鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物的制備及結(jié)構(gòu)表征

吳佳南，孫 娜,2，林松毅,2，吳汶飛,2,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

硒是人體必需的微量元素之一[1]，具有抗氧化、保護(hù)生物膜和提高機(jī)體免疫力的作用[2]。缺硒會(huì)導(dǎo)致許多疾病，如克山病等[3]。與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒能主動(dòng)穿過腸壁，人體可以有效地把硒貯存、積累在靶組織內(nèi)，供機(jī)體利用[4]。因此開發(fā)生物活性高的有機(jī)硒非常必要[5]。

新西蘭長尾鱈是新西蘭主要的經(jīng)濟(jì)魚類，年產(chǎn)量20萬 t[6]，廣泛作為水產(chǎn)品加工的原料。新西蘭長尾鱈平均大小為60～100 cm，質(zhì)量為1～3.5 kg[7]。近年來，魚肉加工業(yè)在美國、歐洲、日本、澳大利亞和中國發(fā)展迅速，由此也產(chǎn)生了副產(chǎn)物難以處理的問題，如鱈魚皮常被丟棄，不僅造成資源的浪費(fèi)，而且污染環(huán)境[6]。鱈魚皮干物質(zhì)中明膠占70%以上，是生產(chǎn)明膠的良好來源。與其他冷水魚類相比，新西蘭長尾鱈魚皮明膠具有較好的理化性能[8]。當(dāng)前，國內(nèi)外以明膠為原料制備鈣、鐵、鋅螯合肽的研究較多[9-12]，而有關(guān)明膠硒螯合肽的研究鮮有報(bào)道。目前，已有研究以無機(jī)硒為硒源，通過多肽螯合的方式制備出有機(jī)硒[13-15]。因此，以新西蘭鱈魚皮為原料，提取明膠，制備并表征肽硒復(fù)合物，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，其既能滿足人體對(duì)硒元素的需要，又能達(dá)到補(bǔ)充膠原蛋白的作用。

本研究以鱈魚皮為原料提取明膠后，經(jīng)不同種類的酶進(jìn)行酶解制備多肽，與硒離子結(jié)合制備出鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物，采用紅外、紫外、熒光、拉曼光譜和圓二色譜對(duì)肽硒結(jié)合前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，推測(cè)肽硒復(fù)合位點(diǎn)，運(yùn)用激光粒徑儀、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡和X射線衍射觀察二者形貌特征和結(jié)構(gòu)的差異。旨在為鱈魚皮資源高值化利用提供新的思路，為肽硒復(fù)合物的產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新西蘭長尾鱈魚皮 青島益和興食品有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；風(fēng)味蛋白酶丹麥諾維信公司；3,3’-二氨基聯(lián)苯胺、鹽酸、氫氧化鈉、亞硒酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XRD-7000 X射線衍射儀 日本Shimadzu公司；F-2700熒光分光光度計(jì)、LA8080氨基酸自動(dòng)分析儀、AFM550原子力顯微鏡 日本Hitachi公司；Spectrum 10傅里葉變換紅外光譜儀 珀金埃爾默公司；JSM-7800F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；J-1500圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 鱈魚皮明膠的制備

參照Hou Hu等[16]的方法將鱈魚皮剪成1 cmh 1 cm小片沖洗干凈，室溫下在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡并攪拌0.5 h，料液比為1∶6（g/mL），將非膠原蛋白成分除去后，用蒸餾水洗至中性，室溫下用0.1 mol/L HCl溶液浸泡并攪拌0.5 h，料液比為1∶6（g/mL），得到溶脹的魚皮，洗至中性。把魚皮和蒸餾水混合（1∶10，g/mL），65 ℃提取4 h，8 000hg、4 ℃離心20 min，收集上清液，凍干得到鱈魚皮明膠。

1.3.2 氨基酸組成分析

參照Sun Na等[17]方法測(cè)定氨基酸組成。20 mg明膠在110 ℃、6 mol/L HCl溶液和真空安瓿瓶中水解24 h，蒸發(fā)皿蒸干后，用0.02 mol/L HCl溶液定容至25 mL，過0.22 μm濾膜。用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析。

1.3.3 羥脯氨酸含量的測(cè)定

按照Liu Yang等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取干基樣品0.02 g于安醅瓶中，加入6 mol/L的HCl溶液3 mL，酒精噴燈密封，于烘箱130 ℃放置4 h進(jìn)行水解。冷卻后倒入燒杯中，滴1 滴甲基紅試劑，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至6.0，定容至25 mL。取1 mL上述溶液，加入1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL氯銨T，渦旋振蕩，室溫反應(yīng)10 min。加入1 mL 3.5 mol/L的高氯酸溶液，渦旋振蕩，室溫反應(yīng)10 min，加入1 mL發(fā)色劑（4 g對(duì)二甲基氨基苯甲醛、14 mL 6%高氯酸、26 mL異丙醇），振蕩，65 ℃水浴中顯色反應(yīng)20 min。冷卻30 min，560 nm波長處測(cè)量吸光度。以羥脯氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.3.4 鱈魚皮明膠的酶解工藝

參照Wu Wenfei等[11]的方法，將明膠分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶3 種酶在各自最適酶解溫度和pH值條件下水解鱈魚皮明膠120 min，酶解條件：胃蛋白酶（37 ℃，pH 2.0）、胰蛋白酶（37 ℃，pH 7.5）、風(fēng)味蛋白酶（5 0 ℃，p H 7.0），明膠質(zhì)量濃度為20 mg/mL，加酶量4%。酶解結(jié)束后，水解液在沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫，10 000hg離心20 min，收集上清液，凍干。

1.3.5 鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物的制備

參照包怡紅等[13]的方法，將0.5 mol/L的亞硒酸鈉溶液和鱈魚皮明膠多肽溶液以體積比1∶2充分混勻，調(diào)節(jié)pH值至9.0，在80 ℃水浴中反應(yīng)1 h后冷卻，4 000hg、10 min離心取上清液，加入5 倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，4 000hg、10 min離心取沉淀，無水乙醇洗滌數(shù)次后凍干，得到硒復(fù)合物粉末。

1.3.6 硒含量的測(cè)定

采用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法[19]測(cè)定硒含量。

樣品處理：稱取試樣0.1 g，加入5 mL消化液，低溫消化至樣液呈無色透明。冷卻后，轉(zhuǎn)入燒杯，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后定容到50 mL，待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：分別取5 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10 mL，置于125 mL分液漏斗中，用水稀釋成40 mL，調(diào)pH值至2.0，加入EDTA-Na2溶液2 mL，加入3,3’-二氨基聯(lián)苯胺溶液2 mL，搖勻。于暗處反應(yīng)50 min，取出，調(diào)pH值至7.0，加入10 mL甲苯，振搖2 min，靜置分層，在420 nm波長處測(cè)定甲苯層吸光度。

樣品中硒含量的測(cè)定：吸取消化處理好的樣品20 mL，置于分液漏斗中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行操作。根據(jù)樣品測(cè)得的吸光度，按式（1）計(jì)算硒含量：

式中：ρ為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相當(dāng)于硒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為甲苯萃取所得的樣品體積/mL；M為樣品質(zhì)量/g；N為用于測(cè)定的樣品占總定容后樣品的體積分?jǐn)?shù)/%。

1.3.7 鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 紫外-可見光譜分析

將鱈魚皮明膠肽與肽硒復(fù)合物粉末樣品溶于超純水中，配成1 mg/mL溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描[20]。

1.3.7.2 熒光光譜分析

將鱈魚皮明膠肽與肽硒復(fù)合物凍干粉溶于超純水中，配制成10 mg/mL溶液，采用熒光光譜儀測(cè)定，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為290～520 nm波長范圍內(nèi)熒光值的變化[21]。

1.3.7.3 粒徑分布

采用激光粒度儀測(cè)定鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的平均粒徑。用純凈水清洗樣品池直至背景清晰。將處理好的待測(cè)樣品緩慢加入樣液池中，測(cè)試溫度為25 ℃，每個(gè)樣品掃描3 次，取平均值[22]。

1.3.7.4 原子力顯微鏡分析

用原子力顯微鏡觀察鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的表面形態(tài)。將10 μL樣品置于新鮮剝離的云母上，室溫下干燥。原子力顯微鏡在輕敲模式下工作，掃描驅(qū)動(dòng)頻率為340 kHz[23]。

1.3.7.5 掃描電子顯微鏡分析

將適量的多肽粉末與肽硒復(fù)合物的凍干粉末樣品分別均勻涂抹于樣品盤，噴金鍍膜處理，施加電壓聚焦清晰后，放大5 000 倍和30 000 倍獲取圖像[24]。

1.3.7.6 X射線衍射分析

取一定量的樣品放在樣品槽中，在加速電壓40 kV、加速電流40 mA、掃描范圍（2θ）10°～70°、掃描速度0.02°/0.2 s的條件下對(duì)樣品進(jìn)行掃描，利用X射線衍射圖譜分析其結(jié)構(gòu)[25]。

1.3.7.7 紅外光譜分析

將鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物凍干粉各2 mg混入200 mg干燥的KBr粉末，于瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片，后進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍4 000～400 cm－1。掃描圖譜通過軟件進(jìn)行分析[26]。

1.3.7.8 拉曼光譜分析

將樣品平鋪在玻璃載玻片上，在532 nm波長激發(fā)下進(jìn)行拉曼光譜分析。鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的掃描范圍為800～4 000 cm－1。光譜基線校正和峰分配采用labspec 6軟件進(jìn)行分析[27]。

1.3.7.9 圓二色譜分析

用超純水配制1 mg/mL的鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物溶液，室溫下1 cm的路徑，波長范圍為190～260 nm，每個(gè)樣品掃描3 次，取平均值[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖，以表示，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱈魚皮明膠的氨基酸組成分析

表1 鱈魚皮明膠的氨基酸組成分析Table 1 Amino acid composition of hoki skin gelatin

由表1可知，鱈魚皮明膠具有典型的明膠氨基酸組成的特點(diǎn)，甘氨酸含量最多，占總氨基酸含量24.64%，表明鱈魚皮明膠分子結(jié)構(gòu)中存在(Gly-X-Y)n的重復(fù)結(jié)構(gòu)，這種氨基酸組成對(duì)維持明膠分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用[29]。亞氨酸（脯氨酸和羥脯氨酸）是明膠的特征氨基酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.55%。酪氨酸、組氨酸、異亮氨酸含量較低，且不含有胱氨酸。谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.26%、7.77%、6.31%、4.79%和4.62%。

2.2 硒含量的測(cè)定結(jié)果

分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶酶解鱈魚皮明膠得到3 種鱈魚皮明膠肽，以亞硒酸鈉為硒源，制備出3 種肽硒復(fù)合物，測(cè)定其中硒結(jié)合量。如圖1所示，胰蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量達(dá)到4.84 μg/mg，而胃蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量為13.61 μg/mg，風(fēng)味蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量13.05 μg/mg。胰蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量顯著低于胃蛋白酶酶解物和風(fēng)味蛋白酶酶解物（P＜0.05），胃蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物的硒結(jié)合量之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。胃蛋白酶屬于消化性蛋白酶，由胃部的胃黏膜主細(xì)胞分泌。因此，用胃蛋白酶酶解所得的鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物在消化道中較為穩(wěn)定。綜上所述，選用胃蛋白酶酶解所得的鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同酶酶解獲得的鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合量Fig.1 Selenium-binding capacity of hoki skin gelatin hydrolysates produced with different enzymes

2.3 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物紫外-可見光譜和熒光光譜分析

圖2 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的紫外-可見光譜圖（A）和熒光光譜圖（B）Fig.2 UV-Vis spectra (A) and fluorescence spectra (B) of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex

如圖2A所示，280 nm波長附近的吸收帶與芳香氨基酸殘基的吸光度有關(guān)。硒離子與鱈魚皮明膠肽結(jié)合后，波長280 nm左右的吸收帶強(qiáng)度明顯增大且紅移。這可能與發(fā)色團(tuán)（—C＝O，—COOH）和助色團(tuán)（—OH，ü NH2）的偏振有關(guān)。因此推測(cè)鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合生成了新物質(zhì)而導(dǎo)致其吸收峰變化。通常復(fù)合物的生成會(huì)使其配位體對(duì)光吸收性能發(fā)生改變，說明鱈魚皮明膠肽和硒結(jié)合發(fā)生了價(jià)電子躍遷，證明兩者之間發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)。

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香氨基酸可在特定的激發(fā)波長產(chǎn)生內(nèi)源性熒光[20]。由圖2B鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物熒光光譜圖發(fā)現(xiàn)，鱈魚皮明膠肽的最大吸收峰為311 nm，這與酪氨酸殘基有關(guān)。肽硒結(jié)合后，肽硒復(fù)合物的吸收峰遷移至355 nm，熒光強(qiáng)度顯著減弱，可能是由于硒離子的熒光猝滅作用。Sun Na等[30]的研究表明，礦物質(zhì)離子能夠引起肽的折疊。因此，水溶液中的硒離子可能會(huì)引起肽的折疊，形成肽硒復(fù)合物，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生與礦物質(zhì)離子和蛋白肽反應(yīng)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低類似的結(jié)果類似。

2.4 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的粒徑分析

將粒徑分布分為3 種粒徑范圍：＜5 0 0 n m、500～1 000 nm、＞1 000 nm，并計(jì)算其峰面積，分析各粒徑范圍所占比例。如圖3所示，鱈魚皮明膠肽的大小分布由649.4 nm和1 553.5 nm兩個(gè)峰組成，鱈魚皮明膠肽與硒相互作用后，大小分布集中在一個(gè)峰上，其粒徑為296.2 nm。粒徑的變化歸因于結(jié)合反應(yīng)過程中鱈魚皮明膠肽與硒離子之間發(fā)生了結(jié)構(gòu)折疊，這與Ye Qianwen等[31]的研究結(jié)果類似，大豆肽硒螯合后粒徑由連續(xù)分子質(zhì)量分布的肽減小成大小一致的顆粒。同時(shí)，這一結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了熒光光譜的結(jié)論，硒離子的存在引起肽折疊聚集而形成鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物。此外，顆粒的尺寸分布證明結(jié)合反應(yīng)后得到均勻的復(fù)合物。

圖3 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的粒徑分析Fig.3 Particle size distribution of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex

2.5 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物微觀結(jié)構(gòu)分析

圖4A1、B1顯示了鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的表面形態(tài)，可以看出精確的顆粒大小分布。圖4A2、B2顯示了三維圖像，在水溶液中羧基通過分子間氫鍵在肽鏈上聚集，形成小簇或大簇。由圖4A1、A2可知，鱈魚皮明膠肽表現(xiàn)出相對(duì)均勻均一的顆粒，高度近似100 nm。圖4B1、B2可知，肽硒復(fù)合物表現(xiàn)出類似花狀的大小不一的簇狀結(jié)構(gòu)，可能是硒的存在發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，引起了肽的聚集。與Cui Pengbo等[32]報(bào)道肽鈣復(fù)合物的結(jié)果類似。

圖4 原子力顯微鏡分析Fig.4 Atomic force microscopic analysis

分別用5 000 倍和30 000 倍的掃描電子顯微鏡觀察鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物，如圖5所示。鱈魚皮明膠肽表現(xiàn)為平整的片狀結(jié)構(gòu)，5 000 倍數(shù)下可以看到凹凸不平的圓弧，這應(yīng)該是鱈魚皮明膠多肽經(jīng)冷凍干燥后留下的親水區(qū)的痕跡；肽硒復(fù)合物比多肽結(jié)構(gòu)更緊密，結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致大團(tuán)塊的形成，具有更多的褶皺和晶體結(jié)構(gòu)，微觀結(jié)構(gòu)的變化表明，鱈魚皮明膠肽與硒離子結(jié)合形成致密的納米顆粒。Sun Na等[17]報(bào)道了肽鐵螯合物同樣具有球狀顆粒的褶皺和晶體結(jié)構(gòu)。

圖5 掃描電子顯微鏡分析Fig.5 Scanning electron microscopic analysis

圖6 X射線衍射圖Fig.6 X-ray diffraction patterns

由圖6可知，鱈魚皮明膠多肽在2θ為23°附近出現(xiàn)衍射吸收峰，吸收峰的強(qiáng)度不大，本底較大，說明膠原多肽基本上是無規(guī)則的非晶型結(jié)構(gòu)。而形成復(fù)合物后，X射線衍射圖出現(xiàn)多個(gè)強(qiáng)峰和弱峰，圖譜的衍射峰高而尖銳，強(qiáng)度大，說明晶型較好，與孫博[33]的結(jié)論類似。硒的存在增加了鱈魚皮明膠肽硒復(fù)合物晶體的結(jié)晶度，說明鱈魚皮明膠肽與硒發(fā)生了反應(yīng)，生成一種新的物質(zhì)。

2.6 鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合位點(diǎn)分析

如圖7A所示，3 434 cm-1主要由Nü H的伸縮振動(dòng)所致，1 641 cm-1主要由C＝O的伸縮振動(dòng)引起，1 454 cm-1主要由ü COO-引起；當(dāng)多肽與硒離子結(jié)合后，Nü H的吸收峰移動(dòng)到3 422 cm-1；指紋區(qū)C＝O的吸收峰移動(dòng)到1 648 cm-1；ü COO-的吸收峰移動(dòng)到了1 450 cm-1。這與趙立娜等[14]的結(jié)論類似，鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合前后的紅外光譜表明，多肽的氨基和羧基參與了硒離子的配位。

如圖7 B 所示，類似于紅外光譜，鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合也導(dǎo)致了拉曼光譜的變化，3 4 1 4、1 643、1 402 cm-1波數(shù)分別移至3 417、1 633 cm-1和1 402 cm-1。拉曼光譜3 414 cm-1，是由鱈魚皮明膠肽Nü H振動(dòng)引起，當(dāng)肽與硒離子結(jié)合后，波峰移動(dòng)了2 cm-1。約1 643 cm-1的條帶對(duì)應(yīng)酰胺I帶，主要是由于C＝O的伸縮振動(dòng)，肽硒復(fù)合后，移動(dòng)至1 633 cm-1。鱈魚皮明膠肽的拉曼光譜在1 402 cm-1處的峰值對(duì)應(yīng)于氨基酸側(cè)鏈的COO-官能團(tuán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，肽與硒離子結(jié)合后，其峰移動(dòng)至1 372 cm-1。拉曼光譜進(jìn)一步驗(yàn)證了紅外光譜的結(jié)果，鱈魚皮明膠肽的硒結(jié)合位點(diǎn)可能位于羧基和氨基。

圖7 鱈魚皮明膠肽與硒的結(jié)合位點(diǎn)分析Fig.7 Analysis of binding sites of hoki skin gelatin peptide with selenium

2.7 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖8 鱈魚皮明膠肽及肽硒復(fù)合物的圓二色譜Fig.8 CD spectra of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex

由圖8可知，鱈魚皮明膠肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊（28.1%）、無規(guī)卷曲（70.36%），同時(shí)含有較少的β-轉(zhuǎn)角（1.57%），當(dāng)多肽與硒結(jié)合后，新生成了α-螺旋結(jié)構(gòu)，含量為1.1%，β-轉(zhuǎn)角增加至3.3%，β-折疊減少至25.7%，而無規(guī)卷曲無顯著性變化，這與姜丹丹等[34]報(bào)道的無規(guī)卷曲基本不受鋅離子影響的結(jié)果類似。結(jié)果表明，鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合后，肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)變，由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)榱甩?螺旋和β-轉(zhuǎn)角，結(jié)構(gòu)更加有序和緊湊，這與Sun Na等[20]的結(jié)論一致。

3 結(jié) 論

本研究從鱈魚皮中提取明膠，氨基酸分析證明明膠是良好的原料，將酶解后的鱈魚皮明膠多肽與硒離子進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以硒結(jié)合量為指標(biāo)，篩選出胃蛋白酶為最適酶，其酶解物的平均硒結(jié)合量為13.61 μg/mg。鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合后，紫外光譜吸收峰強(qiáng)度增大且紅移，熒光光譜吸收峰由311 nm遷移到355 nm且熒光強(qiáng)度減弱，說明鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合產(chǎn)生新的物質(zhì)；通過激光粒徑儀、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡以及X射線衍射對(duì)其進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)鱈魚皮明膠肽與硒結(jié)合后粒徑減小，形成更為聚集的簇狀結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)為晶體結(jié)構(gòu)；圓二色譜分析表明鱈魚皮明膠肽上的羧基和氨基可能與硒發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，使得β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，形成結(jié)構(gòu)更為緊湊的肽硒復(fù)合物。本研究為海洋魚皮資源的高值化利用以及新型補(bǔ)硒產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。