曲霉型豆豉發(fā)酵階段細(xì)菌群落的演替及其與環(huán)境因子的關(guān)系

趙文鵬，李 浩，楊慧林，王筱蘭

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

豆豉作為一種我國(guó)特有的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，通過(guò)微生物發(fā)酵，較好地保留了大豆原有的營(yíng)養(yǎng)，也衍生出一定的藥用價(jià)值，并賦予豆豉獨(dú)特的風(fēng)味[1]。豆豉大體可分為霉菌型及細(xì)菌型兩類，其中霉菌型豆豉的發(fā)酵過(guò)程分為制曲及（后）發(fā)酵兩階段，依據(jù)制曲過(guò)程的優(yōu)勢(shì)微生物劃為毛霉型、曲霉型和根霉型[2]。我國(guó)南方常見(jiàn)的曲霉型豆豉的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝往往以開(kāi)放式制曲及長(zhǎng)時(shí)間后發(fā)酵為主要特點(diǎn)，整體上屬于半開(kāi)放式發(fā)酵過(guò)程，由此造成在不同地域環(huán)境下即使采用同樣的原料及工藝，豆豉微生物群落結(jié)構(gòu)也不完全相同，進(jìn)一步體現(xiàn)為豆豉風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)的差異。顯然，若在明確豆豉發(fā)酵中核心微生物群的同時(shí)，能將理化因子對(duì)核心微生物的影響予以量化，將更有助于理解豆豉發(fā)酵過(guò)程微生物的演替規(guī)律，也可為豆豉品質(zhì)的定向調(diào)控提供一定的理論支撐。

近年來(lái)測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，以16S rRNA高通量測(cè)序[3]和宏基因組測(cè)序[4]為代表的研究策略已較為成熟，其在發(fā)酵食品領(lǐng)域主要用于分析發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及核心功能微生物[5-6]，如白酒[7-8]、泡菜[9-10]、豆豉[11-12]、食醋[13-14]和醬油[15]等。以往豆豉中的微生物多樣性研究主要關(guān)注不同產(chǎn)地豆豉微生物結(jié)構(gòu)差異的比較，少數(shù)研究則闡明了同種豆豉不同階段微生物多樣性的演替，如石聰?shù)萚16]利用454測(cè)序技術(shù)對(duì)瀏陽(yáng)豆豉3階段的真菌及細(xì)菌分布特點(diǎn)進(jìn)行了報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室也利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)曲霉型豆豉9 個(gè)階段的微生物菌群演替進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)相較于制曲階段的微生物多樣性單一，發(fā)酵階段細(xì)菌多樣性變化顯著[12]。不難發(fā)現(xiàn)，目前曲霉型豆豉的研究熱點(diǎn)在于利用高通量測(cè)序技術(shù)挖掘與豆豉品質(zhì)密切相關(guān)微生物資源，解析發(fā)酵過(guò)程中曲霉型豆豉微生物群落動(dòng)態(tài)變化，但針對(duì)發(fā)酵理化因子與曲霉型豆豉微生物群落演變關(guān)聯(lián)性研究鮮有報(bào)道，與此同時(shí)，已有研究者依托高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)某些發(fā)酵食品微生物群落演變的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了報(bào)道[17]。

為此，本研究通過(guò)采集發(fā)酵階段不同時(shí)期的曲霉型豆豉，基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)豆豉不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落組成和變化趨勢(shì)進(jìn)行系統(tǒng)比較，并結(jié)合發(fā)酵環(huán)境的理化因子進(jìn)行相關(guān)性分析，以闡明發(fā)酵環(huán)境與豆豉發(fā)酵階段細(xì)菌群落演替的內(nèi)在聯(lián)系，從而為后續(xù)優(yōu)化曲霉型豆豉的發(fā)酵工藝提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲霉型豆豉于南昌稻香園調(diào)味食品有限公司采集。以黑豆為原料蒸煮1 h后，其工藝主要包括室溫制曲（米曲霉滬釀3.042，接種量0.001 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)））7 d、人工控溫發(fā)酵（堆積自然接種1 d，拌6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽于發(fā)酵池發(fā)酵）3～4 周兩個(gè)過(guò)程，中間含洗曲步驟。本研究樣品均為洗曲后不同發(fā)酵階段的豆豉。采樣時(shí)，于發(fā)酵池3 個(gè)區(qū)域分層取樣，同一區(qū)域樣品充分混合后裝入已滅菌的自封袋，并做好標(biāo)記。分別在發(fā)酵第0、1、5、9、13、19天取樣（編號(hào)：Day0、Day1、Day5、Day9、Day13、Day19），每個(gè)發(fā)酵階段含3 個(gè)樣品，樣品采集完畢保存于冰盒并立即帶回實(shí)驗(yàn)室后，部分存于-80 ℃冰箱備用。

Soil DNA Kit與Gel Extraction Kit 美國(guó)Omega公司；其他常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；MiSeq測(cè)序儀美國(guó)Illumina公司；NanoDrop ND-2000超微量分光光度計(jì)美國(guó)Thermo Scientific公司；臺(tái)式高速離心機(jī) 生工生物工程（上海）股份有限公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 理化因子測(cè)定

1.3.1.1 溫度測(cè)定

將溫度計(jì)置于發(fā)酵池內(nèi)部測(cè)量，待溫度穩(wěn)定后讀數(shù)，多次測(cè)量發(fā)酵池的溫度，結(jié)果以平均值表示。

1.3.1.2 含水量測(cè)定

采用常壓恒重干燥法測(cè)定豆豉水分含量。取多個(gè)干凈鋁制稱量瓶，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，于100 ℃干燥1 h后取出冷卻后稱量，重復(fù)此操作至前后兩次稱量的差值不超過(guò)2 mg為質(zhì)量恒定。稱取剛?cè)』氐亩刽鶚悠?，放入質(zhì)量恒定的鋁制瓶中，稱質(zhì)量并記錄，于100 ℃加熱干燥2 h，冷卻后取出稱量，重復(fù)稱量至質(zhì)量恒定。結(jié)果以平均值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。設(shè)質(zhì)量恒定稱量瓶的質(zhì)量為M1，樣品與質(zhì)量恒定稱量瓶的質(zhì)量為M2，干燥質(zhì)量恒定的樣品與稱量瓶的質(zhì)量為M3，含水量按下式計(jì)算：

1.3.1.3 pH值測(cè)定

取3 份50 mL蒸餾水，用pH儀測(cè)定其pH值，調(diào)整測(cè)定差值不超過(guò)0.02，此為空白對(duì)照組。取豆豉樣品各2.0 g左右，破碎后加入空白組蒸餾水，攪拌均勻（30 min），靜置測(cè)定豆豉懸浮液的pH值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.1.4 總酸含量測(cè)定

采用NaOH滴定法。稱取冷凍干燥豆豉樣品各2.5 g，粉碎后放入100 mL燒杯中，加入純水充分?jǐn)嚢?0 min，定容到100 mL。取懸浮液于10 000 r/min離心10 min，收集上清液；吸取20 mL上清液，置于100 mL干凈三角瓶中，滴加2 滴酚酞試劑，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酚酞變色，并在30 s內(nèi)不變色時(shí)停止。記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗體積，計(jì)算總酸含量。

1.3.1.5 總醇含量測(cè)定

稱取冷藏的豆豉樣品100.0 g，研碎后加入純水充分?jǐn)嚢?0 min，后定容到50 mL，取懸浮液10 mL于10 000 r/min離心10 min，收集上清液；取上清液1 mL于試管中，加入2 mL重鉻酸鉀溶液，再加純水至10 mL，混合均勻后沸水浴10 min，取出冷卻至室溫；于610 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總醇含量。乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考文獻(xiàn)[18]。

1.3.1.6 還原糖含量測(cè)定

稱取冷藏豆豉樣品各10.0 g左右，研碎后加入純水充分?jǐn)嚢?0 min，后定容至100 mL，取懸浮液10 mL于10 000 r/min離心10 min，收集上清液；取上清液1 mL置于25 mL試管中，補(bǔ)水至2 mL，加1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后于沸水浴加熱5 min，取出冷卻至室溫，用純水稀釋至25 mL，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算還原糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]。

1.3.2 豆豉樣品宏基因的提取及PCR擴(kuò)增

稱取豆豉樣品各1.00 g，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液將豆豉振蕩洗滌3 次，將洗脫液用雙層紗布（已滅菌）過(guò)濾。將濾液于4 ℃離心后棄上清液，完成豆豉中微生物的收集。按照提取試劑盒說(shuō)明書操作，完成豆豉微生物宏基因的提取。提取完畢，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及超微量分光光度計(jì)評(píng)估宏基因的完整性、濃度及污染程度。

將檢測(cè)合格的宏基因樣品作為底物，采用添加標(biāo)簽的338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）及806R（5’-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3-V4保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的具體參數(shù)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，利用超微量分光光度計(jì)統(tǒng)一各樣品的DNA總量，最后將處理好的DNA樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析處理

經(jīng)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接（FLASH，version 1.2.11），質(zhì)量過(guò)濾（Trimmomatic，version 0.33），去除嵌合體（UCHIME，version 8.1），得到高質(zhì)量的Tags序列。Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，然后用Usearch（vsesion 7.0）軟件和 UCHIME 軟件過(guò)濾，剔除嵌合體得到Effective tags，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類（USEARCH，version10.0），以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU。序列經(jīng)由RDP Classifier置信度閾值為0.8（version 2.2 Silva數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)后物種分類注釋，比較分析樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)及組成[20]。利用MOTHUR軟件計(jì)算Chao 1和Shannon指數(shù)。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制UPGMA聚類樹(shù)。采用CANOCO 4.5軟件對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），細(xì)菌群落與理化因子間的相互關(guān)系進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

1.4 數(shù)據(jù)提交

本研究涉及的高通量測(cè)序的原始序列信息已提交至NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)。項(xiàng)目檢索號(hào)：SRP219928；18 個(gè)樣品檢索號(hào)：SRR10046494～SRR10046511。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲霉型豆豉宏基因提取

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間曲霉型豆豉的宏基因瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of bacterial metagenomics DNA from Aspergillus-type Douchi at various fermentation stages

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各發(fā)酵階段的宏基因主條帶大小在15 kb左右（圖1）。其中，發(fā)酵第0天、第1天的宏基因組條帶完整性較好且明亮，說(shuō)明此時(shí)微生物豐度相對(duì)較高；發(fā)酵第5天基因組條帶亮度驟降，在發(fā)酵第9～19天時(shí)，基因組條帶亮度繼續(xù)下降至幾乎消失，且拖尾嚴(yán)重。由此反映曲霉型豆豉發(fā)酵是微生物量減少的過(guò)程。

2.2 曲霉型豆豉理化因子演替規(guī)律

總醇、水分、總酸、還原糖含量和溫度是曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中的重要理化因子，發(fā)酵過(guò)程整體上可劃分為3 個(gè)階段：發(fā)酵前期（Day0與Day1）、發(fā)酵中期（Day5與Day9）和發(fā)酵后期（Day13與Day19）。發(fā)酵過(guò)程中主要理化因子變化程度普遍較大（表1），其中總醇含量由0.99 mg/g緩慢下降至0.78 mg/g；還原糖含量則是由30.10 mg/g下降至12.90 mg/g；總酸含量由5.75 mg/g上升至16.75 mg/g；含水量則由45.59%下降至36.15%；相應(yīng)的pH值由5.52下降至4.49最終穩(wěn)定在5.12；溫度波動(dòng)較大，具體表現(xiàn)為中期最高，其中Day5是發(fā)酵過(guò)程中的最高溫度（45.6 ℃）?？傮w上豆豉的水分、總醇含量、pH值和還原糖含量呈下降趨勢(shì)，總酸含量一直上升，溫度則是先升后降的趨勢(shì)。

表1 曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中豆豉理化因子變化Table 1 Variations in physicochemical properties duringAspergillus-type Douchi fermentation

2.3 曲霉型豆豉細(xì)菌α多樣性

圖2 曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落α多樣性變化Fig.2 Variation in alpha diversity of bacterial communities duringAspergillus-type Douchi fermentation

Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別體現(xiàn)微生物群落的物種多樣性和物種分布的均勻度。具體來(lái)看，豆豉細(xì)菌群落的Chao 1指數(shù)由93.27下降到70.82，又上升至95.65隨后下降至59.07，最終穩(wěn)定在90.25；Shannon指數(shù)則由1.79上升到2.44，又下降至1.23，最終穩(wěn)定在2.30（圖2）。這說(shuō)明在豆豉發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的多樣性不斷降低；均勻度總體提高。Day0與Day1相比，發(fā)酵前期豆豉細(xì)菌群落的Chao 1指數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），Shannon指數(shù)具有顯著差異（P＜0.05）；Day5與Day9相比，發(fā)酵中期的Chao 1指數(shù)具有顯著差異（P＜0.05），Shannon指數(shù)具有極顯著差異（P＜0.01）；Day13與Day19相比，發(fā)酵后期的Chao 1指數(shù)與Shannon指數(shù)均具有極顯著差異（P＜0.01）。說(shuō)明曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落組成發(fā)生了顯著變化。

2.4 曲霉型豆豉細(xì)菌群落組成

2.4.1 門水平上細(xì)菌群落組成

圖3 曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的相對(duì)豐度分布Fig.3 The distribution of bacterial community during Aspergillus-type Douchi fermentation

經(jīng)分類學(xué)注釋，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是豆豉發(fā)酵的主要優(yōu)勢(shì)門（圖3a，平均相對(duì)豐度＞1%），三者平均相對(duì)豐度分別為81.15%、10.70%和7.17%，其他菌門僅占0.45%。就各優(yōu)勢(shì)門的變化趨勢(shì)看，厚壁菌門與放線菌門的相對(duì)豐度在發(fā)酵前13 d變化均不大，其中厚壁菌門作為突出優(yōu)勢(shì)門，在發(fā)酵前13 d的相對(duì)豐度均超過(guò)70%，但在Day19迅速下降至54.08%；放線菌門也于Day19由起始10.97%下降至2.67%，與Day19新晉優(yōu)勢(shì)門即擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度（2.73%）基本相當(dāng)。對(duì)于變形菌門而言，其在前13 d的相對(duì)豐度維持在1.57%～9.95%之間，但其在Day19的相對(duì)豐度迅速上升至39.85%，這與另兩個(gè)優(yōu)勢(shì)門的變化趨勢(shì)相反。總體來(lái)看，厚壁菌門和放線菌門相對(duì)豐度呈下降的趨勢(shì)，變形菌門相對(duì)豐度卻是上升的趨勢(shì)。

2.4.2 屬水平上細(xì)菌群落組成

基于屬水平上的分類學(xué)注釋結(jié)果表明，豆豉發(fā)酵中主要菌屬數(shù)為1 0 個(gè)（圖3 b，平均相對(duì)豐度＞1%）。在Day1、Day5及Day9，單一或兩大優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度均超過(guò)80%，而在其他階段，菌屬的分布則往往更為均衡、多樣。而從特定屬在各發(fā)酵階段的分布看，各優(yōu)勢(shì)屬的豐度變化趨勢(shì)復(fù)雜。發(fā)酵前期，葡萄球菌屬（Staphylococcus）呈上升趨勢(shì)，相對(duì)豐度為67.57%～85.97%，是該時(shí)期豆豉細(xì)菌群落相對(duì)豐度最高的菌屬。此外該時(shí)期還存在芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterbacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）等。發(fā)酵中期溫度升高后，葡萄球菌屬的相對(duì)豐度大幅度降低（24.16%）；而就一些典型的乳酸細(xì)菌屬看，如乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）等，其在Day5的相對(duì)豐度分別達(dá)到21.60%、21.74%和13.50%，但在其他時(shí)期，三者僅在1%左右甚至更少。隨著發(fā)酵后期的到來(lái)，葡萄球菌屬（42.67%）和腸桿菌屬（19.53%）重新成為豆豉細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)微生物。另外，包括棒狀桿菌屬、擬諾卡氏菌屬等放線菌在各發(fā)酵階段的相對(duì)豐度也均有較大的變化。

2.5 曲霉型豆豉細(xì)菌群落分布特征

圖4 曲霉型豆豉細(xì)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)UPGMA聚類分析（a）和PCA（b）Fig.4 UPGMA cluster analysis (a) and principal component analysis (b) of bacterial community structure during Aspergillus-type Douchi fermentation

通過(guò)UPGMA聚類（圖4a），發(fā)現(xiàn)豆豉發(fā)酵前期與后期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的遺傳距離較短，且在相鄰兩階段表現(xiàn)尤為明顯；而發(fā)酵中期豆豉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的遺傳距離遠(yuǎn)大于前兩者。由此說(shuō)明發(fā)酵中期的豆豉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與前后期相比存在較大差異，發(fā)酵前期與后期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似。

由圖4b可知，PC1與P C2兩軸的累計(jì)解釋率達(dá)97.57%，其中PC1軸（59.78%）整體上能夠較好區(qū)分開(kāi)豆豉發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落，且組內(nèi)樣品的重復(fù)性較好。發(fā)酵各個(gè)時(shí)期細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)均存在一定差異。發(fā)酵前、中期（Day0～Day9），不同時(shí)間段豆豉樣品分布較為分散，表明處于前中期細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大，特別是中期細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。而從發(fā)酵后期（Day13～Day19）看，該時(shí)期樣品的聚集度很高，表明在后期豆豉菌群結(jié)構(gòu)極其相似。

2.6 曲霉型豆豉細(xì)菌群落與理化因子關(guān)聯(lián)分析

圖5 豆豉理化因子與細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的RDAFig.5 Redundancy analysis of physicochemical factors and dominant bacterial genera

理化因子關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)，二維排序軸RDA1和RDA2解釋種群與環(huán)境的累計(jì)變化率分別為37.89%和25.22%，兩軸和為63.11%（圖5），說(shuō)明RDA1和RDA2即較好地反映出豆豉細(xì)菌群落與發(fā)酵環(huán)境之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。就主要優(yōu)勢(shì)屬看，葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬與pH值、水分、還原糖和總醇含量箭頭方向基本一致，說(shuō)明這兩個(gè)屬與pH值、水分、還原糖和總醇含量存在正相關(guān)，并以芽孢桿菌屬表現(xiàn)尤為顯著；而棒狀桿菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬與溫度、pH值、水分、總醇和還原糖箭頭方向基本一致，且與溫度呈明顯正相關(guān)并以棒狀桿菌屬尤為強(qiáng)烈；腸桿菌屬則與總酸含量箭頭方向一致，兩者存在顯著正相關(guān)。

從樣品細(xì)菌群落分布看，前期豆豉細(xì)菌群落的分布主要受水分、還原糖、總醇以及pH值的影響，中后期則是總酸和溫度推動(dòng)發(fā)酵進(jìn)程。表明豆豉發(fā)酵細(xì)菌結(jié)構(gòu)的演替與發(fā)酵環(huán)境密切相關(guān)。此外，依據(jù)優(yōu)勢(shì)菌屬與理化因子相關(guān)性具體排序結(jié)果（表2），對(duì)豆豉發(fā)酵優(yōu)勢(shì)屬具有重要影響的理化因子指標(biāo)包括還原糖含量（r2=0.263，P＜0.01）、溫度（r2=0.248，P＜0.01）和pH值（r2=0.203，P＜0.01），說(shuō)明還原糖含量、溫度和pH值可能是豆豉發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落演替的主要驅(qū)動(dòng)因子。

表2 豆豉理化因子與細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的蒙特·卡羅檢驗(yàn)Table 2 Monte Carlo permutation test of physicochemical factors and dominant bacterial genera

3 討 論

傳統(tǒng)曲霉型豆豉在不同的地域和環(huán)境下因工藝不同，豆豉微生物的群落演替各異。研究人員通過(guò)對(duì)許多豆制品發(fā)酵過(guò)程中的微生物進(jìn)行可培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和高通量測(cè)序，普遍發(fā)現(xiàn)細(xì)菌是其發(fā)酵過(guò)程的主要參與者[21-23]。為此，本研究將焦點(diǎn)放在探索豆豉發(fā)酵中細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化及其與發(fā)酵環(huán)境間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。首先，從豆豉中微生物的總量看，發(fā)酵前期宏基因濃度遠(yuǎn)大于中后期，且呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明豆豉發(fā)酵總體上是微生物不斷衰亡的過(guò)程，此時(shí)豆豉中各類微生物雖在逆境（高滲、高溫、低pH值等）耐受上存在差異，但在較大的環(huán)境脅迫壓力下，各類微生物在豆豉發(fā)酵的中后期，普遍歷經(jīng)消亡、休眠或緩慢增殖的過(guò)程，這一點(diǎn)從豐富度指數(shù)整體呈下降的趨勢(shì)也得到了側(cè)面印證。

其次，從細(xì)菌群體的相對(duì)分布規(guī)律看，厚壁菌門是曲霉型豆豉發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)類群，這與之前許多研究報(bào)道均較為類似[11,24-25]；隸屬于該門的葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬等因?qū)Πl(fā)酵環(huán)境具有較好的抗逆性，在發(fā)酵食品較為常見(jiàn)[26]，這可能是促使厚壁菌門持續(xù)成為豆豉發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)類群的重要原因。具體到各屬，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程雖然細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不斷變化，尤其是發(fā)酵中期細(xì)菌菌群演替尤為劇烈，群落分布也極其不均勻，但葡萄球菌屬始終是作為發(fā)酵菌屬的核心角色，芽孢桿菌屬及棒狀桿菌屬占比也較高，三者對(duì)某些逆境（鹽濃度、氧濃度等）耐受閾值較其他許多發(fā)酵細(xì)菌更高，優(yōu)勢(shì)菌屬以絕對(duì)的豐度優(yōu)勢(shì)消耗發(fā)酵環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，間接占據(jù)了諸多其他菌屬的生存空間。由此細(xì)菌群落可能經(jīng)過(guò)環(huán)境壓力選擇趨于同化，這也是細(xì)菌群落的“自我凈化”[27]，使得中期過(guò)渡到后期的過(guò)程中豆豉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨向于穩(wěn)定。

另一方面，發(fā)酵食品作為一類人為創(chuàng)設(shè)的生境，其自身的溫度、酸堿性、有機(jī)碳和水分在很大程度上影響發(fā)酵食品微生物的生存、演替。有研究發(fā)現(xiàn)乙醇、還原糖、pH值和溫度等是大曲、白酒及黃酒發(fā)酵中菌群演替的主要驅(qū)動(dòng)力[17,28-29]。而在本研究中，曲霉型豆豉發(fā)酵在很大程度上是人為升溫、保溫、最終降溫的過(guò)程，這種溫度變化主要是人為控制因素，另外一定程度上也受細(xì)菌產(chǎn)熱和豆豉堆積的影響[30]。發(fā)酵前期適宜發(fā)酵溫度和pH值能夠?yàn)榧?xì)菌增殖提供良好的生存條件。豐富的碳源及適宜的pH值使得以葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬為代表的優(yōu)勢(shì)屬增殖，諸類優(yōu)勢(shì)屬在發(fā)酵前期微生物總量較多，代謝中較多地分泌了促進(jìn)大分子營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)分解的各類酶類（如淀粉酶、蛋白酶等），發(fā)酵初期歷經(jīng)高滲（拌鹽）、低氧（密閉）等環(huán)境的限制，營(yíng)養(yǎng)因素（如還原糖）可能也是抑制發(fā)酵菌屬快速增殖的重要原因。伴隨發(fā)酵中期溫度的驟升，葡萄球菌和芽孢桿菌屬的增殖受限。值得注意的是，此時(shí)某些放線菌如棒狀桿菌屬的相對(duì)豐度卻更高，而該菌屬在白酒發(fā)酵、醇類生產(chǎn)等高溫發(fā)酵的報(bào)道中較為常見(jiàn)[17]，側(cè)面說(shuō)明棒狀桿菌耐高溫脅迫能力相對(duì)更高。此外，相對(duì)更高的溫度及前期其他菌屬的代謝物，一定程度上使乳酸桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬等乳酸菌更具優(yōu)勢(shì)[31]，乳酸菌適應(yīng)環(huán)境同時(shí)活躍代謝產(chǎn)酸使得發(fā)酵環(huán)境pH值繼續(xù)下降，而愈加酸化的環(huán)境則可能會(huì)抑制以乳桿菌屬[32]、魏斯氏菌屬[33]為代表的乳酸菌自身生長(zhǎng)。但在發(fā)酵后期，隨著溫度的緩慢下降，增殖速度較快的葡萄球菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬在解除了顯著負(fù)相關(guān)的環(huán)境因子即高溫的限制，重新成為優(yōu)勢(shì)菌屬，并且出現(xiàn)其他菌屬如慢生桿菌屬形成新的生態(tài)平衡?？傮w上看，高溫、有機(jī)酸的累積、還原糖消耗以及菌屬競(jìng)爭(zhēng)降低豆豉細(xì)菌類群的豐富度，卻一定程度促進(jìn)群落多樣性和推動(dòng)發(fā)酵。豆豉發(fā)酵的許多菌屬，葡萄球菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬等對(duì)發(fā)酵溫度、pH值以及還原糖的變化較為敏感。因此，未來(lái)通過(guò)科學(xué)、精確地控制豆豉發(fā)酵過(guò)程中的環(huán)境因素，對(duì)不同批次豆豉保持穩(wěn)定的品質(zhì)風(fēng)味具有重要的生產(chǎn)意義。

4 結(jié) 論

曲霉型豆豉在發(fā)酵過(guò)程中，伴隨著發(fā)酵環(huán)境的變化，微生物總量逐步減少，隸屬于厚壁菌門的葡萄球菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬在發(fā)酵進(jìn)程中十分重要，雖然細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)波動(dòng)較大，但葡萄球菌屬始終為核心，而還原糖、pH值以及溫度可能是造成豆豉細(xì)菌群落演替的重要驅(qū)動(dòng)因子?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)需要，溫度可能是未來(lái)豆豉工業(yè)化生產(chǎn)的人為控制的重要因素。