食用植物酵素中酵母菌的分離鑒定及耐受性研究

徐成龍，王珍珍，余瞻，王高堅(jiān)，馮哲校，史文超，沙如意*，毛建衛(wèi),2*

1(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同中心，浙江 杭州, 310023)2(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興, 312000)

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類(lèi)、海藻類(lèi)、食藥兩用本草類(lèi)等食材為原料，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，具有豐富的活性成分、益生菌及次生代謝產(chǎn)物等。研究表明該類(lèi)產(chǎn)品不僅具有抗氧化、抗炎的作用，而且具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及抗癌等多種保健功能[1-4]。

酵母菌是一類(lèi)以芽殖為主的單細(xì)胞真核微生物，在自然界分布廣泛，主要生活在偏糖和偏酸環(huán)境中，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中。在葡萄酒工業(yè)中釀酒酵母的最適pH值通常在3.0～3.6[5]，在酵素發(fā)酵過(guò)程中其發(fā)酵液具有高糖低pH的特點(diǎn)。所以酵母菌耐受性的強(qiáng)弱直接影響到了產(chǎn)品的周期和風(fēng)味[6]。從自然發(fā)酵的酵素產(chǎn)品中分離出酵母菌，研究其在高糖和低pH條件下的耐受性對(duì)于研究酵素的發(fā)酵機(jī)理、功能成分、產(chǎn)品生產(chǎn)、飲料及發(fā)酵產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制等方面具有重要意義。

本研究從茶葉酵素，烏飯樹(shù)葉酵素，鐵皮石斛花酵素，紫蘇酵素和火龍果酵素原液中分離出7株酵母菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)及 26S rDNA 序列分析等，對(duì)篩選菌株進(jìn)行菌種鑒定，通過(guò)耐高糖實(shí)驗(yàn)和耐低 pH 實(shí)驗(yàn)，對(duì)分離出菌株的耐受性進(jìn)行考察，旨在為植物酵素的發(fā)酵過(guò)程研究、工業(yè)化生產(chǎn)提供菌種方面基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵一年半的茶葉酵素、烏飯樹(shù)葉酵素、鐵皮石斛花酵素、火龍果酵素和紫蘇酵素原液，由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、溴鉀酚紫、海藻糖、甘露糖、果糖、棉子糖、可溶性淀粉、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；固藍(lán)B、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaCl，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海，中國(guó))；氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基和碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，美國(guó)BD公司。

MB-150CL恒溫恒濕培養(yǎng)箱，青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；SW-CJ超凈工作臺(tái)，無(wú)錫易純凈化設(shè)備有限公司；TS-2102C小型立式恒溫?fù)u床，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；SMART光學(xué)顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；Allegra X-12R冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Spectra Max 190酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

YEPD培養(yǎng)基：酵母浸出粉1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，純水100 mL，pH 6.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，水100 mL，16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液0.2 mL，pH 7.6，20 g 碳源(海藻糖、甘露糖、果糖、棉子糖、可溶性淀粉、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖)，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

無(wú)維生素培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，(NH4)2SO40.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，NaCl 0.01 g，加水至100 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min[7]。

300、450、600、750、900 g/L高糖培養(yǎng)基的配制：酵母浸粉1 g，蛋白胨2 g，分別加入葡萄糖30、45、60、75、90 g，水定容至100 mL，pH 5.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

低pH培養(yǎng)基：酵母浸出粉1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，水100 mL，分別調(diào)pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5后，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的分離純化

吸取茶葉酵素、烏飯樹(shù)葉酵素、火龍果酵素、紫蘇酵素、鐵皮石斛花酵素原液，用梯度稀釋法稀釋后涂布于YEPD培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，用劃線(xiàn)分離法將酵母菌分離純化至單菌落，直至在顯微鏡下觀察到純菌株為止，將純化好的菌株于斜面低溫冷藏保存。

1.3.2 形態(tài)培養(yǎng)特征觀察

將單菌落接種到Y(jié)EPD固體、液體培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落大小、顏色，菌落凹凸程度，菌落的質(zhì)地，記錄菌體所在位置，有無(wú)菌醭、沉淀、渾濁，并于光學(xué)顯微鏡1 000倍油鏡下觀察其菌體形態(tài)、形狀、繁殖方式并且測(cè)量其菌體大小。

1.3.3 生理生化特征鑒定

酵母菌生理生化特征鑒定:依據(jù)《酵母菌的特征及鑒定手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》設(shè)計(jì)，主要包括：糖發(fā)酵鑒定[8]、碳源同化實(shí)驗(yàn)[9]、氮源同化實(shí)驗(yàn)[10]、無(wú)維生素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、耐高滲透壓的測(cè)試、產(chǎn)生類(lèi)淀粉化合物測(cè)定、單寧分解利用實(shí)驗(yàn)[11]、脲酶實(shí)驗(yàn)[12]、重氮基藍(lán)B實(shí)驗(yàn)[13]等。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

1.3.4.1 26S rDNA 序列測(cè)定

在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3.4.2 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，從https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/[14]中選擇DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索(basic local alignment search tool)，匹配得到與供試菌菌株的序列相似的已知菌株的序列。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，使用bio-edit軟件將供試菌序列和已知菌株序列進(jìn)行多序列對(duì)位排列，并采用MEGA 7.0軟件中Neighbour-Joining方法[15]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.5 耐受性試驗(yàn)

1.3.5.1 高糖耐受性試驗(yàn)

將菌種在液體YEPD培養(yǎng)基中活化12～16 h，制成106CFU/mL的菌懸液，按3%的接種量，分別接種于起始葡萄糖質(zhì)量濃度為300、450、600、750、900 g/L的YEPD液體培養(yǎng)基中，pH 5.0，于28 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，每12 h取1次樣，將樣品于10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液，用無(wú)菌水重懸沉淀旋渦混勻后測(cè)定OD600，每個(gè)濃度重復(fù) 3 次。

1.3.5.2 低pH耐受性試驗(yàn)

將菌種在液體YEPD培養(yǎng)基中活化12～16 h，制成106CFU/mL的菌懸液，按3%接種量接種于pH值為3.5、3.0、2.5、2.0、1.5的YEPD 液體培養(yǎng)基中[16]。于28 ℃，150 r/min培養(yǎng)5 d，每12 h取1次樣，將樣品于10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液，用無(wú)菌水重懸沉淀旋渦混勻后測(cè)定OD600，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.3.5.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于得到的OD600使用Microsoft Office Excel 2010處理，結(jié)果表示為Mean±SD形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化、形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

從高糖、低 pH 的發(fā)酵液中，篩選具有典型酵母菌特征的菌落，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和顯微鏡檢，從茶葉酵素中分離到2株菌Y1、Y2，從鐵皮石斛花酵素中分離到1株菌Y3，從烏飯樹(shù)葉中分離到2株菌Y4、Y5，從紫蘇酵素中分離到1株菌Y6，從火龍果酵素中分離出1株菌Y7。7 株供試菌在固體、液體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見(jiàn)表1，顯微鏡檢圖片如圖1所示。初步表明該菌株符合酵母菌細(xì)胞形態(tài)特征。

表1 七株供試菌的菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of 7 yeast strains

圖1 七株供試菌1 000倍顯微鏡檢圖Fig.1 Microscope photos of 7 tested strains(1 000×)

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株的生理生化特征

7株菌的生理生化特征見(jiàn)表2。綜合上述生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《酵母菌的特征鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》，初步判斷Y1、Y2、Y3、Y5屬于接合酵母屬，Y4、Y6屬于酵母屬，Y7屬于畢赤酵母屬。

表2 七株供試菌生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 7 tested strains

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

利用NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)一對(duì)引物擴(kuò)增7株供試菌26S rDNA近5′端的D1/D2 區(qū)域，得到約590～1 420 bp片段，供試菌的26S rDNA D1/D2區(qū)電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 七株供試菌的26S rDNA D1/D2區(qū)電泳結(jié)果Fig.2 Target gene electrophoresis of 7 tested strains

7株菌序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示Y1、Y2、Y3與魯氏接合酵母的同源相似性均高于99%，Y4、Y6與釀酒酵母的同源相似性均高于99%，Y5與二孢接合酵母的同源相似性高于99%，Y7與異常威克漢姆酵母的同源相似性高于99%。同源菌株基因用MEGA7軟件處理得到系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖3所示。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree

從圖3可以看出，Y1、Y2和Y3與魯氏接合酵母形成一個(gè)分支，驗(yàn)證可信度達(dá)到100%，Y4、Y6與釀酒酵母形成一個(gè)分支，驗(yàn)證可信度達(dá)100%，Y5與二孢接合酵母形成一個(gè)分支，驗(yàn)證可信度達(dá)100%，Y7與異常威克漢姆酵母形成一個(gè)分支，驗(yàn)證可信度達(dá)100%，初步確定Y1、Y2、Y3是魯氏接合酵母，Y4、Y6是釀酒酵母，Y5是二孢接合酵母，Y7是異常威克漢姆酵母。

2.3 耐受性試驗(yàn)

2.3.1 高糖耐受性試驗(yàn)

Y1～Y7七株菌的高糖耐受性試驗(yàn)如表3所示，7株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本符合微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的增大，7株菌的延滯期不斷延長(zhǎng)且7株菌均不能在900 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Y1～Y7分別在經(jīng)過(guò)了60、48、72、84、72、60 h的延滯期后，可在750 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Y4僅能在經(jīng)過(guò)了24 h的延滯期后，可在450 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

表3 七株供試菌高質(zhì)量濃度葡萄糖條件下光密度值變化Table 3 Changes in optical density of 7 tested strains under high concentration of glucose

WANG等[17]考察了高糖環(huán)境對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著糖含量的增加，魯氏接合酵母的生長(zhǎng)速率降低，培養(yǎng)基中菌體濃度也降低，表明菌種的生長(zhǎng)受到抑制；YAL?IN等[18]研究表明，釀酒酵母可以在20～300 g/L高糖環(huán)境下生長(zhǎng)，初始糖濃度越高，釀酒酵母的干重越低，表明菌種的生長(zhǎng)受到抑制程度越高；李夢(mèng)琦等[19]的研究表明400 g/L葡萄糖對(duì)魯氏接合酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用。

2.3.2 低pH耐受性試驗(yàn)

Y1～Y7七株菌的低pH耐受性試驗(yàn)如表4所示，7株菌整體基本符合微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，隨著pH的降低，7株菌的延滯期不斷延長(zhǎng)，且僅Y6、Y7在經(jīng)過(guò)了96、84 h的延滯期后能在pH 1.5的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Y1、Y2分別在經(jīng)過(guò)了36、12 h的延滯期后，可在pH 2.5的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Y3、Y4、Y5僅能在經(jīng)過(guò)12 h 的延滯期后，在pH 3.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

表4 七株供試菌低pH條件下光密度值變化Table 4 Changes in optical density of 7 tested strains under low pH

續(xù)表4

YAN等[20]發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基酸度的增加，釀酒酵母的生物量越低；AKINORI等[21]研究表明，培養(yǎng)基pH<2.5，pH越低釀酒酵母的生長(zhǎng)受抑制程度越高，其延滯期越長(zhǎng)；章之柱等[22]研究表明pH<3.5時(shí)，pH對(duì)菌株生長(zhǎng)影響較大，與本研究結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

從茶葉酵素中篩選到2株菌Y1、Y2；從鐵皮石斛花酵素中篩選到1株菌Y3；從烏飯樹(shù)葉中篩選到2株菌Y4、Y5；從紫蘇酵素中篩選到1株菌Y6；從火龍果酵素中篩選出1株菌Y7。Y1、Y2、Y3與魯氏接合酵母的同源相似性均高于99%；Y4、Y6與釀酒酵母的同源相似性均高于99%；Y5與二孢接合酵母的同源相似性高于99%；Y7與異常威克漢姆酵母的同源相似性高于99%。Y1、Y2、Y3、Y5的最高耐受初始葡萄糖質(zhì)量濃度為750 g/L，Y4最高耐受初始葡萄糖質(zhì)量濃度為450 g/L，Y6、Y7的最高耐受初始葡萄糖質(zhì)量濃度為600 g/L；初始葡萄糖含量越高，酵母菌的延滯期越長(zhǎng)，酵母菌生長(zhǎng)受到抑制程度越高，所有菌株均不能在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為900 g/L時(shí)生長(zhǎng)。Y1、Y2的最低耐受初始pH值為2.5，Y3、Y4、Y5的最低耐受初始pH值為3.0、Y6、Y7的最低耐受初始pH值為1.5，培養(yǎng)基初始pH越低，酵母菌延滯期越長(zhǎng)，酵母菌生長(zhǎng)受到抑制程度越高。