膠原蛋白縫線和膠原蛋白生物膜的生物相容性評(píng)價(jià)

石娜 張其清 牛海濤，3

1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510632；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；3暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510632

0 引 言

20 世紀(jì)50 年代初，研究者發(fā)現(xiàn)膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)為螺旋形結(jié)構(gòu)[1]。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)（約占蛋白質(zhì)總量的30%）[2]，也是含量豐富的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[3]，已成為一種比較理想的天然高分子材料[4]。人體不同部位的特殊細(xì)胞可合成膠原蛋白，如成纖維細(xì)胞負(fù)責(zé)結(jié)締組織中膠原的產(chǎn)生，成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨骼中膠原的產(chǎn)生[5]。膠原具有相對(duì)較低的免疫原性和生物降解性，故成為生物材料的天然選擇[6]。同時(shí)作為細(xì)胞外基質(zhì)成分，膠原被視為身體的內(nèi)源性成分，有利于細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、增殖和分化[7]。因此，膠原在食品、化妝品和制藥行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[8]。

早在2 000 多年前，早期的外科醫(yī)生就已使用膠原蛋白為基礎(chǔ)的材料來(lái)閉合傷口和進(jìn)行重建手術(shù)[9]。近50 年來(lái)，隨著強(qiáng)化清潔和殺菌技術(shù)的發(fā)展，膠原蛋白作為醫(yī)療產(chǎn)品才得以進(jìn)入醫(yī)學(xué)工作者的視野[10]。目前以膠原蛋白為原料的醫(yī)療產(chǎn)品有縫線、生物膜、皮膚創(chuàng)面敷料、真皮支架、化妝品等。

膠原蛋白縫線（collagen suture，CS）是以海貍鼠尾為原料，抽取尾部肌腱，經(jīng)酶處理、交聯(lián)、拋光等工藝制備而成，其主要成分為膠原蛋白。CS 可將對(duì)合的傷口邊緣重新閉合，直至傷口愈合至足以承受正常張力為止，最終被體內(nèi)的酶消化[11]。

膠原蛋白生物膜（collagen biofilm，CB）以牛跟腱為原料，疏密雙層，經(jīng)特異性蛋白酶去除末端抗原肽，大大降低了免疫原性，提高了生物相容性，并保留了Ⅰ型膠原特有的三股螺旋結(jié)構(gòu)，再經(jīng)化學(xué)交聯(lián)、冷凍干燥等工藝制備而成。CB 在慢性創(chuàng)傷的治療中發(fā)揮了重要作用，約有78.2%的慢性創(chuàng)傷使用CB[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道膠原類(lèi)創(chuàng)面敷料也已用于燒傷和糖尿病足潰瘍等創(chuàng)傷的愈合，其作用原理并非替代或促進(jìn)人膠原蛋白的形成，而是作為創(chuàng)傷與環(huán)境之間具有生物相容性的屏障[13]。

本研究旨在評(píng)價(jià)CS 和CB 的生物相容性，為其后續(xù)臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

CS 和CB（福建吉特瑞生物科技有限公司），氯化鈉注射液、甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），草酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），蘇木精-伊紅染液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

DHP-9012 恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），TS-200B 恒溫振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），NanoDrop One 超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Bio ⅡAdvance 4 生物安全柜（西班牙Telstar 公司），CX33光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）。

健康普通級(jí)雄性成年大白兔24 只，體質(zhì)量范圍2.0～2.5 kg，購(gòu)于北京富龍騰飛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)SCXK（京）2018-0009。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北方中心慢病實(shí)驗(yàn)室兔房，飼養(yǎng)溫度為18～24 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，自然光照，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的審批，批準(zhǔn)號(hào)為NHT18003。

1.2 方法

1.2.1 材料浸提液的制備

按照GB/T 16886.12 標(biāo)準(zhǔn)制備材料浸提液。分別將CS（浸提比例為1 根/ml）和CB（浸提比例為6 cm2/ml）置于浸提介質(zhì)（氯化鈉注射液）中，37 ℃振蕩（72±2）h，得到對(duì)應(yīng)的浸提液。

1.2.2 熱原實(shí)驗(yàn)

取健康成年大白兔6 只，每種材料3 只。將兔置于固定器內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前30 min 測(cè)體溫2 次，將肛門(mén)體溫計(jì)插入兔肛門(mén)（深度約6 cm）測(cè)溫，每只兔每次測(cè)溫時(shí)間至少2 min，兩次體溫之差≤0.7 ℃即符合要求，以這兩次體溫的均值作為該兔的正常體溫。于測(cè)定正常體溫15 min 內(nèi)自兔耳緣靜脈緩慢注射38 ℃預(yù)熱的材料浸提液（1.0～2.0 ml/kg 體質(zhì)量），注射完畢后每隔1 h 測(cè)體溫1 次，共測(cè)3 次，以3 次體溫中的最高體溫減去正常體溫即為該兔的體溫升溫值。若3 只兔中有1 只兔的體溫升溫值≥0.6 ℃，或3 只兔的體溫升溫總和≥1.4 ℃，則另取5 只兔復(fù)試，方法同上。

1.2.3 皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

取健康成年大白兔3 只，背部斑貼區(qū)備皮。分別取0.5 ml CS 浸提液、CB 浸提液、體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醛（陽(yáng)性對(duì)照）、氯化鈉注射液（陰性對(duì)照）將紗布浸濕，斑貼于實(shí)驗(yàn)部位。兔背部左側(cè)分別斑貼CS浸提液浸濕的紗布及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照紗布；右側(cè)分別斑貼CB 浸提液浸濕的紗布及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照紗布。斑貼4 h 后去除紗布，并做好標(biāo)記。去除后24、48、72 h 觀察皮膚反應(yīng)，按表1 進(jìn)行評(píng)分。刺激反應(yīng)總評(píng)定：0.0～0.4 分為極輕微刺激；0.5～1.9 分為輕度刺激；2.0～4.9 分為中度刺激；5.0～8.0 分為重度刺激。

表1 皮膚刺激反應(yīng)記分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 溶血實(shí)驗(yàn)

選取健康成年大白兔1 只，取新鮮兔血20 ml，加入質(zhì)量濃度為20 g/L 的草酸鉀1 ml，制備新鮮抗凝兔血。取新鮮抗凝兔血8 ml，加入氯化鈉注射液10 ml 稀釋備用。取CS 浸提液、CB 浸提液、蒸餾水（陽(yáng)性對(duì)照）、氯化鈉注射液（陰性對(duì)照）各10 ml于試管內(nèi)，平行操作3 份；將試管置于恒溫水浴中37 ℃保溫30 min，每管加入0.2 ml 稀釋的新鮮抗凝兔血，輕輕混勻，繼續(xù)37 ℃水浴60 min；750×g離心5 min，吸取上清液入比色皿內(nèi)，采用分光光度計(jì)檢測(cè)545 nm 處的吸光度值。計(jì)算各材料的溶血率，當(dāng)陰性對(duì)照組的吸光度值＜0.03，陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值為0.8±0.3 時(shí)實(shí)驗(yàn)有效；材料的溶血率≤5%時(shí)，表明材料不具有溶血作用。

1.2.5 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)

選取健康成年大白兔3 只，去除背部脊柱兩側(cè)約10 cm×5 cm 面積的被毛。在每只兔的脊柱左側(cè)去毛區(qū)前2 個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 ml 體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醛（陽(yáng)性對(duì)照），中間2 個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 ml CS 浸提液，后2 個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 ml 氯化鈉注射液（陰性對(duì)照）；同一只兔脊柱右側(cè)去毛區(qū)前2 個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 ml 體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醛（陽(yáng)性對(duì)照），中間2 個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 ml CB 浸提液，后2 個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 ml 氯化鈉注射液（陰性對(duì)照），相鄰2 個(gè)注射點(diǎn)間隔2 cm，平行注射3 只兔。注射后24、48、72 h，觀察注射局部及周?chē)つw組織是否有紅斑、水腫反應(yīng)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（表1）記分。

1.2.6 肌肉埋植實(shí)驗(yàn)

取健康成年大白兔24 只，去除背部脊柱兩側(cè)約10 cm×20 cm 面積的被毛。在兔脊柱兩側(cè)0.25 cm處等距離各選4 個(gè)植入點(diǎn)，相鄰2 個(gè)植入點(diǎn)間隔2cm。將載有樣品（長(zhǎng)1.0 cm，寬0.3 cm，邊緣光滑）的穿刺針與表面皮膚呈45°角插入肌肉，當(dāng)回抽穿刺針時(shí)，用細(xì)探針將樣品留于肌肉中。兔脊柱一側(cè)植入樣品，另一側(cè)植入對(duì)照品，以醫(yī)用硅橡膠材料作為陽(yáng)性對(duì)照。每種樣品每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行埋植3 只動(dòng)物，植入完成后注射適量青鏈霉素防止感染，觀察動(dòng)物狀態(tài)及樣品植入點(diǎn)周?chē)闆r。

分別于植入后1、6、12、26 周處死動(dòng)物，取出脊柱兩側(cè)肌肉，切取包裹樣品周?chē)?.5～1.0 cm 的肌肉組織，然后置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定。肌肉組織標(biāo)本經(jīng)修整、包埋、切片等步驟后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，比較樣品與對(duì)照品周?chē)慕M織反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，平行測(cè)量數(shù)據(jù)采用平行測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析方法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熱原實(shí)驗(yàn)

由表2 可知，分別注射CS 和CB 浸提液后，每組兔的體溫升溫值均低于0.6 ℃，且體溫升溫總和均低于1.4 ℃，提示這兩種材料符合熱原檢查要求，熱原實(shí)驗(yàn)合格。

表2 兔耳緣靜脈注射材料浸提液后的體溫變化

2.2 皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

分別將浸有CS 和CB 浸提液的紗布進(jìn)行局部斑貼，去除貼敷物后24、48、72 h，觀察可見(jiàn)貼敷部位均無(wú)紅斑和水腫反應(yīng)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分，結(jié)果顯示CS 和CB 的刺激反應(yīng)均為0 分（表3），認(rèn)為這兩種材料的皮膚刺激實(shí)驗(yàn)合格。

表3 兔局部斑貼材料浸提液浸潤(rùn)紗布后不同時(shí)間的皮膚刺激評(píng)分

2.3 溶血實(shí)驗(yàn)

由表4 可知，陰性對(duì)照組的吸光度值為-0.079±0.006（＜0.03），陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值為0.948±0.012（在0.8±0.3 范圍內(nèi)），表明實(shí)驗(yàn)有效。CS 和CB的溶血率分別為2.943%和4.127%，均＜5%，表明兩者體外實(shí)驗(yàn)均無(wú)明顯溶血反應(yīng)。

表4 材料的體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)

兔皮內(nèi)注射CS、CB 浸提液后24、48、72 h，觀察均未見(jiàn)皮膚出現(xiàn)明顯紅斑和水腫現(xiàn)象，與陰性對(duì)照組的注射部位相似，最終記分均＜1.0，為無(wú)刺激，判斷CS 和CB 這兩種材料皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)合格（表5）。72 h 評(píng)分后，進(jìn)一步計(jì)算得到動(dòng)物原發(fā)性刺激記分及原發(fā)性刺激指數(shù)均為0，表明CS 和CB 對(duì)皮膚組織無(wú)刺激反應(yīng)。

表5 兔皮內(nèi)注射材料浸提液后不同時(shí)間的皮內(nèi)刺激記分

2.5 肌肉埋植實(shí)驗(yàn)

CS 埋植后當(dāng)天動(dòng)物飲水和進(jìn)食均正常，無(wú)感染。動(dòng)物肌肉組織的蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，埋植后1 周，靠近材料處的肌肉間質(zhì)有炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、異物巨細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌肉纖維水腫增粗；埋植后6 周，肌肉間質(zhì)可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞，肌肉纖維恢復(fù)正常；埋植后12 周和26 周，肌肉間質(zhì)均未見(jiàn)淋巴細(xì)胞，靠近材料處的肌肉纖維與正常肌肉纖維無(wú)差異（圖1）。

圖1 膠原蛋白縫線埋植后兔肌肉組織的病理表現(xiàn)（蘇木精-伊紅染色，×400）

CB 埋植后當(dāng)天動(dòng)物飲水和進(jìn)食均正常，無(wú)感染。動(dòng)物肌肉組織的蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，埋植后1 周，靠近材料處的肌肉間質(zhì)有炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、較多異物巨細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌肉纖維水腫增粗；埋植后6 周，肌肉間質(zhì)可見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞，肌肉纖維恢復(fù)正常；埋植后12 周，肌肉間質(zhì)可見(jiàn)少量異物巨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；埋植后26 周，肌肉間質(zhì)未見(jiàn)淋巴細(xì)胞和異物巨細(xì)胞，靠近材料處的肌肉纖維與正常肌肉纖維無(wú)差異（圖2）。

圖2 膠原蛋白生物膜埋植后兔肌肉組織的病理表現(xiàn)（蘇木精-伊紅染色，×400）

陽(yáng)性對(duì)照組醫(yī)用硅橡膠材料埋植后10 周起動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn)感染死亡，表現(xiàn)為肌肉潰爛、流膿。動(dòng)物肌肉組織的蘇木精-伊紅染色染色結(jié)果顯示，靠近材料處的肌肉間質(zhì)始終存在大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨著時(shí)間的推移炎癥細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞數(shù)量增加（圖3）。

圖3 醫(yī)用硅橡膠材料埋植后兔肌肉組織的病理表現(xiàn)（蘇木精-伊紅染色，×400）

3 討論與結(jié)論

在某些動(dòng)物物種中，如蠑螈，其組織損傷后還能重新長(zhǎng)出原始組織（如腿或尾巴）。而在許多哺乳動(dòng)物物種中，傷口愈合會(huì)導(dǎo)致組織原有的形態(tài)和功能無(wú)法重建和修復(fù)，如疾病使哺乳動(dòng)物的牙周組織缺失，卻不能重新長(zhǎng)出牙周組織，且修復(fù)反應(yīng)還會(huì)形成瘢痕組織[14]。糖尿病患者和老年人的傷口愈合障礙更為嚴(yán)重[15]。機(jī)體可通過(guò)合成基質(zhì)和重構(gòu)細(xì)胞向創(chuàng)面遷移來(lái)恢復(fù)組織的形態(tài)和功能，但新合成的基質(zhì)致密、功能失調(diào)、高度交聯(lián)，表現(xiàn)為纖維化病變，從而影響了器官和組織[16]。因此，為減少創(chuàng)傷后修復(fù)產(chǎn)生的大量纖維化病變對(duì)患者器官和組織的影響，具有生物相容性的創(chuàng)傷后修復(fù)材料受到了醫(yī)學(xué)界的高度重視。

致熱原物質(zhì)主要包括生物材料或人工器官在制備過(guò)程中可能殘留的單體、細(xì)胞、輔助添加劑或內(nèi)毒素等[17]。致熱原物質(zhì)在植入體內(nèi)后可作用于靶細(xì)胞，促使機(jī)體產(chǎn)生熱原，作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，從而引起恒溫動(dòng)物體溫上升[18]。本研究中分別注射CS 和CB 浸提液后，每組兔的體溫升溫值均低于0.6 ℃，且體溫升溫總和均低于1.4 ℃，故認(rèn)為CS 和CB 符合熱原檢查要求，熱原實(shí)驗(yàn)合格。

皮膚刺激實(shí)驗(yàn)和皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CS 和CB 對(duì)兔皮膚均無(wú)刺激作用，這是由于這兩種材料的原料均為動(dòng)物源性膠原，與皮膚的親和性好，因此刺激性小。體外溶血實(shí)驗(yàn)是鑒定血液相容性的最基本方法之一，若材料有溶血作用，則提示該材料可能具有細(xì)胞毒性。本研究結(jié)果顯示，CS 和CB 的溶血率均＜5%，符合GB/T 16886.11-2011/ISO 10993-11:2006 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。本研究還通過(guò)肌肉埋植實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CS 和CB 埋植入兔肌肉后的刺激和毒性反應(yīng)，結(jié)果顯示這兩種材料分別埋植入肌肉后，肌肉組織耐受性良好，組織反應(yīng)不嚴(yán)重，且隨時(shí)間的推移組織反應(yīng)逐漸減輕。

生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題，生物材料進(jìn)入市場(chǎng)前均需進(jìn)行大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)其安全性和有效性[19]。本研究結(jié)果顯示，CS和CB 均無(wú)致熱性，無(wú)皮膚刺激性，無(wú)溶血作用，對(duì)組織的刺激和毒性作用小，初步證實(shí)其具有良好的生物相容性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突