風(fēng)輪菜總黃酮聯(lián)合miR-702-5p抑制物對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

張 寧，馬 競(jìng)，武國(guó)利

0 引言

缺血后再灌注是急性心肌梗死、缺血性心肌病等重要治療手段，而缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重阻礙了其療效[1-2]。因此，減少或抑制缺血再灌注損傷對(duì)臨床治療相關(guān)心血管疾病具有重要意義。研究表明，中藥治療心肌缺血再灌注損傷療效顯著，可通過(guò)抗氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制心肌細(xì)胞凋亡等保護(hù)心肌細(xì)胞損傷[3-5]。風(fēng)輪菜是唇形科風(fēng)輪菜屬植物，黃酮是其主要活性成分，風(fēng)輪菜活性部位具有抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[6-7]。研究顯示，miRNA在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，可作為診斷心血管疾病的敏感生物標(biāo)志物[8]。如抑制miR-30c-2-3p可減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[9]。在自噬性心肌保護(hù)中，Notch1信號(hào)通路中miR-702-5p差異表達(dá)，其可能在自噬性心肌保護(hù)中發(fā)揮重要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型，研究風(fēng)輪菜總黃酮聯(lián)合miR-702-5p對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司；P21(貨號(hào)：bs-10129R-1)、Caspase-3抗體(貨號(hào)：bs-0081R-1)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP(貨號(hào)：F030212-EBU)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；Annerxin V/FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；MDA、LDH、CAT、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京麥瑞博生物科技有限公司。

1.2 風(fēng)輪菜總黃酮的制備 風(fēng)輪菜購(gòu)自本地中草藥店，經(jīng)本院中西醫(yī)結(jié)合科主任路克文醫(yī)師鑒定為風(fēng)輪菜，取其莖葉洗凈，干燥至恒重后粉碎，取20 g加入適量90%乙醇，超聲波提取風(fēng)輪菜總黃酮，得萃取液，過(guò)濾后收集濾液，測(cè)定濃度后稀釋至所需濃度備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧/復(fù)氧(H/R)模型建立 心肌細(xì)胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞先在95%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)6 h，然后復(fù)氧3 h，更換培養(yǎng)基在正常條件下培養(yǎng)，建立H/R模型，對(duì)照組(Con)一直在常規(guī)條件下培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞處理與分組 分別用濃度為0、1.563、3.125、6.250、9.375、12.500、18.750、25.000、28.125、31.250 μg/ml的風(fēng)輪菜總黃酮處理H9c2細(xì)胞12 h，然后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，以檢測(cè)風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用。

分別用濃度為6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml的風(fēng)輪菜總黃酮處理H9c2細(xì)胞12 h，然后按照1.3中方法進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為H/R+藥物-1組、H/R+藥物-2組、H/R+藥物-3組；將anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分別轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，記為H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-702-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-702-5p分別轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后，用25 μg/ml風(fēng)輪菜總黃酮處理12 h，再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為H/R+藥物-3+anti-miR-NC組、H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組。anti-miR-NC序列：CGAGGGTCTGGCAAGGAGGGA；anti-miR-702-5p序列：GAGCGGGGTAAAGGGTGGGCA。

1.5 Western blot檢測(cè)P21、Caspase-3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行定量。取50 μl蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗P21(1∶800)、Caspase-3(1∶800)，4 ℃過(guò)夜，加入二抗山羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000)室溫培養(yǎng)1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達(dá)水平=目的條帶和GAPDH條帶的比值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 試劑盒檢測(cè)MDA含量及LDH、CAT、SOD活性 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-702-5p表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-702-5p以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-702-5p上游引物序列：5′-TCGGCAGGGAGCGGGGTA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 用不同濃度的風(fēng)輪菜總黃酮處理心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，各濃度風(fēng)輪菜總黃酮處理的心肌細(xì)胞的存活率無(wú)顯著差異，說(shuō)明風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)正常心肌細(xì)胞無(wú)毒性(表1)。

表1 風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組相比，H/R組miR-702-5p表達(dá)水平升高，P21、Caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與H/R組相比，各濃度風(fēng)輪菜總黃酮處理組miR-702-5p表達(dá)水平降低，P21、Caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表2 風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

圖1 風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響注：A.風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響；B.P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

2.2 風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，H/R組MDA含量升高，LDH活性升高，CAT、SOD活性降低(P<0.05)；與H/R組相比，各濃度風(fēng)輪菜總黃酮處理組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達(dá)的影響

2.3 干擾miR-702-5p的轉(zhuǎn)染效率 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-702-5p組miR-702-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 miR-702-5p的表達(dá)

2.4 干擾miR-702-5p表達(dá)聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 H/R+anti-miR-NC組相比，H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組P21、Caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組相比，H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組P21、Caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2，表5)。

表5 干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

圖2 干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響注：A.干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響；B.P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

2.5 干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達(dá)的影響 與H/R+anti-miR-NC組相比，H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)；與H/R+anti-miR-702-5p組和H/R+藥物-3+anti-miR-NC組相比，H/R+藥物-3+anti-miR-702-5p組MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高(P<0.05)(表6)。

表6 過(guò)表達(dá)、干擾miR-702-5p聯(lián)合風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LDH、MDA、CAT、SOD表達(dá)的影響

3 討論

大量氧自由基的產(chǎn)生是缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一，而中藥具有抗心肌缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷的作用[11-14]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物含量可反映機(jī)體損傷程度；過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是機(jī)體清除自由基的酶，有抗氧化作用[15]。乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)是糖無(wú)氧代謝的關(guān)鍵酶，細(xì)胞膜受損時(shí)，LDH可漏出細(xì)胞外，因此，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性可間接反映細(xì)胞受損程度[16]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度風(fēng)輪菜總黃酮預(yù)處理后，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中P21、Caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。說(shuō)明風(fēng)輪菜總黃酮可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡；風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用。

研究表明，miRNA與應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡有關(guān)，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[17]。敲低心肌細(xì)胞miR-497可改善缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷[18]。miR-214可減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-702-5p表達(dá)水平顯著升高，提示miR-702-5p可能與缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-702-5p的干擾表達(dá)載體，研究抑制miR-702-5p表達(dá)是否對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，結(jié)果顯示，抑制miR-702-5p表達(dá)后，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中P21、Caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，MDA含量降低，LDH活性降低，CAT、SOD活性升高。說(shuō)明抑制miR-702-5p表達(dá)可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-702-5p干擾表達(dá)載體或單獨(dú)用風(fēng)輪菜總黃酮處理，細(xì)胞凋亡率顯著降低，氧化應(yīng)激水平也顯著降低。表明兩者聯(lián)合作用對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用更顯著。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，風(fēng)輪菜總黃酮單獨(dú)處理后，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-702-5p表達(dá)水平顯著降低，提示風(fēng)輪菜總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與降低miR-702-5p的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，風(fēng)輪菜總黃酮聯(lián)合抑制miR-702-5p表達(dá)可保護(hù)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。