pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

吳曉娟，王曉嬋，張佳妮，沈佳麗，李 依，金曼芹，吳 偉

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

米糠蛋白作為一種豐富而廉價的植物蛋白資源，因其過敏性低、氨基酸組成合理、生物效價高以及較好的生理活性，可作為功能因子應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中[1-2]。米糠蛋白還具有良好的溶解性和乳化性，是一種潛在的天然食品乳化劑，可作為配料應(yīng)用于飲料、肉制品和焙烤制品中[2]。鑒于米糠蛋白良好的營養(yǎng)價值及其在食品開發(fā)中的新興潛力，目前越來越多研究聚焦于采用新的提取方法或改性方法拓展其功能性質(zhì)及應(yīng)用領(lǐng)域[3]。米糠蛋白的功能性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，例如：米糠蛋白的持水性和持油性與蛋白質(zhì)表面電荷、極性氨基酸、表面疏水性等密切相關(guān)；乳化性和乳化穩(wěn)定性與蛋白分子柔性、分子質(zhì)量大小等密切相關(guān)；起泡性和起泡穩(wěn)定性不僅與表面電荷、極性氨基酸等相關(guān)，還受無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)變化影響[4-5]。pH值偏移是一種操作簡單、成本低廉并且效果顯著的改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露在極端pH值條件下時，其亞基結(jié)構(gòu)、表面疏水性、內(nèi)源色氨酸熒光強度等結(jié)構(gòu)特征會發(fā)生變化，使之處于變性與未變性之間的熔球態(tài)，處于熔球態(tài)的蛋白質(zhì)的部分功能性質(zhì)會發(fā)生一定程度的改善[6-8]。pH值偏移處理尤其是堿性偏移，可以顯著改善植物蛋白（大豆蛋白、豌豆蛋白等）的凝膠性和成膜性[8-9]。近年來，部分研究還側(cè)重于將不同的蛋白質(zhì)改性方法相結(jié)合，以期獲得更加精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)功能性質(zhì)定向調(diào)控方法。例如，王健等[10]通過對大豆蛋白進(jìn)行pH值酸堿偏移結(jié)合熱處理，揭示了蛋白質(zhì)分子柔性在功能性質(zhì)中的作用。鑒于米糠蛋白在堿溶液中良好的溶解度以及較低的變性溫度（約70 ℃）[7]，本實驗擬研究pH值堿性偏移（pH 11）結(jié)合溫和熱處理（50、60 ℃）對米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響，以期獲得一種簡便有效的米糠蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的調(diào)控方法，為合理開發(fā)米糠蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠 連云港瑾宏生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白（14～100 ku） 上海生物化學(xué)研究所；1-苯氨基萘-8-磺酸、5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Sigma-Aldrich公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tr i s）等試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀、LC-20液相色譜儀 日本島津公司；F4600熒光分光光度計 日本日立公司；Blue Star紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份公司；Nano ZS納米粒度分析儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白制備

參考吳偉等[11]方法，將100 g脫脂米糠與1 000 mL去離子水混合，用2 mol/L NaOH溶液將混合液調(diào)至pH 9.0，40 ℃、120 r/min水浴攪拌4 h，然后4 ℃、8 000 r/min離心20 min。取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 4.0，靜置20 min，待出現(xiàn)明顯沉淀后4 ℃、8 000 r/min離心15 min。水洗沉淀并4 ℃、8 000 r/min離心15 min，重復(fù)2 次。隨后用去離子水分散蛋白沉淀，并用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 7.0，冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白處理

參考Jiang Jiang[8]和耿蕊[12]等的方法對米糠蛋白進(jìn)行pH值堿性偏移結(jié)合熱處理。用去離子水將米糠蛋白配制成20 mg/mL的蛋白溶液（對照），用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液至pH 11，將溫度分別設(shè)定為室溫（25 ℃）、50、60 ℃，水浴加熱蛋白溶液1、3、5 h。然后采用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液至pH 7.0，保溫1 h后再調(diào)至pH 4.0，用去離子水洗滌沉淀3 次。最后用去離子水分散離心后的蛋白沉淀，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，冷凍干燥得到處理后的米糠蛋白樣品。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Liu Yongle等[13]方法，取米糠蛋白樣品2 mg與200 mg KBr研磨成粉末，混合均勻，用壓片機壓片3～5 min，制成透明薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1。

1.3.4 游離巰基和總巰基含量測定

將米糠蛋白樣品配制成質(zhì)量濃度20 mg/mL的待測蛋白溶液，溶液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定。參考Huang Youru等[14]的方法，采用DTNB比色法測定米糠蛋白的游離巰基和總巰基含量。

1.3.5 分子質(zhì)量分布測定

將米糠蛋白樣品配制成10 mg/mL的蛋白溶液，過孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜，對濾液采用LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱：TSKgel SW G4000 SWXL；檢測器：Waters 996光電二極管陣列檢測器；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl）；流速1 mL/min。將蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 mg/mL溶液，采用高效液相色譜儀在同樣條件下進(jìn)行分析，以保留時間為x軸，相對分子質(zhì)量對數(shù)為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-0.312 8x+8.517 1（R2=0.990 2），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算得到不同保留時間米糠蛋白組分的相對分子質(zhì)量。

1.3.6 粒徑分布測定

將米糠蛋白樣品配制成1 mg/mL的蛋白溶液，在25 ℃條件下采用納米粒度分析儀測定米糠蛋白溶液的粒徑分布。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考吳偉等[11]的測定方法，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.5%的分離膠和4%的濃縮膠，含有0.05 mol/L Tris-0.384 mol/L甘氨酸、0.1% SDS（pH 8.3）的電極緩沖液。在燒杯中分別加入10% SDS、5 mLβ-巰基乙醇、10 mL甘油、20 mg溴酚藍(lán)、20 mL 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，最后加水至總體積100 mL，配制成樣品溶解液，再把米糠蛋白溶于樣品溶解液中配成1.5 mg/mL的電泳樣品。上樣量10 μL，起始電流10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后增大到25 mA。

1.3.8 內(nèi)源熒光光譜分析

參考Wu Wei等[15]方法。將米糠蛋白樣品用去離子水稀釋成0.1 mg/mL的蛋白溶液，采用F-4600型熒光光譜儀在激發(fā)波長280 nm下掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜（狹縫寬度2.5；靈敏度為1），以去離子水為空白。

1.3.9 表面疏水性測定

參考Wu Wei等[15]方法，將米糠蛋白樣品用去離子水配制成20 mg/mL的蛋白溶液，再將其稀釋為0.005～0.50 mg/mL之間5 個不同質(zhì)量濃度梯度的蛋白溶液。在試管中分別加入不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液4 mL和8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液50 μL，激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm下測定熒光強度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強度為縱坐標(biāo)作圖，米糠蛋白表面疏水指數(shù)即曲線初始階段的斜率。

1.3.10 溶解性測定

將米糠蛋白樣品10 mg/mL分散于去離子水中，室溫條件磁力攪拌2 h后，8 000 r/min離心20 min，收集上清液，隨后采用微量凱氏定氮法測定上清液中可溶解氮含量，溶解性表示為可溶解氮與樣品中總氮的百分比。

1.3.11 持水性和持油性測定

參考Benelhadi等[16]方法，將1.0 g米糠蛋白與10 mL蒸餾水或精制大豆油充分混合，3 000 r/min離心20 min，將蒸餾水或大豆油排干30 min后測定樣品質(zhì)量，以每單位質(zhì)量米糠蛋白吸收水或油的質(zhì)量分別表示其持水性和持油性。

1.3.12 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定

參考Kamara等[17]方法，將200 mg米糠蛋白用0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制成10 mg/mL的溶液，10 000 r/min均質(zhì)30 s，重復(fù)3 次，測量均質(zhì)后的體積V0，靜置30 min后測量泡沫體積V1。計算公式如下：

1.3.13 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

參 考M o l i n a 等[18]方 法，取1 2 m L 蛋 白 溶 液（1 mg/mL）和4 mL大豆油混合，在10 000 r/min均質(zhì)2 min，取100 μL米糠蛋白-大豆油乳狀液與5 mL 0.1% SDS用渦流振蕩器混合均勻，在500 nm波長處測定吸光度。計算公式如下：

式中：N為稀釋倍數(shù)；C為樣品溶解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相占比/%；A0和A30分別為乳液在第0和30分鐘時的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用s表示，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜是分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要技術(shù)之一，特別是酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1），是表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)最常用的特征頻率區(qū)域[19]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化會影響其表面疏水性和柔性，進(jìn)而影響功能性質(zhì)[20]。參考Sun Weizheng等[21]的方法對pH 11偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白去卷積酰胺I帶吸收光譜進(jìn)行Gaussian擬合，得到11 個特征吸收峰（表1）。1 609 cm-1是由氨基酸側(cè)鏈（尤其是酪氨酸殘基等）產(chǎn)生的特征吸收峰[21]。1 610～1 628 cm-1的特征吸收峰通常被認(rèn)為是β-折疊平行排列產(chǎn)生的，而1 630～1 640 cm-1和1 675～1 695 cm-1的特征吸收峰則被認(rèn)為是β-折疊反平行排列產(chǎn)生的[22]。1 653 cm-1的強吸收峰是α-螺旋結(jié)構(gòu)的C＝O伸縮振動產(chǎn)生的[21,23]。1 671 cm-1的特征吸收峰可歸屬于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而1 646 cm-1和1 662 cm-1的特征吸收峰被認(rèn)為是無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[24]。結(jié)果顯示，相比于未處理的米糠蛋白，pH 11偏移處理使得米糠蛋白β-折疊含量明顯降低，α-螺旋含量略微降低，無規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角和氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)含量有所增加。pH值會改變蛋白表面帶電氨基酸、α-羰基和α-氨基末端質(zhì)子化狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促使蛋白質(zhì)分子展開，這可能是導(dǎo)致米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)化的主要原因[25]。相比于pH值堿性偏移處理，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理1 h的米糠蛋白β-折疊含量顯著升高（P＜0.05），無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著降低（P＜0.05）；當(dāng)加熱時間延長到3 h時，米糠蛋白β-折疊含量顯著降低（P＜0.05），無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)加熱時間延長到5 h時，米糠蛋白β-折疊含量增加到44%左右，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量又隨之下降。在蛋白質(zhì)處于極端堿性環(huán)境中，由于堿的作用使蛋白質(zhì)分子展開，暴露出蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)，暴露出來的疏水基團(tuán)又因為相互作用而聚集；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于加熱環(huán)境中時，溫度升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開，然后通過疏水作用、氫鍵、二硫鍵等相互作用而聚集[26]。因而，pH 11偏移結(jié)合熱處理時，米糠蛋白的二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)折疊-去折疊-復(fù)折疊的復(fù)雜變化過程。

表1 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of alkaline pH-shifting combined with heating treatment on the secondary structures of rice bran protein

2.2 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白游離巰基和總巰基含量的影響

pH 11偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白巰基變化如表2所示，相比于未處理的米糠蛋白，單獨pH值堿性偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白總巰基和游離巰基含量均顯著下降（P＜0.05）。pH值偏移處理大豆蛋白的研究表明，隨著堿性pH值增加，巰基通過去質(zhì)子化而形成硫醇化合物，并且堿性環(huán)境會加速巰基氧化[27]，這可能也是造成米糠蛋白在堿性偏移條件下巰基含量下降的原因。單獨采用pH值堿性偏移處理時，隨著處理時間的延長，米糠蛋白游離巰基和總巰基含量都略微增加。通常巰基含量的增加主要有2 種原因：一是蛋白質(zhì)亞基解離，導(dǎo)致二硫鍵斷裂形成新的巰基；二是蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開，暴露出新的巰基[10]。結(jié)合傅里葉變換紅外光譜中呈現(xiàn)的氨基酸側(cè)鏈和無序結(jié)構(gòu)含量略微增加等現(xiàn)象，推斷極端pH值條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降導(dǎo)致部分側(cè)鏈結(jié)構(gòu)展開重排是引起巰基含量增加的重要因素。從表2還發(fā)現(xiàn)，相比于單獨pH值偏移處理的米糠蛋白，結(jié)合熱處理的米糠蛋白游離巰基含量更低，并且隨著加熱時間的延長，游離巰基含量進(jìn)一步下降。加熱條件下蛋白質(zhì)游離巰基更易被氧化形成分子間二硫鍵[28]。蛋白質(zhì)巰基氧化是一個復(fù)雜過程，巰基通常先被自由基攻擊生成亞磺酰自由基，隨后再與分子氧形成硫醇自由基，然后繼續(xù)氧化形成二硫鍵，這一階段是可逆氧化反應(yīng)，而不可逆氧化反應(yīng)則進(jìn)一步生成亞磺酸、磺酸等[29]。隨著熱處理時間的延長，米糠蛋白總巰基含量也呈略微下降的趨勢，由此可見，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理米糠蛋白，不僅使游離巰基氧化形成分子間二硫鍵，還生成了一些不可逆的含硫化合物。

表2 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白總巰基、游離巰基的影響Table 2 Effects of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on total and free sulfhydryl group contents of rice bran protein

2.3 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白分子質(zhì)量和粒徑分布的影響

圖1 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響Fig.1 Effects of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on molecular mass distribution of rice bran protein

如圖1所示，未處理的米糠蛋白主要有2 個特征吸收峰，對應(yīng)保留時間分別為6.04 min和11.93 min，峰面積百分比分別為13.57%和86.43%，前者主要是分子質(zhì)量大于1 000 kDa的蛋白質(zhì)聚集體等大分子物質(zhì)，后者主要是分子質(zhì)量在3～200 kDa的米糠蛋白及其亞基等小分子物質(zhì)[11]。采用pH 11偏移、pH 11偏移結(jié)合50 ℃和60 ℃處理均會在一定程度上促使米糠蛋白聚集體分解，當(dāng)處理時間1 h時，保留時間6.04 min的峰面積百分比分別為1.03%、4.65%和3.66%。Jiang Jiang等[30]關(guān)于pH值偏移處理大豆蛋白11S組分的研究也認(rèn)為，極端pH值條件下，酸性亞基和堿性亞基組成的復(fù)合物容易被解離。但隨著處理時間的延長，單獨堿性偏移處理以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白中聚集體含量又會增加，當(dāng)處理時間5 h時，保留時間6.04 min的峰面積百分比分別為1.40%、11.05%和6.63%。由于天然的米糠蛋白本身極易受脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物氧化，而堿性環(huán)境和熱處理均會加速蛋白質(zhì)氧化，這可能是導(dǎo)致聚集體不斷增加的重要原因[29]。

相比于未處理的米糠蛋白，單獨采用堿性偏移處理的米糠蛋白粒徑分布曲線明顯向大尺寸方向移動（圖2A），當(dāng)米糠蛋白置于pH 11的溶液中時，平均粒徑就從129.92 nm增加到190.45 nm（圖2B）。結(jié)合分子質(zhì)量分布結(jié)果分析，應(yīng)該是極端pH值環(huán)境下蛋白質(zhì)分子快速展開導(dǎo)致粒徑增加。隨著處理時間的延長，平均粒徑逐漸下降，當(dāng)處理時間為5 h時，平均粒徑降低到114.33 nm，一方面可能是酸性亞基-堿性亞基復(fù)合物的解離起了主導(dǎo)作用，另一方面展開的蛋白質(zhì)分子可能通過疏水作用等再次聚集[26]。pH 11偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白平均粒徑呈現(xiàn)類似的先增后減的變化趨勢，但處理5 h時，平均粒徑略大于單獨pH值偏移處理的樣品，這可能也是因為加熱提高了米糠蛋白中氧化聚集體的含量。

圖2 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on particle size distribution of rice bran protein

2.4 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響

圖3 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of rice bran protein treated with alkaline pH-shifting combined with heating

如圖3所示，未處理的米糠蛋白亞基主要分布在60～70，40～50、37～38 ku和低于25 ku （泳道0），其中37～38 ku是谷蛋白酸性亞基對應(yīng)的條帶[31]。當(dāng)將米糠蛋白置于pH 11的溶液時（泳道1），明顯看到37～38 ku條帶的顏色變深，這印證了前面分子質(zhì)量分布結(jié)果推測的蛋白質(zhì)聚集體中酸性亞基和堿性亞基復(fù)合物發(fā)生解離的現(xiàn)象。隨著處理時間的延長，亞基結(jié)構(gòu)對應(yīng)的條帶又逐漸變淺。當(dāng)在50、60 ℃下分別加熱3、5 h時，分離膠頂部出現(xiàn)明顯的聚集體條帶（泳道6、7、9、10），這表明pH 11偏移結(jié)合熱處理導(dǎo)致米糠蛋白形成了一些非二硫共價鍵交聯(lián)的聚集體。結(jié)合前面巰基變化的結(jié)果分析，二硫鍵和非二硫共價鍵共同參與了這一過程中蛋白質(zhì)聚集體的形成。

2.5 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖4 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.4 Effect of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on intrinsic fluorescence spectrum of rice bran protein

如圖4所示，隨著處理時間延長，米糠蛋白最大熒光峰位均出現(xiàn)先紅移再藍(lán)移的變化趨勢。未處理的米糠蛋白最大熒光峰位為346.61 nm，單獨pH 11、pH 11偏移結(jié)合50 ℃和60 ℃處理的米糠蛋白最大熒光峰位均在處理時間1 h時達(dá)到最大值，分別為350.63、348.65 nm和348.04 nm。內(nèi)源熒光光譜中最大熒光峰位紅移表明蛋白質(zhì)中色氨酸殘基微環(huán)境極性增強[11]。王健等[10]對大豆分離蛋白采用pH 11偏移短時（15 min）處理，也發(fā)現(xiàn)最大熒光峰位發(fā)生紅移。pH值堿性偏移處理會誘導(dǎo)原先包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水側(cè)鏈暴露到分子表面的極性環(huán)境中，使色氨基殘基微環(huán)境發(fā)生改變[27]。隨著堿性偏移處理時間延長，米糠蛋白最大熒光峰位發(fā)生藍(lán)移，結(jié)合前面二級結(jié)構(gòu)變化結(jié)果進(jìn)行分析，推斷可能是暴露出來的疏水基團(tuán)又因為疏水相互作用而聚集，使米糠蛋白中色氨酸殘基微環(huán)境非極性增強。結(jié)果還顯示，熱處理會抑制米糠蛋白最大熒光峰位紅移，結(jié)合分子質(zhì)量分布和亞基結(jié)構(gòu)變化結(jié)果推測，可能是熱處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集造成的。

2.6 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白表面疏水性的影響

pH值偏移處理大豆分離蛋白的研究證實，極端堿性條件下蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)容易展開，致使表面疏水性顯著增加[27]。但不同于大豆分離蛋白表面疏水性的持續(xù)增加，pH 11偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白表面疏水性隨著處理時間的延長呈先上升后下降的趨勢（圖5）。這可能是由于相比大豆分離蛋白，米糠蛋白中殘留的內(nèi)源脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物更容易與其疏水側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致表面疏水性下降[11]。從圖5還可以看出，pH值偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白表面疏水性顯著大于單獨pH值偏移處理（P＜0.05）。關(guān)于肌原纖維蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，熱處理會顯著增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，并且熱處理導(dǎo)致的表面疏水性增加有利于蛋白質(zhì)無定形或纖維狀聚集體的形成[32-33]。隨著熱處理時間的延長，米糠蛋白通過疏水相互作用形成聚集體，又會導(dǎo)致表面疏水性下降。

圖5 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on hydrophobicity of rice bran protein

2.7 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白功能性質(zhì)的影響

表3 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對米糠蛋白功能性質(zhì)的影響Table 3 Effects of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on functional properties of rice bran protein

通常，良好的溶解性有助于蛋白質(zhì)部分功能性質(zhì)的發(fā)揮，并且還會影響其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。pH值堿性偏移結(jié)合熱處理米糠蛋白的溶解性和功能性質(zhì)如表3所示。相比于未處理的米糠蛋白，pH值堿性偏移處理的米糠蛋白溶解性顯著（P＜0.05）增加。Jiang Jiang等[34]關(guān)于大豆蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，pH值堿性偏移處理的蛋白質(zhì)在pH 6～7范圍內(nèi)溶解度高于未經(jīng)處理。結(jié)合熱處理后，米糠蛋白的溶解性顯著（P＜0.05）低于單獨pH值堿性偏移處理的米糠蛋白，這可能歸因于加熱促使疏水基團(tuán)的暴露以及不溶性聚集體的產(chǎn)生[35]。隨著處理時間的延長，單獨pH值堿性偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白溶解性均逐漸下降。相比于未處理的米糠蛋白，pH值堿性偏移處理0 h的米糠蛋白持水性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都顯著（P＜0.05）下降，僅持油性顯著（P＜0.05）提高。隨著pH值偏移處理時間的延長，米糠蛋白持水性、起泡性、乳化性和乳化穩(wěn)定性有所回升。其中，乳化性回升效果最明顯，當(dāng)pH 11偏移處理5 h時，乳化性達(dá)到最大值60.28 m2/g，是未處理米糠蛋白的1.3 倍。隨著pH值偏移處理時間延長，持油性和泡沫穩(wěn)定性則呈先上升后下降的趨勢，分別在處理時間3 h時達(dá)到最大值853.77%和44.40%。pH值堿性偏移結(jié)合熱處理可以改善米糠蛋白的持水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性。米糠蛋白的持水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性分別在pH 11+50 ℃+5 h、pH 11+60 ℃+1 h和pH 11+60 ℃+5 h達(dá)到最大值，分別為760.32%、84.70%和122.69 min，是未處理米糠蛋白的2.4、1.3、1.6 倍。熱處理（尤其是50 ℃條件下）可以在一定程度上緩解pH值偏移對米糠蛋白起泡性的負(fù)面影響，但難以使其回復(fù)到處理前的起泡能力。同時，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理還會顯著降低單獨pH值偏移對米糠蛋白持油性和乳化性的改善作用。

3 結(jié) 論

米糠蛋白經(jīng)pH值堿性偏移結(jié)合熱處理后，其結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了顯著變化。pH值堿性偏移促使米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)由有序向無序轉(zhuǎn)化，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理使得米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)折疊-去折疊-復(fù)折疊的復(fù)雜變化，并伴隨巰基氧化。結(jié)合分子質(zhì)量分布、粒徑分布和亞基結(jié)構(gòu)變化分析，pH值堿性偏移促使米糠蛋白展開，隨著處理時間的延長，米糠蛋白重新聚集，熱處理會加劇這種聚集行為。內(nèi)源熒光光譜和表面疏水性的變化進(jìn)一步展現(xiàn)了米糠蛋白在pH值堿性偏移結(jié)合熱處理過程中空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜變化，并印證了這一過程中分子的展開-聚集行為。單獨pH值堿性偏移處理會使得米糠蛋白的持水性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著下降，僅持油性有所改善。但pH值堿性偏移結(jié)合熱處理則可顯著改善米糠蛋白的持水性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性。pH值堿性偏移結(jié)合熱處理有望成為一種很好調(diào)控米糠蛋白功能性質(zhì)的方法。