氯化鈣-無(wú)花果蛋白酶-獼猴桃蛋白酶體系對(duì)兔肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用

李明奇，賀稚非,2，李少博，李冉冉，瞿 丞，李洪軍,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué)重慶市特色食品工程技術(shù)研究學(xué)院，重慶 400716）

肉的嫩度是影響肉制品品質(zhì)的重要特性，肉中肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是決定肉品嫩度的主要因素之一[1]。在諸多嫩化手段中，嫩化劑被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)有效安全的嫩化方法，其作用機(jī)理多樣，其中氯化鈣與外源蛋白酶是常見(jiàn)的嫩化劑；高濃度的鈣離子可以激活鈣蛋白酶使細(xì)胞骨架蛋白降解[2]，另一方面鈣離子引起的電荷間的排斥作用會(huì)導(dǎo)致Z盤的機(jī)械性斷裂，使肌動(dòng)蛋白失去穩(wěn)定性，從而MP解聚失去完整性，肉制品嫩度因此得到改善[3]；外源蛋白酶中常見(jiàn)的有木瓜蛋白酶、獼猴桃蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶等從植物中提取的酶制劑，外源酶通過(guò)水解MP，破壞肌肉纖維結(jié)構(gòu)，從而提高肉制品的嫩度[4]。雖然木瓜蛋白酶是目前被廣泛使用的酶制劑，但其存在過(guò)度嫩化而使肉制品表面發(fā)黏的現(xiàn)象[5]；獼猴桃蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶是近幾年被廣泛研究的2 種酶制劑，據(jù)前人實(shí)驗(yàn)顯示，這2 種酶的嫩化效果更溫和，且最適酶解溫度較低，獼猴桃蛋白酶在35～45 ℃，無(wú)花果蛋白酶在45～55 ℃[6-7]，在此溫度范圍內(nèi)嫩化可以保護(hù)肉制品色澤。

兔肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)20%，每100 g兔肉可提供900 kJ的熱量，其中80%由蛋白質(zhì)提供，可見(jiàn)兔肉是一種健康優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源[8]。但是兔肉在熱加工后失水嚴(yán)重，肉質(zhì)變硬，口感發(fā)柴[9]。目前在利用嫩化劑嫩化兔肉方面，已證明氯化鈣、無(wú)花果蛋白酶和獼猴桃蛋白酶組成的復(fù)配嫩化劑可以顯著降低兔后腿肉的剪切力和蒸煮損失[10]，但在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步研究復(fù)配體系對(duì)MP的協(xié)同降解作用卻鮮有報(bào)道。在本研究中，利用已得到的嫩化劑最優(yōu)配比處理兔后腿肉，觀察處理后的兔肉中MP相關(guān)指標(biāo)隨嫩化時(shí)間的變化，以肌原纖維蛋白小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）、MP溶解度、可溶性蛋白含量（soluble protein content，SPC）、MP表面疏水性以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）為指標(biāo)判斷MP結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)與等量的氯化鈣、獼猴桃蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶3 種單一嫩化劑處理兔后腿肉所得的蛋白質(zhì)指標(biāo)變化情況作對(duì)比，分析此過(guò)程中各組指標(biāo)的變化趨勢(shì)，以期研究復(fù)配嫩化劑中各組分之間在降解MP時(shí)的協(xié)同作用機(jī)理，為嫩化劑的復(fù)配形式提供更多理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇70 日齡伊拉公兔20 只（購(gòu)自重慶市阿興記原種兔養(yǎng)殖基地），每只體質(zhì)量3～3.5 kg，屠宰去皮后，取后腿，置于裝有冰袋的采樣箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在4 ℃下過(guò)夜排酸，然后放置于-18 ℃環(huán)境下貯藏。

獼猴桃蛋白酶（105U/g，食品級(jí)） 廣州馨之味食品配料商城；無(wú)花果蛋白酶（105U/g，食品級(jí)） 山東一品食品配料有限公司；氯化鈣（食品級(jí)） 河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為食品級(jí)） 河南華悅化工產(chǎn)品有限公司；氯化鎂、氫氧化鈉、SDS、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、甲醇、冰醋酸 重慶市鈦新化工有限公司；酒石酸鉀鈉 寧波大川精細(xì)化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na） 成都市科龍化工試劑廠；溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB） 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；上述試劑均為分析純；牛血清蛋白（生化試劑）成都市科龍化工試劑廠；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司；RealBand蛋白預(yù)染Maker 北碚區(qū)文鼎試驗(yàn)設(shè)備經(jīng)營(yíng)部。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；電泳儀伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；FA2003分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-6富華數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；WT-1插入式溫度計(jì) 江蘇省精創(chuàng)電氣股份有限公司；Avanti J-30I冷凍離心機(jī)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；F-2500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品嫩化處理

將兔后腿肉從-18 ℃的冰箱中取出，置于4 ℃條件下解凍12 h，剔除腿骨以及表面可見(jiàn)脂肪和結(jié)締組織后，將其分為大小均勻，每塊質(zhì)量約20 g的肉塊，每100 g肉為一組，將各組實(shí)驗(yàn)樣品分別置于100 mL質(zhì)量濃度為35 mg/L的復(fù)配嫩化劑（氯化鈣、無(wú)花果蛋白酶、獼猴桃蛋白酶分別以質(zhì)量濃度18、11、6 mg/L復(fù)配）、氯化鈣、無(wú)花果蛋白酶、獼猴桃蛋白酶溶液中（磷酸緩沖液調(diào)節(jié)至pH 8），于30 ℃水浴條件下浸泡處理，以第0、30、60、90、120、150、180分鐘為取樣點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)測(cè)量，上述復(fù)配嫩化劑比例及嫩化條件已經(jīng)由響應(yīng)面及正交試驗(yàn)優(yōu)化得出[10]。

1.3.2 MP的提取

參考Wang Zhaoming等[11]的方法稍作修改，將嫩化后的兔肉進(jìn)一步切成塊狀并用絞肉機(jī)絞成肉糜，用于提取MP。將25 g肉糜置于100 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中（pH 7.0，0.1 mol/L NaCl，0.002 mol/L MgCl2，0.001 mol/L EDTA-2Na），5 000 r/min均質(zhì)30 s后，5 000 r/min、4 ℃離心30 min，去除上清液，重復(fù)上述過(guò)程3 次后，取沉淀與100 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L NaCl，pH 6.25）混合，5 000 r/min均質(zhì)30 s。5 000 r/min、4 ℃離心15 min后，將沉淀與100 mL的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L ，pH 6）混合，5 000 r/min均質(zhì)30 s后用雙層紗布過(guò)濾。最后，濾液再次6 000 r/min、4 ℃離心15 min，所得沉淀即為MP，置于4 ℃冰箱保存不超過(guò)24 h。

1.3.3 MFI的測(cè)定

參考王兆明[12]的方法并作適當(dāng)修改，剔除可見(jiàn)結(jié)締組織后稱取4.00 g肉樣并絞碎，加入10 倍體積提取液（0.1 mol/L KCl，0.018 mol/L K2HPO4，0.007 mol/L KH2PO4，0.001 mol/L EDTA-2Na，0.001 mol/L MgCl2，pH 7.0，4 ℃），冰浴條件下5 000 r/min均質(zhì)1 min后5 000 r/min、4 ℃離心30 min，重復(fù)上述操作2 次后，在沉淀中加入15 mL上述冰浴MFI提取液并均質(zhì)30 s后用單層紗布過(guò)濾，所得濾液即為MP提取液。用雙縮脲法測(cè)定MP提取液中蛋白質(zhì)量濃度，再用上述MFI提取液調(diào)整MP質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，MFI計(jì)算如式（1）所示：

pH值能夠反映肌肉內(nèi)部游離氫離子和氫氧根離子濃度，所以作為一項(xiàng)比較重要的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)水產(chǎn)品的品質(zhì)[23]。由表6可知，處理?xiàng)l件不同的海螺肉在4 ℃貯藏20天，pH值不相同。pH值會(huì)隨著海螺貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)而呈現(xiàn)出先降再升的趨勢(shì)。蘭洋的研究驗(yàn)證了兔肉微凍保鮮技術(shù)中pH值都先下降后上升，宋華靜等[24]在研究微凍保鮮技術(shù)中鮮豬肉的pH值變化時(shí)也有類似的發(fā)現(xiàn)。紅茶處理的海螺肉在第15天達(dá)到最低pH值。紅茶處理后海螺肉樣的pH值均略低于未處理的海螺肉。pH值上升速度越快表明樣品腐敗變質(zhì)水平越高。本實(shí)驗(yàn)表明紅茶處理在一定程度上延長(zhǎng)了海螺肉的貨架期。

式中：A540nm為540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；200為吸光系數(shù)。

1.3.4 蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定

參考Agyare等[13]的方法作適當(dāng)修改。將提取出的MP用磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na2HPO4，pH 6.2），冰浴條件下2 800 r/min均質(zhì)0.3 min，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的溶液。然后在4 ℃條件下放置1 h后4 500 r/min、4 ℃離心15 min，用雙縮脲法測(cè)定上清液中MP的濃度，空白為磷酸鹽緩沖溶液。溶解度計(jì)算如式（2）所示：

1.3.5 SPC的測(cè)定

參照羅海波[14]的方法作適當(dāng)修改。取兔肉4 g，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，加入10 倍體積提取液（0.007 mol/L KH2PO4，0.018 mol/L K2HPO4，0.001 mol/L EDTA-2Na，0.1 mol/L KCl，0.001 mol/L MgCl2，pH 7.0，4 ℃），冰浴條件下均質(zhì)處理1 min后5 000 r/min、4 ℃離心30 min，用雙縮脲法測(cè)定上清液中SPC。

1.3.6 MP表面疏水性

參考Chelh等[15]的方法。用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6，0.6 mol/L NaCl）將MP稀釋至5 mg/mL，取1 mL稀釋液與0.2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的BPB溶液混合，對(duì)照組加入1 mL磷酸鹽緩沖液和0.2 mL的BPB溶液。25 ℃下置于搖床混合均勻，10 min后2 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液并用10 倍體積，濃度為0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6）稀釋，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。MP表面疏水性計(jì)算如式（3）所示：

1.3.7 蛋白質(zhì)SDS-PAGE

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 17.0分析處理，取置信度95%（P＜0.05，差異顯著），采用Origin 2017進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 MFI隨嫩化時(shí)間的變化

MFI的定義是長(zhǎng)度為1～4 個(gè)肌節(jié)的肌原纖維占全部肌原纖維的比例，可作為表征嫩度的重要指標(biāo)，MFI值越大，說(shuō)明肌節(jié)中肌動(dòng)球蛋白的降解程度越大，肌肉嫩度越好[16]。由圖1可知，隨著嫩化處理的進(jìn)行，4 個(gè)處理組的MFI均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在0～60 min內(nèi)，只有氯化鈣組的增長(zhǎng)不顯著（P＞0.05），在第60分鐘，蛋白酶組的MFI顯著高于復(fù)配組（獼猴桃蛋白酶組為75.31f 0.99，無(wú)花果蛋白酶組為77.12f 0.79，復(fù)配組為73.28f 0.12）（P＜0.05），氯化鈣組最低（53.66f 1.28），在90～150 min，氯化鈣組和無(wú)花果蛋白酶組MFI顯著增大（P＜0.05），獼猴桃蛋白酶組無(wú)顯著增長(zhǎng)（P＞0.05），同時(shí)復(fù)配組的MFI顯著增加且后期一直在4 組中保持最大值（P＜0.05）。表明在0～90 min之間，復(fù)配組MFI顯著增長(zhǎng)的原因主要由無(wú)花果蛋白酶和獼猴桃蛋白酶在蛋白表面的降解作用引起；在90～150 min內(nèi)，氯化鈣的離子作用導(dǎo)致Z盤斷裂，MP結(jié)構(gòu)逐漸失去穩(wěn)定性，促使蛋白質(zhì)展開(kāi)，暴露更多酶解位點(diǎn)，進(jìn)而使蛋白酶的酶解作用增強(qiáng)，且這種協(xié)同增效降解作用具有一定持續(xù)性和穩(wěn)定性。

圖1 MFI隨嫩化時(shí)間的變化Fig.1 Changes in MFI with tenderization time

2.2 溶解度隨嫩化時(shí)間的變化

MP溶解度可以與肌球蛋白粗絲解聚程度呈正相關(guān)[17]。由圖2可知，4 種嫩化劑處理后的兔肉MP溶解度總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，復(fù)配組溶解度在0～90 min內(nèi)為最大值且增長(zhǎng)速度最快，從（13.99f 0.49）%增加到（52.38f 0.65）%，此后繼續(xù)增長(zhǎng)，在第150分鐘達(dá)到最大值（53.75f 0.36）%，蛋白酶組的溶解度在0～120 min顯著上升，第90分鐘無(wú)花果蛋白酶組溶解度達(dá)到最大值（39.54f 0.36）%，第120分鐘獼猴桃蛋白酶組溶解度達(dá)到（56.59f 1.38）%，氯化鈣組在嫩化前期增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩，90～120 min內(nèi)溶解度顯著增加并達(dá)到最大值（48.44f 0.27）%，2 種蛋白酶的降解程度有一定差異，這可能是因?yàn)樵?0 ℃時(shí)獼猴桃蛋白酶活性比無(wú)花果蛋白酶活性高引起的[6]。上述現(xiàn)象表明嫩化初期，復(fù)配組溶解度的增加主要由蛋白酶對(duì)MP的降解作用導(dǎo)致的，后復(fù)配組溶解度的進(jìn)一步增加是由蛋白酶和氯化鈣的共同作用所致，氯化鈣增加離子強(qiáng)度，引起電荷間排斥，減小蛋白之間的靜電相互作用力，加強(qiáng)蛋白質(zhì)和水的作用，從而使MP之間的分散性更好[18]。在120～150 min內(nèi)，氯化鈣組和蛋白酶組均呈下降趨勢(shì)，一方面在高濃度的氯化鈣組中蛋白質(zhì)之間由于疏水作用力重新聚集，溶解度降低[19]，另一方面在酶作用下降解產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)會(huì)重新聚集成大分子蛋白質(zhì)，導(dǎo)致溶解度降低[20]；但是復(fù)配組無(wú)顯著變化（P＞0.05）。這可能是因?yàn)閺?fù)配組中的蛋白酶將MP降解后，一定濃度的氯化鈣可參與小分子蛋白周圍水化層的形成，阻礙小分子蛋白質(zhì)的重新聚集[18]。上述現(xiàn)象均表明復(fù)配嫩化劑可以在短時(shí)間內(nèi)使MP降解成小分子蛋白質(zhì)，提高溶解度，且這種協(xié)同嫩化作用比單一嫩化劑更穩(wěn)定持久。

圖2 溶解度隨嫩化時(shí)間的變化Fig.2 Changes in myofibrillar protein solubility with tenderization time

2.3 SPC隨嫩化時(shí)間的變化

肉的可溶性蛋白主要由肌漿蛋白和肌紅蛋白等水溶性蛋白組成[21]，同時(shí)，MP被降解后也會(huì)增加SPC[13]，由圖3可知，4 種嫩化劑處理下的兔肉中SPC隨時(shí)間總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，中間略有波動(dòng)，這主要是因?yàn)樵诮菽刍幚磉^(guò)程中，位于細(xì)胞液中的一部分水溶性蛋白進(jìn)入嫩化液中[8]，同時(shí)由于嫩化劑對(duì)MP的降解作用，會(huì)增加肉中SPC，因此肉中SPC是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，總體而言，流失于溶液中的SPC比降解產(chǎn)生的量大。4 組中氯化鈣組的SPC最少，在0～120 min內(nèi)，其值下降幅度最大，從（7.26f 0.21）mg/mL下降到（4.27f 0.04）mg/mL，表明由MP解聚所產(chǎn)生的小分子蛋白量較少，說(shuō)明氯化鈣在這段時(shí)間內(nèi)降解MP的速度比其他3 組慢，后氯化鈣組SPC有小幅度增長(zhǎng)，表明120 min后，氯化鈣降解MP的速率略大于可溶性蛋白流失于溶液中的速度，直至二者達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；2 個(gè)蛋白酶組的SPC雖然總體呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，但2 組的SPC始終高于氯化鈣組和復(fù)配組，且下降幅度也較小，獼猴桃蛋白酶組和無(wú)花果蛋白酶組在第180和150分鐘分別達(dá)到最小值（6.21f 0.10）mg/mL和（6.06f 0.08）mg/mL，這是由于蛋白酶降解MP產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)補(bǔ)充了流失于溶液中的可溶性蛋白。復(fù)配組SPC在第120分鐘達(dá)到最小值為（5.61f 0.24）mg/mL，可見(jiàn)在復(fù)配組中，氯化鈣使MP結(jié)構(gòu)松散，蛋白酶可充分與作用位點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生大量可溶性蛋白，但同時(shí)可能因?yàn)橐徊糠挚扇苄缘鞍子捎诘鞍捉Y(jié)構(gòu)變疏松，更容易流失于溶液中，所以復(fù)配組SPC介于氯化鈣組和蛋白酶組之間。上述現(xiàn)象表明在降解早期，復(fù)配成分中的蛋白酶對(duì)SPC的增加起主要作用，在第90分鐘時(shí)，復(fù)配組與2 個(gè)蛋白酶組的差異不明顯，可以推測(cè)2 種蛋白酶復(fù)合使用其特異性比單一使用更小，降解作用更好，因?yàn)閺?fù)配組中總蛋白酶的含量比單一酶組的含量少。而在120 min后氯化鈣與蛋白酶的協(xié)同作用顯著，使復(fù)配組中SPC開(kāi)始增加。

圖3 SPC隨嫩化時(shí)間的變化Fig.3 Changes in SPC with tenderization time

2.4 表面疏水性隨嫩化時(shí)間的變化

表面疏水性反映蛋白質(zhì)中疏水性殘基在蛋白表面的分布情況，其變化可以反映出蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸殘基的相對(duì)含量，從而表征蛋白質(zhì)表面性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的變化情況[22]，表面疏水性越大，表明MP表面疏水性基團(tuán)越多。由圖4可知，復(fù)配組、氯化鈣組、獼猴桃蛋白酶組的表面疏水性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先增加后減小的趨勢(shì)，無(wú)花果蛋白酶組表面疏水性一直增加，說(shuō)明4 種嫩化劑均引起MP分子展開(kāi)，蛋白質(zhì)構(gòu)象變得疏松，穩(wěn)定性下降，原本聚集在非極性環(huán)境的蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露到外部極性環(huán)境中，導(dǎo)致表面疏水性基團(tuán)含量增加，從而表面疏水性增加[7]，后期表面疏水性降低，其原因可能是大量暴露的疏水性基團(tuán)導(dǎo)致MP表面疏水作用力增加，蛋白質(zhì)又聚集起來(lái)，從而降低了表面疏水性，這與MP溶解度所反映的情況一致。其中氯化鈣組比蛋白酶組的表面疏水性大，在第120分鐘達(dá)到最高值（118.43f 0.86）μg，一方面氯化鈣的離子作用較強(qiáng)，使肌球蛋白結(jié)構(gòu)疏散而展開(kāi)[12]，另一方面鈣離子可以降低非極性基團(tuán)轉(zhuǎn)移到水中所需要的自由能，促進(jìn)疏水基團(tuán)的暴露[18]；蛋白酶組則是通過(guò)降解作用使MP結(jié)構(gòu)發(fā)生變性而引起折疊打開(kāi)，分子結(jié)構(gòu)伸展，暴露疏水性殘基，后期被分解的小分子蛋白質(zhì)又重新聚合折疊[23]，其中獼猴桃蛋白酶在第90分鐘達(dá)到最大值（77.73f 1.11）μg，無(wú)花果蛋白酶最大值為（66.32f 0.58）μg，這種差異可能是由于2 種蛋白酶的作用位點(diǎn)不一致，對(duì)MP表面疏水基團(tuán)的影響程度不同，同時(shí)可以看出復(fù)配組的表面疏水性比其他組高，在第150分鐘達(dá)到（124.38f 0.54）μg，說(shuō)明蛋白酶和氯化鈣復(fù)配使用對(duì)MP結(jié)構(gòu)的改變比單獨(dú)使用時(shí)更顯著，復(fù)配組中的3 種嫩化劑有更好的協(xié)同作用，氯化鈣使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最大化展開(kāi)，2 種蛋白酶分別利用自己不同的底物特異性降解MP，促使折疊進(jìn)一步展開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生更大程度的變化，暴露出更多的疏水性氨基酸殘基。

圖4 表面疏水性隨嫩化時(shí)間的變化Fig.4 Changes in surface hydrophobicity with tenderization time

2.5 SDS-PAGE隨嫩化時(shí)間的變化

由圖5可知，未經(jīng)處理時(shí)（0 min），最明顯的蛋白條帶主要集中在180～245、140～180、100 kDa及75 kDa左右、30～45 kDa和低于25 kDa的區(qū)域。隨嫩化時(shí)間的延長(zhǎng)，4 組不同嫩化劑處理下的MP均發(fā)生了一定的變化。從圖5A可以看出，復(fù)配組中180～245 kDa條帶明顯變細(xì)，顏色變淡，這主要是由肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）降解導(dǎo)致的，肌球蛋白是肌肉中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，占MP的45%左右，MHC的分子質(zhì)量約200 kDa，它的降解與肉品嫩度呈顯著正相關(guān)[24]，此外100 kDa左右的C蛋白和15 kDa左右的肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）在第90分鐘時(shí)有明顯的降解現(xiàn)象，其條帶濃度降低并在后期逐漸消失，位于30～45 kDa的數(shù)條條帶也明顯變淡，但位于30 kDa左右的原肌球蛋白和45 kDa左右的肌動(dòng)蛋白條帶沒(méi)有顯著變化。從圖5B可以看出，氯化鈣組中140～245、30、45 kDa及75 kDa左右的條帶無(wú)明顯變化，100 kDa左右的C蛋白條帶在30～90 min內(nèi)變淺，后期顏色有所加深，只有分子質(zhì)量在15～25 kDa及30～45 kDa之間的蛋白有顯著的降解現(xiàn)象，表明氯化鈣對(duì)蛋白的降解作用是有限的。從圖5C可以看出，獼猴桃蛋白酶組中180～245 kDa的條帶在30～120 min內(nèi)明顯變細(xì)變淺，但在第150分鐘時(shí)條帶又有所增粗，表明獼猴桃蛋白酶對(duì)MHC有顯著降解作用，這與Liu等[25]的結(jié)果一致，但后期可能隨著嫩化的進(jìn)行，被降解的蛋白質(zhì)由于相互作用力又重新聚集在一起，此外，75 kDa左右蛋白條帶在第30分鐘左右就基本消失，但是其他蛋白條帶并沒(méi)有明顯的變化，表明獼猴桃蛋白酶的特異性較高。從圖5D可以看出，無(wú)花果蛋白酶組中，140～180、100 kDa左右、30～45 kDa以及25 kDa以下的蛋白條帶明顯變細(xì)變淺，而其他條帶無(wú)明顯變化，表明無(wú)花果蛋白酶對(duì)MLC、C蛋白的降解作用強(qiáng)烈?？傮w而言，復(fù)配組的MHC條帶變化程度比其他3 組更大，降解最顯著，且在最后條帶沒(méi)有發(fā)生顯著的增粗現(xiàn)象，說(shuō)明2 種蛋白酶和氯化鈣復(fù)合對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用比單獨(dú)使用效果更明顯且更穩(wěn)定，同時(shí)也可以說(shuō)明在復(fù)配成分中起降解蛋白作用的主要以2 種蛋白酶為主，并且這2 種蛋白酶對(duì)蛋白的降解具有不同的特異性，所以復(fù)合使用時(shí)可以結(jié)合的作用位點(diǎn)更廣，降解作用更顯著，結(jié)合其他指標(biāo)也可以推測(cè)氯化鈣的作用主要是使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定性從而展開(kāi)暴露出更多的酶結(jié)合位點(diǎn)，使酶解作用更充分。

圖5 SDS-PAGE隨嫩化時(shí)間的變化Fig.5 Changes in SDS-PAGE pattern with tenderization time

3 討論與結(jié)論

選取復(fù)配組MFI不再發(fā)生顯著變化（P＞0.05）的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，因?yàn)檠芯繉?duì)象為復(fù)配嫩化劑對(duì)兔肉的協(xié)同嫩化機(jī)理，而MFI可作為反映MP降解程度和肉品嫩化程度的指標(biāo)[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)配嫩化劑可以更顯著提高M(jìn)FI，這表明復(fù)配組在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)MP的降解和對(duì)肉品嫩度的提高比其他組更明顯。電泳圖譜也進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)配組具有更高的嫩化效率，可以看到在嫩化至第90分鐘時(shí)，復(fù)配組中大分子蛋白質(zhì)條帶已經(jīng)明顯變淺變窄。蛋白質(zhì)表面疏水性先增加后減小的變化趨勢(shì)表明，在嫩化過(guò)程中，MP結(jié)構(gòu)先展開(kāi)后聚集，復(fù)配組疏水性最高，說(shuō)明復(fù)配組蛋白質(zhì)展開(kāi)程度最大，暴露出了更多的疏水性氨基酸殘基，氯化鈣組比其他2 種單一酶組更能有效提高表面疏水性，說(shuō)明氯化鈣在復(fù)配嫩化劑中的作用主要以改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為主，而且關(guān)于氯化鈣通過(guò)改變蛋白結(jié)構(gòu)，提高蛋白表面疏水性的研究也早有報(bào)道[27]，推測(cè)其機(jī)理一方面由于氯化鈣靜電相互作用，即增加電荷間排斥作用，使Z盤機(jī)械性斷裂[28]，另一方面，因?yàn)樵趧?dòng)物死后，m-蛋白酶比μ-蛋白酶保留時(shí)間更久[29]，故外源Ca2+也可通過(guò)激活m-鈣蛋白酶，作用于部分骨架蛋白和肌鈣蛋白T，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定性[30]，但鈣蛋白酶的降解作用有限，對(duì)肌球和肌動(dòng)蛋白的作用不明顯，這與電泳圖譜中觀察到的氯化鈣組發(fā)生變化的條帶主要以肌鈣蛋白T為主相一致。MP溶解度和肌原纖維降解度呈正相關(guān)[31]，復(fù)配組的溶解度最高，其次為2 種蛋白酶，同時(shí)SPC可以反映出流失到嫩化劑中的水溶性蛋白含量和肌原纖維被降解所產(chǎn)生的可溶性小分子蛋白質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，氯化鈣組的溶解度和SPC顯著低于2 個(gè)單一酶組，表明蛋白酶在復(fù)配嫩化劑中的主要作用以降解MP為主，電泳圖譜還表明了2 種酶具有不同的酶解特異性。

復(fù)配嫩化劑的組成成分有一定協(xié)同作用，根據(jù)指標(biāo)變化判斷機(jī)理是氯化鈣使MP結(jié)構(gòu)松散并展開(kāi)，暴露出更多酶結(jié)合位點(diǎn)，使2 種酶的降解作用更強(qiáng)烈，同時(shí)2 種蛋白酶的特異性不同，結(jié)合使用可以使降解作用更廣泛，降解效率更高。