土壤中頭孢噻呋的高效液相色譜檢測(cè)方法的建立

安博宇，徐向月，霍美霞，馬文瑾，王涵宇，劉振利，程古月,*，黃玲利,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(HZAU)，農(nóng)業(yè)部食品獸藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢430070)

當(dāng)今抗生素尤其是獸用抗生素對(duì)環(huán)境的污染受到了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，其存在于環(huán)境中不僅會(huì)對(duì)動(dòng)植物和微生物造成毒性，也會(huì)誘導(dǎo)環(huán)境微生物產(chǎn)生耐藥性并傳播。我國(guó)作為抗生素的使用大國(guó)，僅在2018年我國(guó)獸用抗生素使用的總量就高達(dá)29774.09噸[1]。如此大量的獸用抗生素經(jīng)過(guò)動(dòng)物體排入環(huán)境后，勢(shì)必會(huì)對(duì)土壤或水體環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[2]。頭孢噻呋(Ceftiofur)又名賽德福，是20世紀(jì)80年代由美國(guó)普強(qiáng)公司開(kāi)發(fā)并被批準(zhǔn)應(yīng)用于治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病的第三代頭孢菌素類(lèi)藥物[3-4]。由于其抗菌活性強(qiáng)，毒性較低，副作用較小，因此，成為市場(chǎng)上應(yīng)用最為廣泛的獸用頭孢菌素類(lèi)藥物。由于我國(guó)不合理用藥的現(xiàn)象比較常見(jiàn)，臨床上的病原對(duì)其耐藥性現(xiàn)象十分嚴(yán)重。因此，人們不僅要關(guān)注臨床用藥的合理規(guī)范，也要注意抗生素對(duì)環(huán)境的污染以及對(duì)環(huán)境微生物耐藥基因的誘導(dǎo)作用[5-7]。根據(jù)之前的研究，頭孢噻呋在動(dòng)物用藥后，約20%～30%的活性物質(zhì)會(huì)隨糞便和尿液排入環(huán)境[4]，這些化合物以原型藥物為主，其進(jìn)入環(huán)境后不僅會(huì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)，也會(huì)誘導(dǎo)耐藥基因的產(chǎn)生，因此，對(duì)其環(huán)境污染的研究是非常有必要的[8]。對(duì)于頭孢噻呋的檢測(cè)方法，目前研究較多的是在組織和血漿中[9-12]，而在環(huán)境樣品(糞便、堆肥、污水)中的檢測(cè)研究較少[13-16]。目前環(huán)境樣品中抗生素的檢測(cè)最常見(jiàn)的是高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。這兩種方法中HPLC-MS/MS方法具有更好的靈敏度，相比于HPLC法其儀器價(jià)格昂貴，成本較高[17]。HPLC分析方法具有應(yīng)用范圍廣，成本較低，更穩(wěn)定等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的定量分析。本研究選擇砂土、壤土、砂壤土、黏土4種不同類(lèi)型的土壤為研究對(duì)象，開(kāi)發(fā)了土壤中頭孢噻呋的定量檢測(cè)方法，以期為頭孢噻呋及其同類(lèi)藥物環(huán)境行為研究提供方法學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、耗材與試劑 Waters 2998高效液相色譜儀(配備PDA檢測(cè)器)；萬(wàn)分之一電子天平(SQP，購(gòu)自北京賽多利科學(xué)儀器有限公司)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)色譜柱；固相萃取裝置；微型渦旋振蕩器(WX-80A，購(gòu)自上海滬西分析儀器廠有限公司)；超聲波清洗機(jī)(KQ-3200，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司)；Waters Oasis HLB固相萃取柱(3cc/60 mg，Waters公司)；高速冷凍離心機(jī)(HITACHI CR21G，日立公司)；純水儀(購(gòu)自美國(guó)Milli-Q公司)；分析天平(型號(hào)AW120，購(gòu)自日本SHIMADZU公司)。

頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥89.5%)，購(gòu)自湖北賽因斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，100 mg；硼酸鈉；氯化鉀；甲醇和乙腈均為HPLC級(jí)；三氟乙酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及提取液的配置 準(zhǔn)確稱取頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品11.2 mg，溶解在2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入超純水定容至10 mL，配置成濃度為1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

硼酸緩沖液：稱取3.7 g氯化鉀和19 g四硼酸鈉，用超純水溶解并定容至1 L(pH為9)。

1.3 供試土壤樣品的采集及理化性質(zhì) 土壤采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻田邊土壤，黏土采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻田池塘邊土壤，砂壤土采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山上，砂土采自武漢白沙洲大橋附近。以上土壤使用多點(diǎn)采樣法從表層土壤頂部0～20 cm收集三個(gè)子樣本混合在一起得到復(fù)合樣本，自然風(fēng)干。其中一部分過(guò)2 mm篩用于土壤實(shí)驗(yàn)，另一部分過(guò)1 mm篩用于測(cè)定土壤的基本理化形式。土壤顆粒組成用比重法測(cè)定，陽(yáng)離子交換量(CEC)使用乙酸銨法測(cè)定，有機(jī)質(zhì)含量(OC)使用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，土壤pH使用電位法測(cè)定(水土比=5∶1)。上述土壤經(jīng)檢測(cè)不含目標(biāo)抗生素。四種土壤的相應(yīng)理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 四種土壤的理化性質(zhì)

1.4 樣品提取與凈化 稱取土壤1 g和0.15 g Na2EDTA于10 mL離心管中，加入硼酸緩沖液4 mL，渦旋2 min混勻，超聲10 min，10000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一只10 mL離心管中。再分別加相同量提取液重復(fù)提取一次。進(jìn)行固相萃取，取固相萃取HLB柱(60 mg，3cc)依次用3 mL 甲醇、3 mL 超純水活化。樣品過(guò)柱，過(guò)完后用2 mL超純水淋洗，真空條件下干燥5 min，再用3 mL甲醇洗脫兩次，收集洗脫液，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑? mL初始流動(dòng)相[0.1%三氟乙酸：乙腈=4∶1(V∶V)]復(fù)溶，溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，HPLC分析。

1.5 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱(4.6×250 mm)；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；波長(zhǎng)295 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%三氟乙酸，B相為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 液相色譜梯度洗脫比例

1.6 方法性能考核

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)頭孢噻呋在環(huán)境中可能出現(xiàn)的濃度，將標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍設(shè)置為0.05～10 μg/mL，取4 mL離心管數(shù)只配置成含有頭孢噻呋濃度為0.05、0.2、1、5、10 μg/mL的藥液1 mL，取20 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)，繪制加藥濃度與峰面積的曲線圖，考察方法的線性關(guān)系，并得出回歸方程。

1.6.2 準(zhǔn)確度和精密度 1 g空白土壤樣品分別添加0.05、0.1、1 μg/g的頭孢噻呋，作為低、中、高濃度，按照樣品前處理的步驟處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，通過(guò)單點(diǎn)校正法進(jìn)行回收率的測(cè)定，作為準(zhǔn)確度考核結(jié)果。這些樣品每天重復(fù)走樣三次，連續(xù)測(cè)定3 d，得出日內(nèi)和日間變異系數(shù)作為該方法的精密度考核。

1.6.3 檢測(cè)限和定量限 1 g空白土壤中加入一系列低濃度頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度分別為0.2、0.1、0.05、0.04、0.03 μg/g，每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣品，按照上述樣品前處理步驟處理后進(jìn)行檢測(cè)，以S/N=3時(shí)的最低藥物濃度作為該方法的檢測(cè)限，以S/N=10時(shí)的最低藥物濃度作為該方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍與檢測(cè)限和定量限 目標(biāo)物質(zhì)在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=87.545x+4123.6，相關(guān)系數(shù)r2為0.9998。按照信噪比為3時(shí)的最低濃度作為檢測(cè)限，信噪比為10時(shí)的最低濃度作為定量限，得到四種土壤的檢測(cè)限為30 μg/kg，定量限為50 μg/kg(圖1)。

圖1 頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 根據(jù)1.6.2項(xiàng)中的步驟得到回收率和日間變異系數(shù)作為方法的準(zhǔn)確度和精密度，準(zhǔn)確度范圍是70.8%～85.6%，日內(nèi)變異系數(shù)范圍是3.8%～9.8%，日間變異系數(shù)范圍是4.1%～10.6%，相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。頭孢噻呋在四種土壤的添加色譜圖見(jiàn)圖2。

表3 四種土壤中頭孢噻呋的回收率、日內(nèi)和日間變異系數(shù)

圖2 壤土、黏土、砂壤土、砂土100 μg/L添加提取色譜圖(A:壤土B:黏土C:沙壤土D:砂土)

2.3 提取pH的選擇 本研究同時(shí)比較了不同pH緩沖液條件下的提取效果(磷酸鹽緩沖液pH=3、4、5、6、7以及硼酸鹽緩沖液pH=9、11)。根據(jù)結(jié)果pH=3、4、5、6、7時(shí)回收率最高只有60%左右,而pH=11時(shí)無(wú)法將頭孢噻呋提取出來(lái)，當(dāng)pH=9時(shí)提取效果最好,回收率可達(dá)70%以上(圖3)。

圖3 不同提取pH條件的回收率

2.4 提取試劑的選擇 本研究除了硼酸緩沖液之外，還使用了pH為4的磷酸緩沖液乙腈不同比例混合提取液(V∶V=1∶1、1∶2、2∶1)、超純水、乙腈水(V∶V=4∶1)，結(jié)果表明，硼酸緩沖液能夠有效的將頭孢噻呋從土壤中提取出來(lái)且回收率最高。最終選擇pH=9的硼酸緩沖液作為提取試劑，各個(gè)提取試劑的回收率如圖4所示。

圖4 不同提取試劑的回收率

2.5 洗脫條件的選擇 同時(shí)對(duì)比了甲醇、乙腈、乙酸乙酯三種常用的洗脫試劑，結(jié)果表明甲醇的洗脫效果最好，而乙腈和乙酸乙酯無(wú)法將頭孢噻呋洗脫下來(lái)，檢測(cè)不到色譜峰，最終選擇甲醇作為最終的洗脫試劑。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取試劑的選擇 對(duì)于土壤基質(zhì)來(lái)說(shuō)，主要干擾檢測(cè)的因素為金屬離子和土壤的吸附能力，通過(guò)加入EDTA來(lái)有效的降低金屬離子對(duì)檢測(cè)的干擾，堿性緩沖液能夠更好的去除土壤對(duì)酸性藥物的吸附作用[18,13]。目前國(guó)內(nèi)外研究中，提取土壤中的獸用抗生素大多使用乙腈和緩沖液以一定比例混合作為提取試劑[19]，本實(shí)驗(yàn)中也嘗試了此方法，但是提取的上清液均出現(xiàn)一定渾濁，并且回收率也比較低，原因可能是乙腈雖然具有較強(qiáng)的提取能力，但其會(huì)溶解土壤中的一些親脂性物質(zhì)，對(duì)分析造成干擾。在嘗試了幾種提取試劑后最終選取pH=9的硼酸緩沖液作為提取試劑。本文中黏土的回收率相較于其他三種土壤存在差異，黏土的有機(jī)質(zhì)含量明顯高于另外三種土壤，對(duì)于頭孢噻呋來(lái)說(shuō)，其在這種土壤中吸附量更大，分子之間的吸附相較于另外幾種土壤不易破壞，因此，回收率會(huì)比另外三種土壤低一些，但也可以達(dá)到檢測(cè)要求。

3.2 提取pH條件的選擇 在不同提取pH條件下可以發(fā)現(xiàn)在pH=9使回收率達(dá)到70%以上，而pH在偏中性或者強(qiáng)堿性條件下回收率達(dá)不到要求，而強(qiáng)酸性條件下回收率可以達(dá)到60%以上但不如弱堿性環(huán)境回收率高，原因可能是酸性條件下無(wú)法破壞土壤和頭孢噻呋之間的吸附作用，堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)由于頭孢噻呋本身pKa等于2.5～3.1，屬于強(qiáng)酸性藥物，在堿性較強(qiáng)(pH>11)的環(huán)境下相對(duì)不穩(wěn)定[4]，其會(huì)在很快的時(shí)間(幾小時(shí))內(nèi)達(dá)到降解半衰期[20-22]。

3.3 洗脫條件的選擇 對(duì)于洗脫試劑來(lái)講，由于本實(shí)驗(yàn)中使用的是HLB小柱，為親脂親水平衡柱，一般在洗脫時(shí)不需要調(diào)pH，三種洗脫試劑中甲醇的洗脫效果最好，可能是由于頭孢噻呋的極性與甲醇的極性相似，而乙酸乙酯和乙腈的極性均低于甲醇，無(wú)法將藥物完全洗脫下來(lái)，因此，最終選擇甲醇作為洗脫試劑。

本研究建立了一種高效液相色譜法檢測(cè)土壤中頭孢噻呋的方法，采用pH=9的硼酸緩沖液提取，經(jīng)HLB小柱凈化后進(jìn)行分析。該方法專(zhuān)屬性較強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、成本較低、回收率和精密度均可達(dá)到檢測(cè)要求，可以用來(lái)檢測(cè)四種土壤中的頭孢噻呋含量，為今后頭孢噻呋的環(huán)境行為研究提供了方法學(xué)借鑒。