昆蟲(chóng)腸道菌群的功能及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

呂文祥，劉麗娟，公茂慶

山東省寄生蟲(chóng)病防治研究所，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 濟(jì)寧 272033

昆蟲(chóng)腸道菌群是昆蟲(chóng)消化道內(nèi)所有細(xì)菌群落的統(tǒng)稱(chēng)，一般可分為有益菌、有害菌和中性菌[1-2]。以往研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)特殊的腸道結(jié)構(gòu)豐富了腸道菌群的多樣性，同一昆蟲(chóng)不同腸道部位、同一昆蟲(chóng)在不同發(fā)育階段的腸道菌群都有所不同[3-7]，不同種類(lèi)昆蟲(chóng)的腸道優(yōu)勢(shì)菌群也不同[4,8]，且受飲食[9-11]、發(fā)育階段[7,12]、溫度[13-14]等多種因素的影響。昆蟲(chóng)攜帶多種腸道微生物群落，這些微生物在宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝、消化吸收、免疫防御以及提高宿主抗藥性方面發(fā)揮著重要作用[15-16]；同時(shí)腸道微生物穩(wěn)態(tài)的維持有利于宿主昆蟲(chóng)的正常生理活動(dòng)和各項(xiàng)生命活動(dòng)的進(jìn)行[17]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在昆蟲(chóng)腸道菌群的研究中存在諸多弊端，阻礙了腸道菌群的深入研究[18]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、宏基因組學(xué)、生物信息學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，昆蟲(chóng)腸道菌群的研究成了熱點(diǎn)。本文對(duì)昆蟲(chóng)腸道菌群對(duì)宿主的作用以及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行以下綜述。

1 昆蟲(chóng)腸道菌群對(duì)宿主的作用

1.1營(yíng)養(yǎng)代謝 昆蟲(chóng)腸道菌群的主要作用是營(yíng)養(yǎng)代謝，其次是消化和解毒[19]。腸道菌群參與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝的一個(gè)重要方式是協(xié)助消化食物[20]。常見(jiàn)的昆蟲(chóng)如蝗蟲(chóng)、蜜蜂、蚊蟲(chóng)等，其腸道菌群可分泌多種消化酶?；认x(chóng)腸道菌群具有較高的腸道纖維素分解活性，并含有多種能夠分泌纖維素酶的微生物[21];蜜蜂從花粉和花蜜中獲得碳水化合物、氨基酸和糖類(lèi)物質(zhì)，腸道微生物的酶可以促進(jìn)這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解和發(fā)酵，生成短鏈脂肪酸以供宿主利用[22-23]；在蚊蟲(chóng)中，雌蚊和雄蚊攝食植物花蜜后，一部分被直接消化吸收，另一部分被輸送到腸道，在腸道菌群的作用下，轉(zhuǎn)化為宿主和腸道微生物共同的能量來(lái)源[24]。雌蚊腸道菌群還參與了血液的消化和吸收，為宿主提供發(fā)育和孵化所需的鐵和蛋白質(zhì)[25]。

腸道菌群還能通過(guò)參與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝影響宿主的攝食行為，有文獻(xiàn)報(bào)道果蠅腸道內(nèi)的細(xì)菌可以改變果蠅對(duì)營(yíng)養(yǎng)刺激的固有化學(xué)感覺(jué)反應(yīng)。研究者將果蠅卵分別接種醋酸桿菌和乳酸桿菌兩種菌群，接種醋酸桿菌的果蠅高度反感富含蛋白質(zhì)的食物，而接種乳酸桿菌的果蠅更傾向于富含碳水化合物的食物[26]。這些細(xì)菌引起宿主行為的變化可能反映了腸道菌群的代謝需求，并通過(guò)促進(jìn)腸道中氨基酸的合成來(lái)補(bǔ)充宿主的營(yíng)養(yǎng)[27]。

1.2免疫防御 昆蟲(chóng)在生長(zhǎng)發(fā)育的各階段都有可能受到細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等病原體的威脅，昆蟲(chóng)的腸道上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)來(lái)保護(hù)宿主免受病原微生物的侵害[28]。近年來(lái)研究表明，寄生在腸道內(nèi)的共棲微生物是宿主免疫的重要參與者。有研究發(fā)現(xiàn)大蠟蛾幼蟲(chóng)中腸的主要細(xì)菌群是腸球菌，腸球菌數(shù)量的增加與免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的升高成正相關(guān)[29]；另有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)飼養(yǎng)的紅棕象甲幼蟲(chóng)具有較高的酚氧化酶活性和較強(qiáng)的抗菌活性，剝離腸道細(xì)菌后紅棕象甲幼蟲(chóng)的免疫能力和存活率均顯著下降，而其與腸道微生物群重新結(jié)合則可以通過(guò)提高其免疫能力從而使其存活率上升[30]，上述研究證實(shí)了腸道共生菌對(duì)宿主有免疫刺激作用。腸道菌群對(duì)維護(hù)昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)的健康是必不可少的，同時(shí)利用腸道細(xì)菌影響昆蟲(chóng)的免疫能力也為治理害蟲(chóng)提供了新的策略。

1.3增強(qiáng)宿主抗藥性 化學(xué)殺蟲(chóng)劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)的防治，促進(jìn)了世界農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。與此同時(shí)，殺蟲(chóng)劑的過(guò)量和不規(guī)范使用導(dǎo)致害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生。昆蟲(chóng)抗藥性的機(jī)制多為降解酶上調(diào)、藥物作用靶位改變、藥物排泄增加等，而這些機(jī)制通常歸因于昆蟲(chóng)基因組的進(jìn)化[31]，但越來(lái)越多的證據(jù)表明宿主腸道微生物對(duì)殺蟲(chóng)劑的代謝可能是影響抗藥性強(qiáng)弱的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可以影響昆蟲(chóng)殺蟲(chóng)劑抗性表型的表達(dá)[32]，同時(shí)有些細(xì)菌可直接降解有機(jī)殺蟲(chóng)劑。Chen等[33]采用不同類(lèi)型的抗生素改變家蠶的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)經(jīng)多黏菌素B處理的家蠶對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑毒死蜱更敏感，研究表明腸道菌群對(duì)宿主抗藥性具有重要影響，特定種類(lèi)的細(xì)菌可以保護(hù)宿主幼蟲(chóng)免受殺蟲(chóng)劑的毒害。Dada等[34]發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)劑的種類(lèi)和暴露時(shí)間不同，成蚊腸道微生物的多樣性也會(huì)產(chǎn)生明顯差異，這表明如果持續(xù)接觸殺蟲(chóng)劑可能會(huì)選擇殺蟲(chóng)劑代謝細(xì)菌，這也可能是宿主對(duì)殺蟲(chóng)劑抵抗力不同的原因。

1.4菌群失調(diào)對(duì)宿主的危害 菌群失調(diào)是指腸道正常菌群的各個(gè)菌種之間的比例發(fā)生的改變較大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了正常范圍，使宿主處于不利狀態(tài)。有研究表明，真菌感染會(huì)顯著增加蚊蟲(chóng)腸道細(xì)菌的負(fù)荷量，減少腸道細(xì)菌的多樣性，最終導(dǎo)致蚊蟲(chóng)腸道細(xì)菌紊亂，加速了蚊蟲(chóng)的死亡[35]。蜜蜂在采蜜過(guò)程中經(jīng)常遇到有機(jī)磷除草劑草甘膦，這種除草劑會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致蜜蜂腸道菌群失調(diào)從而降低對(duì)病原體的敏感性[36]。此外，抗生素常用于預(yù)防幼蜂的細(xì)菌感染，但長(zhǎng)期使用抗生素也會(huì)引發(fā)腸道微生物的失調(diào)，增加機(jī)會(huì)性病原體的易感性而危及蜜蜂的健康[37]。

2 昆蟲(chóng)腸道菌群的檢測(cè)方法

2.1傳統(tǒng)培養(yǎng)法 傳統(tǒng)培養(yǎng)法是利用鑒定性或選擇性培養(yǎng)基對(duì)昆蟲(chóng)的腸道菌群進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，結(jié)合細(xì)菌個(gè)體、菌落以及次生代謝產(chǎn)物的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)和生化學(xué)特征等進(jìn)行種類(lèi)鑒定[8,18]。分離培養(yǎng)法是細(xì)菌學(xué)研究中最基本的方法，是觀察細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖特點(diǎn)和獲得純培養(yǎng)物的必要手段[38]，該法檢測(cè)成本低，設(shè)備要求不高[39]。但傳統(tǒng)的培養(yǎng)法受到很多條件的限制，許多腸道細(xì)菌無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)獲得，不能系統(tǒng)揭示昆蟲(chóng)腸道菌群的特征。

2.2分子生物學(xué)技術(shù) 分子生物學(xué)是通過(guò)研究生物大分子(核酸、蛋白質(zhì)等)的結(jié)構(gòu)和功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的學(xué)科。分子生物學(xué)技術(shù)將遺傳性疾病和病原體的檢測(cè)、診斷、治療等方面的研究提高到了基因分子水平，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)周期，降低了實(shí)驗(yàn)成本[40-41]。分子生物學(xué)的發(fā)展為昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌的研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)，人們對(duì)昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌的研究逐漸深入到微觀水平，由細(xì)菌群落到細(xì)菌個(gè)體，再到細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)的分子水平。

2.2.1DNA提取 DNA提取是昆蟲(chóng)腸道菌群研究的常規(guī)步驟，是分子生物學(xué)技術(shù)的前提[42]。DNA提取通常是從昆蟲(chóng)的腸道菌群中釋放DNA，抑制核酸酶，去除蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)。DNA提取方法通常有十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)、酚抽提法、鹽析法、十二烷基硫酸鈉法(SDS)、醋酸鉀法、商業(yè)試劑盒等[43]。不同種類(lèi)的昆蟲(chóng)其腸道菌群存在差異，應(yīng)選擇合適的DNA提取方法，CTAB法和SDS法是提取各種生物DNA的常用方法[44]，這些方法價(jià)格相對(duì)便宜，但操作繁瑣比較費(fèi)時(shí)。目前，方便、快捷的商業(yè)試劑盒更易于接受，受到廣泛關(guān)注。

2.2.2變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) DGGE是利用堿基序列所決定的DNA片段溶解度或變形度的區(qū)別，將野生型和突變型DNA片段分離的技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落的多樣性分析。Zhang等[45]利用DGGE技術(shù)對(duì)草蠹蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中腸的細(xì)菌群落在不同的地區(qū)變化很大，并且受到飼喂條件的影響，后腸的細(xì)菌群落更具多樣性且比較穩(wěn)定，受外界環(huán)境影響較小。Milanovi等[46]對(duì)來(lái)自比利時(shí)、荷蘭和泰國(guó)的食用性粉蟲(chóng)和蚱蜢進(jìn)行PCR-DGGE分析，結(jié)果顯示比利時(shí)粉蟲(chóng)和荷蘭蚱蜢的優(yōu)勢(shì)菌種為葡萄球菌屬，而泰國(guó)粉蟲(chóng)和蚱蜢的優(yōu)勢(shì)菌種為芽孢桿菌屬。Bigiotti等[47]利用PCR-DGGE技術(shù)證明了在共同飼養(yǎng)的情況下，野外果蠅體內(nèi)的共生菌可水平轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室果蠅體內(nèi)。DGGE雖然使用起來(lái)簡(jiǎn)單快速，但它也存在一些局限性，如要求DNA片段大小在100～500 bp，并且只能反映優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2.3蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)細(xì)胞、組織或生物體的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，包括蛋白質(zhì)在任何階段的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和修飾等[48]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)腸道菌群的蛋白質(zhì)組成和差異表達(dá)，可進(jìn)一步推測(cè)腸道菌群的作用。Colvin等[49]利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)從致倦庫(kù)蚊死亡幼蟲(chóng)中腸分離的耐久腸球菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明這種腸球菌對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)具有顯著的毒性。在過(guò)去的幾年里，蛋白質(zhì)組學(xué)的各項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在各類(lèi)真核生物和原核生物蛋白質(zhì)的純化、分析、表征、定量、序列和結(jié)構(gòu)分析以及生物信息學(xué)分析方面取得了成功。但是，蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)技術(shù)人員、設(shè)備軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)的要求較高，大大增加了使用成本，這也限制了蛋白質(zhì)組學(xué)的廣泛使用[50]。

2.3宏基因組學(xué) 宏基因組學(xué)又稱(chēng)元基因組學(xué)或微生物環(huán)境基因組學(xué)，通過(guò)提取昆蟲(chóng)腸道全部微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，分析昆蟲(chóng)腸道菌群的遺傳組成和功能。基于測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)分析速度快、應(yīng)用范圍廣、克服了部分微生物難以甚至不能用傳統(tǒng)分離法在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的局限性、揭示新的基因和微生物途徑，使我們更全面地了解微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能[51-53]。

高通量測(cè)序技術(shù)，又稱(chēng)“下一代”測(cè)序技術(shù)[54-55]，可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過(guò)數(shù)年的開(kāi)發(fā)與改進(jìn)，高通量測(cè)序技術(shù)已由一代測(cè)序技術(shù)發(fā)展到三代測(cè)序技術(shù)，一代測(cè)序技術(shù)又稱(chēng)Sanger測(cè)序，由于成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低等缺點(diǎn)現(xiàn)在通常不再使用，現(xiàn)在廣泛使用的是二代測(cè)序技術(shù)和三代測(cè)序技術(shù)。常見(jiàn)的二代測(cè)序技術(shù)有Illumina公司的Solexa、Hiseq技術(shù)，Roche公司的454技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。三代測(cè)序[56]通常指單分子測(cè)序技術(shù)，三代測(cè)序具有運(yùn)行速度快、不需要模板擴(kuò)增、可以直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)等特點(diǎn)，它彌補(bǔ)了二代測(cè)序讀長(zhǎng)較短、易受GC含量影響等缺點(diǎn)，已在小型基因組從頭測(cè)序和組裝中有較多應(yīng)用。目前，在昆蟲(chóng)腸道菌群研究中應(yīng)用較為廣泛的是以二代測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的16S rDNA測(cè)序技術(shù)。Fu等[57]采用16S rDNA測(cè)序法對(duì)崇明線蟲(chóng)的幼體腸道細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果表明蒼白桿菌屬數(shù)量最多，其次為芽孢桿菌屬。Razia[58]等用16S rDNA測(cè)序技術(shù)從被侵染的昆蟲(chóng)尸體中分離鑒定了3種不同種類(lèi)的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)非共生細(xì)菌。但16S rDNA也有缺點(diǎn)，對(duì)于種間差異較小的菌種，還需要同時(shí)借助其他方法和技術(shù)進(jìn)行鑒定。

2.4生物信息學(xué) 生物信息學(xué)將計(jì)算機(jī)作為工具對(duì)各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析，涉及信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、應(yīng)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科，可進(jìn)行基因識(shí)別分析、基因序列比對(duì)、蛋白比對(duì)、蛋白功能注釋、蛋白功能富集等。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等在昆蟲(chóng)研究中的應(yīng)用和發(fā)展[59]，傳統(tǒng)的生物學(xué)技術(shù)無(wú)法處理龐大的數(shù)據(jù)，因此生物信息學(xué)在昆蟲(chóng)學(xué)研究中的作用越來(lái)越重要。生物信息學(xué)的發(fā)展依賴(lài)各種數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建，在昆蟲(chóng)腸道菌群的研究中，首先對(duì)昆蟲(chóng)腸道菌群的16S rRNA測(cè)序，然后選擇特定的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以此對(duì)菌種進(jìn)行鑒定和分析。

3 總結(jié)與展望

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了特殊的腸道結(jié)構(gòu)，這為細(xì)菌的定殖提供了合適的場(chǎng)所。腸道菌群與宿主互利共生，在宿主的生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，宿主的消化吸收、營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫防御等都離不開(kāi)腸道菌群的作用。同時(shí)，宿主的飲食、生存環(huán)境、免疫力等也會(huì)影響腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。

過(guò)去的研究方法主要以分離培養(yǎng)法為主，隨著如分子生物學(xué)、宏基因組學(xué)、生物信息學(xué)等一些新技術(shù)的出現(xiàn)，昆蟲(chóng)腸道菌群的研究進(jìn)一步深入。此外，昆蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物數(shù)量龐大、種類(lèi)豐富，且受多種因素的影響，而新技術(shù)本身也有一定的局限性，因此聯(lián)合使用不同的方法和技術(shù)對(duì)昆蟲(chóng)腸道菌群進(jìn)行研究將成為今后的發(fā)展趨勢(shì)。盡管大部分昆蟲(chóng)腸道菌群的功能現(xiàn)在還不清楚，但相信未來(lái)會(huì)有更為先進(jìn)的技術(shù)出現(xiàn)，更多的細(xì)菌及其功能會(huì)被研究發(fā)現(xiàn)，可為害蟲(chóng)治理提供新策略，從而減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用。