miRNA-33a、miRNA-33b在高血脂人群中的表達(dá)及與血脂指標(biāo)的相關(guān)性

吳燕丹

北京市順義區(qū)醫(yī)院檢驗科 101300

0 引 言

高血脂癥是血液脂質(zhì)代謝異常性疾病，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也會引起急性胰腺炎和脂肪肝等疾病。臨床上通常將高脂血癥分為高總膽固醇（total cholesterol，TC）血癥、甘油三酯（triglyceride，TG）血癥、混合型高脂血癥、低高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）血癥4 個類型[1]。其中，混合型合并低HDL-C 型最多見，其次為混合型[2]。生物信息學(xué)及試驗研究結(jié)果表明，多種人類蛋白編碼基因的表達(dá)受微小RNA（microRNA，miRNA 或miR）的調(diào)控，同一種miRNA 可能同時抑制多個目標(biāo)基因或作用于多個mRNA。有研究結(jié)果表明，生物的發(fā)育、形成、代謝與凋亡等生命過程與miRNA 的調(diào)控作用密切相關(guān)。其中，脂代謝的調(diào)控機(jī)理是一個多因素、多基因、多步驟的復(fù)雜過程。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，miRNA 在脂代謝中起重要作用，其對膽固醇、低密度脂蛋白受體、脂肪酸等代謝進(jìn)行調(diào)控[3-4]。其中，miR-33 是脂質(zhì)代謝調(diào)控的重要元件，有2 個具有相似功能的亞型：miR-33a 和miR-33b。研究者發(fā)現(xiàn)，miR-33a 在HDL 的生物合成和膽固醇外排等代謝方面發(fā)揮重要作用[5-6]，且對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)具有調(diào)控作用[7-8]。本研究中，研究高血脂人群中miR-33a 和miR-33b 的表達(dá)情況，探討其與血脂指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取北京市順義區(qū)醫(yī)院于2018 年12 月至2019 年6 月收治的高血脂癥患者30 例，年齡（62.4±12.1）歲。高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)為《中國成人血脂異常防治指南》[9]，患者生化指標(biāo)滿足下列納入標(biāo)準(zhǔn)中的任意一項或多項即為高脂血癥。納入標(biāo)準(zhǔn)：空腹血清總膽固醇（TC）≥5.18 mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）≥3.37 mmol/L、甘油三酯（TG）≥1.70 以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）＜1.04 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病、高血壓病、冠心病以及嚴(yán)重肝腎功能異常性疾病，各種腫瘤疾病，自身免疫及血液病，吸煙者，酗酒者。

30 例納入的高血脂癥患者入觀察組，另選取30 位健康體檢者（60.8 歲±11.2 歲）入對照組。

1.2 主要材料與儀器

miR-33a 引 物 序 列、miR-33b 引 物 序 列、U6 snRNA 引物序列[生工生物工程(上海)股份有限公司]。IQ5 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析儀（美國Bio-Rad 公司），7180 型全自動生化儀（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 生化指標(biāo)檢測

于清晨抽取患者空腹靜脈血。血樣在3000 r/min條件下離心10 min，取血清。采用全自動生化儀檢測血清生化指標(biāo)；采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法檢測TG；采用選擇性可溶化法檢測LDL-C；采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖（glucose，GLU）；采用免疫濁度法檢測載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，ApoA1）和載脂蛋白B（ApoB）。

1.3.2 實時定量PCR 檢測

采用莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，利用PCR 分析儀定量檢測血清中miR-33a 和miR-33b的表達(dá)情況，所用引物序列見表1。以U6 snRNA 作為標(biāo)準(zhǔn)化對照，采用比較CT（cycle-threshold）值法對樣品擴(kuò)增進(jìn)行計算，再分別計算miR-33a 和miR-33b 的相對表達(dá)量，計算公式如下：

表1 實時定量PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性和正態(tài)分布檢驗。計量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用卡方（χ2）檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床資料比較

兩組患者的臨床資料見表2。結(jié)果表明，兩組患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、血糖、血清ApoA1 及ApoB 水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；觀察組患者的血清LDL-C、TG、TC水平明顯高于對照組，而HDL-C 水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 高血脂癥患者（觀察組）和健康者（對照組）的臨床特征比較（Mean±SD）

2.2 血清中miR-33a 和miR-33b 的表達(dá)量

結(jié)果顯示，高血脂癥患者（觀察組）血清中miR-33a 和miR-33b 的相對表達(dá)量均高于健康者（對照組）（均P＜0.05），且分別升高4.03±0.68 倍和3.08±0.51 倍。（圖1）

圖1 高血脂癥者和健康者的血清miR-33a 和miR-33b 的表達(dá)量

2.3 miR-33a 和miR-33b 與血脂指標(biāo)的相關(guān)性

分析高血脂者（觀察組）血清中miR-33a 和miR-33b 的表達(dá)水平與其臨床特征指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果表明，miR-33a 和miR-33b 表達(dá)水平與LDL-C、TG、TC、ApoB 正相關(guān)，與HDL 負(fù)相關(guān)，見表3。進(jìn)一步分別以miR-33a 和miR-33b 的相對表達(dá)量為因變量并以臨床特征指標(biāo)為自變量，進(jìn)行多元回歸分析。結(jié)果顯示，miR-33a 和miR-33b 的相對表達(dá)量的影響因素均為TG、TC 和LDL-C，見表4。

表3 血脂指標(biāo)與miR-33a 和miR-33b 表達(dá)水平的相關(guān)性

表4 血脂指標(biāo)與miR-33a 和miR-33b 表達(dá)水平的多元線性回歸分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

心腦血管類疾病以及胰腺炎等多種常見病與血脂代謝異常有密切關(guān)系。不良的飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)、脂代謝相關(guān)的基因出現(xiàn)缺陷或突變是原發(fā)性高脂血癥的主要病理基礎(chǔ)，脂代謝相關(guān)的基因包括ApoB 基因、LDL-R 基因、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）基因、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）基因等。繼發(fā)性高血脂癥的誘因包括代謝紊亂性疾病，常伴有糖尿病、甲功低下、高血壓、肥胖癥、肝病等[10]。

microRNA 是一類在進(jìn)化上高度保守的單鏈成熟非編碼RNA，在人類及其他動物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)壁細(xì)胞中表達(dá)，在保持生理內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病發(fā)生過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。隨著對microRNA 研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)microRNA 參與調(diào)控脂質(zhì)代謝，有調(diào)控血脂的動態(tài)平衡基因的作用。miR-122、miR-370、miR-27a/b、miR-302a、miR-33等多個microRNA 主要通過相應(yīng)的靶基因上調(diào)或下調(diào)對轉(zhuǎn)錄調(diào)控血脂的代謝，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控低密度脂蛋白受體、脂肪酸、膽固醇的合成途徑，參與脂肪酸線粒體的氧化，催化甘油三酯類合成。其中，miR-33在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運方面起重要作用。研究結(jié)果表明，miR-33a 和miR-33b 通過抑制ABCA1 mRNA 以及蛋白的表達(dá)，實現(xiàn)調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運[5]。有研究者通過miR-33 模擬物實現(xiàn)miR-33 的表達(dá)增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中ABCA1 mRNA 和蛋白的表達(dá)受明顯抑制，進(jìn)而降低流向ApoA1 的膽固醇量；而內(nèi)源性的miR-33 在受抑制后，ABCA1 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，增大流向ApoA1 的膽固醇量。黃芪甲苷抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制主要是通過調(diào)控miR-33a，對下游信號ABCA1 的表達(dá)起到調(diào)控作用，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇從巨噬細(xì)胞內(nèi)流出，從而達(dá)到抗動脈粥樣硬化的作用[11-12]。通過研究巨噬細(xì)胞和其他造血細(xì)胞中miR-33 的丟失或miR-33b 的添加如何影響動脈粥樣硬化的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞特異性miR-33 丟失可減少高脂血癥條件下的脂質(zhì)積聚和炎癥，從而減少斑塊負(fù)擔(dān)[13]。還有研究者發(fā)現(xiàn)抑制miR-33a 和miR-33b 是一種可靠的提升HDL，降低極低密度脂蛋白（very LDL，VLDL）的治療手段,可用于心血管病相關(guān)的血脂異常靶向治療[8]。

miR-33 與HDL 的水平也存在相關(guān)性。針對非洲綠猴的研究結(jié)果表明，以miR-33a 和miR-33b 為靶點的抗miRNA 寡核苷酸的全身遞送增強(qiáng)了ABCA1的肝臟表達(dá)，并在12 周內(nèi)誘導(dǎo)血漿HDL 水平持續(xù)升高[14]。在小鼠和人細(xì)胞中，miR-33 通過調(diào)控ABCA1的表達(dá)，減少膽固醇向ApoA1 的流出。在小鼠巨噬細(xì)胞中，miR-33 也以ABCG1 為靶點，減少膽固醇向新生HDL 的流出。針對小鼠肝臟的研究結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)miR-33 抑制下游ABCA1 的表達(dá)可使循環(huán)HDL 水平明顯降低；而體內(nèi)miR-33 的沉默增強(qiáng)了肝臟ABCA1 的表達(dá)和血漿HDL 水平。上述研究結(jié)果提示miR-33 可調(diào)節(jié)肝臟中HDL 的生成和細(xì)胞膽固醇的流出[5]。

miR-33 不僅與HDL 密切相關(guān)，與LDL 水平也存在一定相關(guān)性。脂代謝相關(guān)基因低密度脂蛋白受體（LDL-R）參與脂蛋白的轉(zhuǎn)運和代謝。有研究結(jié)果表明，miR-33a 和miR-33b 在28 例高膽固醇血癥兒童血漿中的表達(dá)明顯高于25 例健康兒童，且miR-33a和miR-33b 的表達(dá)量與TC、LDL-C、LDL-C、HDL-C、ApoB 的水平正相關(guān)[15]。針對雞肝臟的研究結(jié)果表明，miR-33 可能通過負(fù)調(diào)節(jié)CROT 和HADHB 基因的表達(dá)，在雞肝脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，其中CROT和HADHB 基因是編碼脂質(zhì)氧化的關(guān)鍵酶[16]。此外，SREBP-2 在他汀類藥物治療的高膽固醇血癥患者中的臨床重要性被揭示，即他汀類藥物通過增加SREBP-2 及其靶點LDL 受體的肝臟表達(dá)來降低LDL-C 水平。在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中，通過miRMSN 的miR-33 干預(yù)顯著降低了18.9%的血清TG水平，并降低了肝臟的脂肪變性[17-18]。

本研究中，研究了高血脂人群血清miR-33a 和miR-33b 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-33a 和miR-33b 在高血脂患者血清中的表達(dá)明顯高于健康者。發(fā)現(xiàn)miR-33a和miR-33b 的表達(dá)量與血清LDL-C、TG、TC、ApoB水平正相關(guān)，與HDL 負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相似[15]。多元線性回歸分析結(jié)果表明，miR-33a 和miR-33b 的表達(dá)量的影響因素均為TG、TC 和LDL-C。上述結(jié)果提示，miR-33 在高血脂人群中異常表達(dá)，其機(jī)制可能是miR-33 通過靶向參與維持膽固醇、脂肪酸、脂蛋白穩(wěn)態(tài)等相關(guān)基因，進(jìn)而參與調(diào)控脂類代謝。

綜上，miR-33 在高血脂人群的血清中表達(dá)增強(qiáng)，且表達(dá)量與LDL-C、TG、TC、ApoB 水平有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果有助于認(rèn)識血脂代謝的機(jī)制，并為改進(jìn)臨床治療方法提供一些新的思路。本研究的局限性在于樣本數(shù)量相對較少，未來需開展多中心、多樣本研究，并進(jìn)一步揭示可能的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突