪蛋白磷酸肽-無定形磷酸氟鈣（casein phosphopeptide-amorphic calcium fluoride phosphate，CPP-ACFP）復(fù)合物，有利于將氟離子、鈣離子和磷酸根離子運載至病變深部從而促進(jìn)再礦化?；谏鲜鲈硌邪l(fā)的產(chǎn)品主要有：GC Tooth Mousse（日本Recaldent 公司）（含質(zhì)量濃度為100 g/L 的CPPACP）、GC Tooth Mousse Plus或MI Paste Plus（日本Recaldent 公司）（含質(zhì)量濃度為100 g/L 的CPP-ACP及900 mg/L 氟離子）。近年來，國內(nèi)外多個團(tuán)隊開展了CPP-ACP 及CPP-ACP 與氟化物聯(lián)合用于釉質(zhì)再礦化的研究，并取得了一定的進(jìn)展。然而，各研究結(jié)果報道不一，可能與多種影響因素干預(yù)相關(guān)[3-7]。本文將對CPP-ACP 及CPP-ACP 聯(lián)合氟化物用于釉質(zhì)再礦化研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，重點分析可能的影響因素，以期為未來實驗設(shè)計及臨床應(yīng)用提供參考。

1 CPP-ACP 聯(lián)合氟化物用于釉質(zhì)再礦化相關(guān)研究匯總

CPP 可將ACP 定植至牙菌斑中，提高牙菌斑中的鈣離子和磷酸根離子水平，促進(jìn)釉質(zhì)再礦化，該結(jié)論已在大量實驗中得到證實，但其再礦化效果是否優(yōu)于氟化物尚無定論[8-11]。此外，已有多項體外實驗[3-6,12-15]、動物實驗[16]和臨床試驗[17-18]結(jié)果證實CPPACP 與氟化物聯(lián)用較單獨應(yīng)用其中一種的再礦化效果更好。然而，也有大量研究報道CPP-ACP 與氟化物聯(lián)用并無協(xié)同作用[8-11,19-21]。本文列舉了部分體外實驗及臨床試驗研究結(jié)果（表1 和表2）并進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同的實驗材料、試劑、實驗方法及檢測手段，得出的實驗結(jié)果不盡相同。

表1 CPP-ACP 與氟化物用于釉質(zhì)再礦化體外離體牙實驗部分文獻(xiàn)匯總

表2 CPP-ACP 與氟化物用于釉質(zhì)再礦化臨床試驗部分文獻(xiàn)匯總

2 影響因素

2.1 時間因素（作用時間、使用頻率和藥物單次作用時間）

藥物的作用時間對于早期釉質(zhì)齲損的再礦化非常重要。大多數(shù)體外實驗均設(shè)置某一固定的pH循環(huán)天數(shù)進(jìn)行結(jié)果觀察，但周期較短，缺乏長期追蹤分析。而Thierens 等[3]分別于實驗第6、12 周進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CPP-ACFP 組在第12 周脫礦量顯著減少，且接近病損表面的釉質(zhì)礦物質(zhì)含量基本保持不變，提示CPP-ACFP 需一定的作用時間才能生效，以利于藥物擴(kuò)散以及病損區(qū)域礦物質(zhì)沉積。Dai 等[22]也證實CPP-ACP 與氟化物聯(lián)用3 個月較1 個月效果更為顯著。因此，CPP-ACP 用于釉質(zhì)再礦化可能需要觀察較長時間。這或許可以解釋Lata 等[21]為何在CPP-ACP 組未觀察到釉質(zhì)下再礦化現(xiàn)象，因其在pH 循環(huán)5 d 后即開始檢測，可能尚未達(dá)到CPP-ACP 有效促進(jìn)再礦化的作用時間。上述研究結(jié)果提示在實驗設(shè)計時，需監(jiān)測隨著時間變化藥物發(fā)揮促進(jìn)再礦化作用的情況，并關(guān)注長期追蹤結(jié)果。

藥物的使用頻率對于再礦化的效果也很關(guān)鍵。氟保護(hù)漆并非每天使用，且因刷牙等機(jī)械作用，氟保護(hù)漆逐漸被清除，導(dǎo)致再礦化效果減弱。而CPPACP 每天均用，使用頻率較高，并可根據(jù)pH 值變化情況吸收或釋放鈣離子和磷酸根離子，這對于維持局部離子濃度相對穩(wěn)定非常重要，再礦化效果顯著提升[23]。

此外，藥物單次作用時間也很重要。當(dāng)前各實驗設(shè)置的藥物單次作用時間多不統(tǒng)一。Lata 等[21]在使用氟保護(hù)漆和CPP-ACP 乳膏時，氟保護(hù)漆涂抹時間設(shè)為20 s，CPP-ACP 乳膏涂抹時間則設(shè)為3 min；而Dai 等[22]則是在涂抹一薄層氟保護(hù)漆后干燥4 h，再浸入人工唾液中，另一組在涂抹MI Paste Plus后靜置30 min，沖洗5 s 后再浸入人工唾液中。由于實驗設(shè)置的氟保護(hù)漆與CPP-ACP 的單次作用時間不同，在此基礎(chǔ)上比較氟化物與CPP-ACP 的再礦化效果可能會存在一定偏差，從而影響不同實驗的結(jié)果分析與比較評價。

2.2 藥物濃度、劑型等因素

氟化物與CPP-ACP 的濃度和比例需要引起充分重視。目前大多數(shù)實驗使用的CPP-ACP 產(chǎn)品主要為GC Tooth Mousse、GC Tooth Mousse Plus或MI Paste Plus，CPP-ACP 質(zhì)量濃度均為100 g/L，一致性較好。但各實驗應(yīng)用的氟化物濃度存在較大差異。GC Tooth Mousse Plus或MI Paste Plus含有900 mg/L 氟化物。Al-Batayneh 等[5]則將500 mg/L 的氟化物與100 g/L CPP-ACP 聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)其再礦化效果顯著。劉路和鄒敏[12]證實在一定范圍內(nèi)，氟離子濃度越高，氟化物與CPP-ACP 的協(xié)同作用越好。而Reynolds 等[24]發(fā)現(xiàn)大鼠實驗中應(yīng)用5 g/L CPP-ACP的減緩齲病進(jìn)展效果與應(yīng)用500 mg/L 氟化物相近，臨床試驗結(jié)果顯示含20 g/L CPP-ACP 與1 100 mg/L氟化物的牙膏其再礦化效果更佳。另有臨床試驗結(jié)果表明500 mg/L 氟化物與100 g/L CPP-ACP 的再礦化效果相似[10]。然而，尚有多項研究結(jié)果表明在普通口腔衛(wèi)生護(hù)理（含1 000～1 450 mg/L 氟）的基礎(chǔ)上使用CPP-ACP 并未顯著提升再礦化效果[8,19]，提示在此范圍內(nèi)的氟離子濃度可能并非與CPP-ACP 發(fā)揮協(xié)同作用的最佳濃度，因為氟離子可能取代HA 中的羥基形成氟磷灰石，在釉質(zhì)表面高度礦化，從而阻礙CPP-ACP 向病變深部滲透發(fā)揮作用。在體外，氟離子濃度過高還可能與CPP-ACP 中的鈣離子結(jié)合形成氟化鈣，從而抑制再礦化，而體內(nèi)試驗還涉及菌斑生物膜這一變量。由此可見即使是使用相同的氟離子濃度，其體內(nèi)試驗與體外實驗結(jié)果也可能存在較大差異。因此，需要進(jìn)一步探究臨床應(yīng)用時氟離子與CPP-ACP 的最佳作用濃度與比例。

即使藥物濃度相同，而藥物劑型不同，其作用效果也會存在顯著差異。例如溶液與糊劑之間即存在差異。溶液的滲透性較好，但易被唾液稀釋；糊劑的滲透性較差，但存留時間可能較長[25]。Thakkar等[26]的體外研究結(jié)果顯示，CPP-ACFP 保護(hù)漆的效果優(yōu)于CPP-ACFP 糊劑。Lale 等[27]發(fā)現(xiàn)，含CPP-ACFP的保護(hù)漆可快速、大量釋放氟離子和鈣離子。對于含有相同藥物濃度的溶液與糊劑的再礦化效果，仍需進(jìn)一步的體外實驗及體內(nèi)試驗研究。

由于各研究多采用商品化試劑，因此不能排除各試劑中其他成分對再礦化的影響，例如氟保護(hù)漆通常含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氟化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.26%的F,22 600 μg F/g）或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的二氟硅烷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的F，1 000 μg F/g）作為活性成分，此外還含有多種樹脂/松香混合物。商品化試劑中還可能存在其他形式的氟化物，例如單氟磷酸鈉、氟化胺、氟化鉀、氟化鈣、氟化亞錫或上述化合物的組合等；另外還有一些附加成分，例如調(diào)味劑、防腐劑和各種鈣鹽等，這些成分均可能干擾試劑的再礦化效果[28]。其中糖醇類甜味劑如木糖醇、山梨醇等對變異鏈球菌等致齲菌具有抑制作用，可通過抑制齲進(jìn)展進(jìn)而影響牙齒再礦化[29]。有關(guān)其他成分對再礦化的影響研究仍有待深入，目前尚無關(guān)于其他有機(jī)或無機(jī)成分影響釉質(zhì)再礦化的研究。

2.3 藥物使用順序

CPP-ACP 與氟化物聯(lián)用時，兩者的使用順序可能會對結(jié)果造成較大影響。Al-Batayneh 等[5]的研究結(jié)果顯示，先使用CPP-ACP 再使用氟化物較兩者使用順序相反時的再礦化效果更好。也有研究人員比較了先使用氟化物再使用CPP-ACP 或CPP-ACFP與單純使用氟化物的再礦化效果，結(jié)果顯示兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義[7-8]?？赡艿脑蛑皇窍仁褂梅锟赡軙?dǎo)致氟磷灰石在釉質(zhì)表面沉積，導(dǎo)致齲白斑表面孔隙孔徑減小、數(shù)量減少，進(jìn)而影響CPPACP 向病變深部滲透發(fā)揮作用。臨床試驗也得出了一致的結(jié)果[10]。上述結(jié)果提示在實驗設(shè)計時，聯(lián)合使用氟化物尤其是氟化物濃度較高時，應(yīng)謹(jǐn)慎考慮使用順序可能對結(jié)果造成的影響。

2.4 不同體外脫礦模型的脫礦方法及齲病病變部位及程度等

齲白斑是齲病的早期損害，主要表現(xiàn)為釉質(zhì)下脫礦而表層相對完整。需要注意的是，在體外實驗中，脫礦液與人工唾液的成分也很重要。不同pH 循環(huán)方案造成的病損模型有所不同。例如在脫礦液中加入0.2 mg/L 氟離子，可在牙齒表面形成氟磷灰石以防止表面脫礦，同時鈣離子和磷酸根離子濃度均為飽和水平的50%，僅引起釉質(zhì)表面下的溶解，更接近于體內(nèi)釉質(zhì)早期病變的情況，即具有相對完整表層的釉質(zhì)下脫礦[21]。而表面缺損的病變模型中再礦化藥物可能更易進(jìn)入病變深部，因而預(yù)后也不同[15]。

齲病病變部位不同，對再礦化效果也可能產(chǎn)生不同影響。Yazicioglu 等[30]通過體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)CPPACFP 對平滑面和窩溝的齲白斑均具有一定的再礦化效果，而Llena 等[7]的體內(nèi)試驗結(jié)果則表明CPPACFP 對平滑面齲的再礦化效果優(yōu)于窩溝齲。造成上述差異的原因，一方面是由于兩組志愿者的年齡段不同，牙齒發(fā)育狀況、口腔衛(wèi)生條件和飲食習(xí)慣等不確定因素存在差異；另一方面是由于兩組志愿者的窩溝形態(tài)、齲損深度等均可能影響藥物滲透發(fā)揮作用。因此，在設(shè)計實驗時，需綜合考慮上述因素。

2.5 pH 值

口腔內(nèi)pH 值處于動態(tài)變化中，CPP-ACP 可在pH 值較高時穩(wěn)定大量鈣離子和磷酸根離子，在pH值降低時將其釋放[23]；還可與氫離子結(jié)合緩沖局部pH 值，維持離子的過飽和狀態(tài)。然而在體外實驗中則缺乏上述動態(tài)變化，這可能是體外實驗CPP-ACP再礦化作用弱于氟化物或與氟聯(lián)用時效果不佳的原因之一[6,21,31]。Cochrane 等[32]的研究結(jié)果顯示，pH值為6.0～7.0 時CPP-ACP 與CPP-ACFP 作用相似，而pH 值在5.5 以下時CPP-ACFP 效果更好，提示pH 值降低有助于CPP-ACFP 促進(jìn)再礦化。單長麗等[33]對青少年口腔pH 值進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)一天中口腔內(nèi)pH 值最低為晨起時，此外餐后15 min 內(nèi)pH值降低明顯。因此可根據(jù)口腔內(nèi)pH 值變化規(guī)律，選擇合適的時間，使用CPP-ACP 抑制釉質(zhì)脫礦、促進(jìn)再礦化。

2.6 菌斑生物膜

菌斑生物膜在釉質(zhì)再礦化中也發(fā)揮著重要作用。體外實驗中釉質(zhì)樣本表面無菌斑生物膜的存在，故對再礦化效果影響較大。CPP 可抑制致齲菌黏附于獲得性薄膜，延緩菌斑生物膜的成熟，同時還可抑制致齲菌胞膜上的鈣離子泵活性從而阻斷其代謝[34]。CPP 與口內(nèi)菌斑生物膜相互作用，發(fā)揮抗齲效果，促進(jìn)再礦化，這一點早在Reynolds[35]的研究中得到證實。此外，也有研究人員發(fā)現(xiàn)CPP-ACP 能抑制唾液中變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌、格氏鏈球菌等致齲菌的水平[36-37]。Dashper 等[4]在釉質(zhì)標(biāo)本上添加了6 種齦上菌斑中的常見細(xì)菌，模擬口內(nèi)牙齒表面菌斑生物膜，再用SnF2和/或CPP-ACP 進(jìn)行處理，結(jié)果顯示CPP-ACP 與氟化物聯(lián)用可更大程度地抑制產(chǎn)酸菌，同時抑制釉質(zhì)脫礦。

2.7 檢測方法

目前，常用的檢測方法有國際齲病檢測評估系統(tǒng)、激光熒光檢測（DIAGNOdent）、掃描電子顯微鏡觀察、定量光導(dǎo)熒光技術(shù)、顯微硬度測試、顯微放射照相、光學(xué)相干斷層掃描術(shù)等[8-9,11,22]。國際齲病檢測評估系統(tǒng)主要用于口內(nèi)檢測，但視覺評分受研究人員主觀影響較大，可重復(fù)性與再現(xiàn)性相對較差；檢測釉質(zhì)表層及表層下再礦化水平時，常采用橫斷顯微硬度和表面顯微硬度兩個指標(biāo)。橫斷顯微硬度指標(biāo)的獲取過程為有創(chuàng)檢查，需將釉質(zhì)標(biāo)本制成橫斷面，使得臨床試驗口內(nèi)檢測受到限制[38]。為了不影響試驗結(jié)果的真實性與可信性，有研究人員改進(jìn)試驗將體外制備好的釉質(zhì)塊放入受試者口中，模擬真實環(huán)境進(jìn)行釉質(zhì)再礦化，檢測時再行取出，以最大程度地保留CPP-ACP 與菌斑生物膜、唾液等相互作用[11]。DIAGNOdent 可能更適于檢測咬合面及光滑面的齲損，靈敏度較高，但在熒光采集測量過程中材料可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果[39,6]。因此，建議聯(lián)合使用多種檢測方法、實施多次檢測以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.8 其他因素

CPP-ACP 聯(lián)合氟化物用于釉質(zhì)再礦化的影響因素除了藥物作用時間、作用濃度、藥物劑型等之外，還存在其他因素，如口腔衛(wèi)生狀況、飲食習(xí)慣、刷牙、頰舌肌運動、個人的唾液再礦化能力、口腔內(nèi)溫度等。刷牙與頰舌肌運動等可導(dǎo)致再礦化藥物的機(jī)械清除，而機(jī)械清除不僅會引起藥物流失，還可能破壞病損結(jié)構(gòu)。一方面機(jī)械清除有助于暴露深部病變，使再礦化藥物易于滲透至病損深部；另一方面機(jī)械清除會導(dǎo)致釉質(zhì)結(jié)構(gòu)喪失，從而無法達(dá)到釉質(zhì)完全再礦化[40]。因此，越來越多的研究開始將飲食習(xí)慣、刷牙、唾液等影響因素納入實驗設(shè)計考慮因素中，以期更逼真地模擬口內(nèi)實際情況，盡可能得出與臨床實際應(yīng)用相近的結(jié)果[41-42]。此外，有研究結(jié)果表明，白天清醒狀態(tài)下的口腔內(nèi)平均溫度為33.9 ℃，夜間睡眠狀態(tài)下的口腔內(nèi)平均溫度為35.9 ℃[43]，然而大部分體外實驗使用的pH 循環(huán)模型溫度設(shè)置為37.0 ℃。溫度設(shè)置的不同可能導(dǎo)致再礦化藥物活性、釋放速率等出現(xiàn)差異，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。因此體外實驗設(shè)計時應(yīng)盡量參考真實口腔環(huán)境溫度，以更好地模擬口內(nèi)環(huán)境，減小偏差。

3 結(jié) 語

CPP-ACP 作為一種生物活性物質(zhì)，其聯(lián)合氟化物用于釉質(zhì)再礦化具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于藥物作用時間、濃度、藥物劑型、檢測手段等多種影響因素的干預(yù)，兩者聯(lián)用的確切療效尚待進(jìn)一步研究。實驗設(shè)計時應(yīng)綜合考慮口內(nèi)與口外環(huán)境的差異，盡量設(shè)計并分析各種影響因素對結(jié)果造成的影響：①建議設(shè)置不同作用濃度、作用時間、使用頻次、使用順序的CPP-ACP 與氟化物聯(lián)合應(yīng)用組，以探尋最佳作用濃度、作用時間及使用頻次。②需考慮藥物劑型及試劑內(nèi)其他成分對實驗結(jié)果的影響。③需考慮不同脫礦方法構(gòu)建的體外脫礦模型以及病變部位、病變深度對再礦化效果的影響。④單一檢測方法可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，建議聯(lián)合使用多種檢測方法、實施多次檢測以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。⑤其他因素，如口腔衛(wèi)生狀況、飲食習(xí)慣、刷牙等因素也需考慮在內(nèi)，盡可能模擬真實的口腔環(huán)境，以減少試驗偏差。建議未來制定規(guī)范化的實驗標(biāo)準(zhǔn)，以便更好地指導(dǎo)臨床實踐。采用CPP-ACP和氟化物聯(lián)用治療早期釉質(zhì)齲時，應(yīng)明確合理的作用時間、選擇合適的藥物劑型及使用方法，并長期觀察，以取得更好的再礦化效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突