CDC45在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

高原 徐新生，2 張暉

1天津市南開(kāi)醫(yī)院肝膽胰外科 300102；2天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 300060

0 引 言

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的癌癥之一，且其發(fā)病率和死亡率位居所有癌癥前列[1-3]。目前，中國(guó)的HCC 患者占全球HCC 患者的50%以上[4]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，HCC的發(fā)病率與死率仍在持續(xù)增長(zhǎng)[5-6]。目前，HCC 的早期診斷方法主要有甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）檢測(cè)和B 超檢測(cè)。AFP 一直被視為HCC 的腫瘤標(biāo)志物，但由于AFP 的敏感性和特異性低，目前超聲檢測(cè)仍然是臨床上唯一推薦的HCC 篩查方法[7]。然而，由于早期HCC 癥狀不明顯，多數(shù)HCC 在診斷時(shí)已處于晚期，此時(shí)患者的五年生存率極低[8]。因此，臨床上迫切需要一種對(duì)HCC 靈敏的新型生物標(biāo)志物，以便對(duì)HCC 進(jìn)行早期診斷、治療，從而改善患者的預(yù)后。

細(xì)胞分化周期蛋白45（cell division cycle 45，CDC45）是一種高度保守的多蛋白復(fù)合物，包括CDC6/CDC18、微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs)和DNA 聚合酶，對(duì)真核生物DNA 復(fù)制的早期步驟具有重要作用。有研究結(jié)果顯示，CDC45 可促進(jìn)細(xì)胞增殖，與原代人類細(xì)胞相比，人類癌癥衍生細(xì)胞中的CDC45 水平始終較高[9]。c-Myc 是公認(rèn)具有致癌活性的基因，而CDC45的高表達(dá)概括了所有c-Myc 誘導(dǎo)的復(fù)制和損傷表型[10]。大量的研究結(jié)果表明，CDC45 與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如宮頸癌[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]等。近年來(lái)的一些研究結(jié)果表明，CDC45 在食管癌[14]、結(jié)直腸癌中也高表達(dá)并與疾病進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[15]。上述研究結(jié)果均表明，CDC45 在多種腫瘤中高度表達(dá)，并且與腫瘤疾病發(fā)展緊密相關(guān)，有成為腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。但關(guān)于CDC45 與HCC 之間的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道，有待進(jìn)一步去探索。

本研究中，探究CDC45 在HCC 組織與癌旁正常組織中表達(dá)量的差異并分析與臨床病理特征之間的關(guān)系。本研究結(jié)果有助于更深入地探究CDC45在HCC 中的作用機(jī)制，可以為HCC 的早期診斷、檢測(cè)及疾病進(jìn)展期治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013 年3 月至2021 年3 月，天津市南開(kāi)醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的HCC 患者90 例。其中，男性50 例，女性40 例，年齡（53.2±6.78）歲。全部病例均經(jīng)過(guò)臨床病理證實(shí)，并具有完整的病例資料。收集患者的HCC 組織與癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本，并收集患者的相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤大小及AFP表達(dá)水平。本回顧性研究中，對(duì)所有標(biāo)本的研究屬于對(duì)手術(shù)石蠟標(biāo)本的二次利用。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

Anti-CDC45 抗體（ab230178，英國(guó)Abcom 公司)，3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）。RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），BX51 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將石蠟標(biāo)本在5 ℃下切片，在65 ℃下烘烤45 min進(jìn)行脫蠟。切片在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中清洗3 次，每次3 min。將切片放入枸櫞酸緩沖液，將抗原放入微波爐高火處理5 min，中火處理10 min。去除多余的水，將H2O2溶液滴在濕盒子中15 min，再用PBS 清洗3 次，每次2 min。切片用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定25 min，然后用體積分?jǐn)?shù)為2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在PBS 中室溫封閉20 min，切片用anti-CDC45 抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。將切片在結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）的生物素二抗中孵育15 min 后，用DAB 試劑盒進(jìn)行染色反應(yīng)。最后用中性樹(shù)膠封片，倒置顯微鏡下觀察。

顯微鏡觀察時(shí)，隨機(jī)選取5 個(gè)不同的視野，依照陽(yáng)性細(xì)胞比例和陽(yáng)性染色強(qiáng)度2 個(gè)指標(biāo)評(píng)定組織切片中CDC45 的染色水平。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)為0%時(shí)，記為0 分，1%～25%時(shí)，記1 分，26%～50%時(shí)，記2 分，51%～85%時(shí)，記3 分。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色記0 分；弱染色記1 分；中度染色記2 分；高度染色記3 分。以陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積判斷表達(dá)情況，其中結(jié)果為5～9 分為高表達(dá)組，結(jié)果為1～4 分為低表達(dá)組。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過(guò)基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CDC45）和癌癥基因組圖集（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。篩選閾值為P＜0.05 和，其中FC（fold change）表示兩組間表達(dá)量的比值。同時(shí)以中位數(shù)作為Kaplan-Meier 生存分析的基礎(chǔ)，用虛線標(biāo)記95%置信區(qū)間。在線分析CDC45 在HCC 組織與癌旁正常組織中的表達(dá)量。此外，分析CDC45 高低表達(dá)與HCC 患者的總生存率、無(wú)病生存率的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。比較臨床病理特征與CDC45 表達(dá)間的關(guān)系時(shí)，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CDC45 在HCC 組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)GPEIA 在線分析CDC45 在HCC 組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，共分析HCC 組織369例及癌旁正常組織160 例。結(jié)果表明，CDC45 在HCC 組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05）（圖1）。為了進(jìn)一步證明CDC45 在HCC 進(jìn)展演變中發(fā)揮的作用，利用Kaplan-Meier 分析CDC45 與HCC 患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果表明，CDC45 表達(dá)量較高的患者中，總生存率（P＜0.001）和無(wú)病生存率（P＜0.001）均較低（圖2A 和2B）。上述結(jié)果提示，CDC45 在HCC 組織中的表達(dá)水平偏高，并與HCC 患者的預(yù)后生存期相關(guān)。

圖1 肝細(xì)胞癌（HCC）中細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）的mRNA 表達(dá)情況

圖2 細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存率的相關(guān)性

2.2 CDC45 在各種腫瘤組織中的表達(dá)

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，CDC45 在甲狀腺癌、類癌、前列腺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌等腫瘤組織中高度表達(dá)，而在胰腺癌、卵巢癌中表達(dá)卻并不明顯（圖3）。因此，進(jìn)一步探究了CDC45 在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CDC45 在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌組織中免疫組化染色呈陽(yáng)性（圖4）。

圖3 細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）在部分腫瘤中的表達(dá)情況

圖4 細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）在幾種常見(jiàn)腫瘤中的免疫組化染色結(jié)果（×200）

2.3 CDC45 作為HCC 潛在生物標(biāo)志物分析

上述結(jié)果提示，CDC45 可能是HCC 的一種潛在預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物。因此，對(duì)CDC45 作為肺癌與胰腺癌的預(yù)后標(biāo)志物，進(jìn)行了可行性分析。結(jié)果表明，CDC45 在2 種腫瘤中均可發(fā)揮顯著的預(yù)后生物標(biāo)志物作用，且在胰腺癌中更加明顯（圖5）。該結(jié)果提示，CDC45 有望在HCC 的預(yù)后預(yù)測(cè)中發(fā)揮作用，并有望成為靶向治療的靶點(diǎn)。

圖5 細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）作為腫瘤不良預(yù)后標(biāo)志物的潛力

2.4 CDC45 在HCC 組織中的表達(dá)

為了探究CDC45 在HCC 的進(jìn)展中的作用。本研究中，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)90 例胰腺癌組織中的CDC45 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CDC45 主要表達(dá)在細(xì)胞核。根據(jù)染色強(qiáng)度，將患者分為CDC45 高表達(dá)組和CDC45 低表達(dá)組(圖6A)。分組后發(fā)現(xiàn)，CDC45 在癌旁正常組織中的表達(dá)量顯著降低（圖6B）。上述結(jié)果提示，CDC45 在HCC 的疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

圖6 肝細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）的免疫組化結(jié)果

2.5 CDC45 表達(dá)水平與HCC 患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了闡明CDC45 在HCC 進(jìn)展中的作用，分析比較了CDC45 高表達(dá)組和CDC45 低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和AFP 水平。分析結(jié)果表明，CDC45 高低表達(dá)與HCC 患者的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)（P=0.003）和腫瘤大小（P=0.003）的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與年齡、性別、AFP 水平的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（表1）

表1 細(xì)胞分化周期蛋白45（CDC45）蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

HCC 是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因[16]。超聲作為一項(xiàng)有效的早期篩查技術(shù)，對(duì)HCC 有著較高的檢出率。但AFP 作為HCC 的生物標(biāo)志物，其特異性和敏感性低，對(duì)于體積較小的腫瘤或極早期的HCC，仍然效果不佳。近年來(lái)的大量研究結(jié)果表明，CDC45在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，如食管癌、宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌、非小細(xì)胞肺癌等，尤其在直腸癌中更加明顯。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。本研究中，利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)了CDC45在甲狀腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、類癌、尿路上皮癌中高度表達(dá)。此外，通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析了CDC45 的mRNA 在HCC 組織與癌旁正常組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HCC 組織中CDC45 的mRNA表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。進(jìn)一步，分析了CDC45 表達(dá)量與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示CDC45 表達(dá)量越高，HCC 患者的預(yù)后情況越差。為探明其中的原因，本研究中搜集了90 例HCC 患者的HCC 組織并對(duì)其進(jìn)行了免疫組化染色。結(jié)果顯示，HCC 組織中的CDC45 表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的結(jié)論。Pollok 等[9]的研究結(jié)果表明，人類癌癥衍生細(xì)胞中的CDC45 水平始終較高，CDC45 的表達(dá)與增殖細(xì)胞群緊密相關(guān)，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。因此推測(cè)CDC45 與HCC 腫瘤的大小、癌結(jié)節(jié)數(shù)有關(guān)。本研究中，通過(guò)分析CDC45 表達(dá)水平與HCC 患者的臨床病理特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CDC45 表達(dá)水平與HCC 腫瘤大小、癌結(jié)節(jié)數(shù)的相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、AFP 水平的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

關(guān)于CDC45 在一些腫瘤中的具體作用機(jī)制及信號(hào)通路，有研究者已經(jīng)通過(guò)研究進(jìn)行了揭示。Yang 等[17]報(bào)道了熱休克蛋白家族成員DNAJA1 被E2F 轉(zhuǎn)錄因子1 激活，然后通過(guò)穩(wěn)定CDC45 來(lái)促進(jìn)細(xì)胞周期，進(jìn)而通過(guò)這個(gè)途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展，且與漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。Ke 等[14]的研究結(jié)果表明RING1 和YY1 結(jié)合蛋白（RYBP）通過(guò)下調(diào)CDC6 和CDC45 抑制食管鱗狀細(xì)胞癌增殖。但關(guān)于CDC45 在HCC 中的作用機(jī)制仍未見(jiàn)報(bào)道，這是需要進(jìn)一步探究的方向。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)、免疫組化分析等手段初步闡釋了CDC45 表達(dá)與HCC 進(jìn)展及預(yù)后之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探究CDC45 對(duì)HCC 的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)依據(jù)，也為HCC 的早期診斷、檢測(cè)以及疾病進(jìn)展期治療提供了新的思路。本組研究存在樣本量小的不足，所得結(jié)果可能存在誤差，下一步將通過(guò)構(gòu)建小鼠模型結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)一步探究CDC45對(duì)HCC 的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突