PPP2R3A 基因在乙肝相關性肝癌中的表達及臨床意義

何佳佳，王培曉，矯寧，邱爽，朱雄偉，吳鳳東，張慶（.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心器官移植科，北京 0009，2.安徽醫(yī)科大學，安徽 合肥 2002，.河南省兒童醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 45008）

肝癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其中肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的類型，約占原發(fā)性肝癌的85% ～ 90%［1-3］。在我國約 80%以上的 HCC 患者為乙肝相關性肝癌，但其具體的發(fā)病機制尚未明確。PPP2R3A 是蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的一個調(diào)節(jié)亞基，既能參與PP2A 的活性調(diào)節(jié)，還參與腫瘤相關信號蛋白的調(diào)節(jié)。有研究顯示PPP2R3A-PP2A 全酶呈現(xiàn)出類似于原癌基因作用，并可能影響腫瘤細胞的侵襲能力［4］。但是目前關于PPP2R3A 與乙肝相關性肝癌的相關研究尚無報道。本研究旨在探索PPP2R3A 在乙肝相關性肝癌中的表達及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料：收集2009-2012 年在解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心行肝移植的70 例乙肝相關性肝癌和40 例良性肝病患者的病肝組織和外周血標本，所有乙肝相關性肝癌患者均經(jīng)病理及血清學證實。70 例乙肝相關性肝癌組織為研究組，40 例良性肝病（包括乙肝肝硬化25 例、丙肝肝硬化3 例、肝豆狀核變性4 例、自身免疫性肝病3 例、膽汁淤積性肝硬化3 例、布加綜合征1 例和酒精性肝病1 例）和5 例正常肝組織作為對照組。收集70 例肝癌患者的臨床資料，包括腫瘤大小、TNM 分期、Child-Pugh 分級、術前血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）值、病理分期等，其中男性67 例，女性3 例，年齡為30 ～ 69 歲，中位年齡為53 歲。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑：抗體PPP2R3A 試劑盒購自美國Sigma 公司；二步法檢測試劑盒和第二抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于上海藍基生物科技有限公司。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 免疫組織化學染色法：選取乙肝相關性肝癌、良性肝病、供體肝組織病理切片分別70、40、5 張，標本均經(jīng)40 g/L 中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片，然后按照免疫組織化學二步法試劑說明書進行免疫組織化學染色。一抗采用PPP2R3A 抗體（Sigma 公司），濃度為 1：200，二抗采用山羊抗兔IgG 抗體（中杉金橋公司），以羊血清替代一抗作為陰性對照。

染色結果的判定標準：評分采用著色深淺和陽性細胞比例相結合的方法，無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性細胞數(shù)＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分；染色強度分數(shù)和陽性細胞百分比分數(shù)相乘得到染色分數(shù)，0 分為陰性，1 ～3 分為 +，4 ～ 6 分為 ++，7 ～ 9 分為 +++。

1.2.2.2 ELISA 法：從免疫組化中-強陽性表達患者中挑選30 例肝癌患者和15 例良性肝病患者的血清標本，從-80℃冰箱中取出逐步解凍，按照試劑盒說明書步驟進行實驗操作，酶標儀調(diào)至450 nm讀數(shù)，讀取樣本吸光度（OD 值），繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣本中PPP2R3A 蛋白的表達濃度。

1.3 倫理學：本研究符合醫(yī)學倫理學標準，得到醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：2014012）。

1.4 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 25 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用平均值±標準偏差（±s）表示，兩組間定性資料的比較采用Pearson 卡方檢驗，定量資料的比較采用兩相關樣本W(wǎng)ilcoxon 秩檢驗及兩獨立樣本Mann-Whitney U 秩和檢驗，相關性分析采用Spearman 等級相關檢驗，P ＜0.05 認為結果有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中的表達情況：PPP2R3A 陽性結果為棕黃色顆?；驁F塊，主要定位于細胞胞質(zhì)，部分表達在胞膜上（圖1A，圖1B）。在70 例乙肝相關性肝癌組織中，PPP2R3A陽性表達率100%（70/70），其中中-強陽性表達率占68.6%（48/70），癌周組織中PPP2R3A 陽性表達率44.3%（31/70），其中呈中- 強陽性表達率只有12.8%（9/70），統(tǒng)計學分析顯示：PPP2R3A 蛋白在癌組織的表達顯著高于其癌周組織（P ＜ 0.001），見表 1。

圖1 PPP2R3A 在不同肝組織中的表達與定位

2.2 PPP2R3A 蛋白在良性肝病組織中的表達情況：PPP2R3A 蛋白在良性肝病中主要表達定位于細胞質(zhì)（圖1C），部分表達于胞膜和胞核，陰性表達和弱陽性表達占65%（26/40），無強陽性表達，詳見表1。其中，PPP2R3A 蛋白在乙肝肝硬化組織中的陽性（++）表達率占40%（10/25），丙肝肝硬化組織占 33%（1/3），非病毒性良性肝病組織占25%（3/12）。PPP2R3A 蛋白在嗜肝病毒性肝病組織中的表達率高于非病毒性肝病組織。PPP2R3A 蛋白在正常肝組織的表達多數(shù)呈中等陽性（表1），主要定位于細胞胞質(zhì)。統(tǒng)計學分析顯示：PPP2R3A 蛋白在肝癌組織的表達顯著高于良性肝?。≒ ＜ 0.001）。

2.3 PPP2R3A 蛋白在肝癌和良性肝病患者血清中的表達（表2）： 根據(jù)ELISA 標準曲線（圖2）計算各樣本的蛋白量，結果顯示在肝癌患者血清中PPP2R3A 蛋白的表達水平為（13.40±6.73） ng/ml，而在良性肝病患者血清中PPP2R3A 蛋白的表達水平為（10.11±2.36） ng/ml，通過秩和檢驗得到P 值為0.033，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 ELISA 法檢測PPP2R3A 蛋白在血清表達的標準曲線

2.4 PPP2R3A 表達與肝癌臨床病理特征的關系（表3）：PPP2R3A 的表達強度與肝癌AFP 值（r ＝0.256，P ＝ 0.032）呈正相關性。PPP2R3A表達強度與年齡、性別、Child-Pugh 評分、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、TNM-t、包膜侵犯、血管侵犯、淋巴結浸潤、HBeAg、HBV-DNA 以及病理分期指標無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）。

3 討 論

PPP2R3A 基因?qū)儆贐″/PR72 家族，該基因位于3q22.2-q22.3，主要編碼2 個成員，即PR130和 PR72［5］。PR130 和 PR72 具有各自特異性的 N-基末端，和共同的C-末端，C-末端包含兩種結構域，即一個保守的疏水基序和2 個參與鈣離子結合的EF 結構域（EF1、EF2），這些結構域提供了與結構亞基結合的交互界面、PR72 的核內(nèi)定位以及Ca2+依賴性磷酸酶活性的刺激作用［5］。PP2A 屬于絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族，參與調(diào)控許多細胞生命活動、生物學功能和信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)，而調(diào)節(jié)亞基B 能影響酶的活性，在底物特異性和亞細胞定位中具有重要作用［5-6］。目前研究發(fā)現(xiàn) PP2A在肺臟、直腸、乳腺、皮膚和子宮等多種部位腫瘤中都出現(xiàn)了亞基的突變，而PPP2R3A 參與了結腸癌、前列腺癌和淋巴細胞白血病等的發(fā)生、發(fā)展。但PPP2R3A 基因與肝癌的關系尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 基因可能通過調(diào)控p53、β-catenin 蛋白的表達促進肝癌細胞的增殖及侵襲，通過Caspase 凋亡途徑抑制細胞凋亡，與肝癌有一定的關聯(lián)，但其在乙肝相關性肝癌與良性肝病中的表達及分布情況尚不清楚，本研究進一步利用大樣本分析PPP2R3A 蛋白在乙肝相關性肝癌與良性肝病中的表達情況及其與肝癌臨床病理學特征的關系。

表1 PPP2R3A 在不同肝組織中的表達情況

表2 PPP2R3A 在血清中的表達情況（±s）

表2 PPP2R3A 在血清中的表達情況（±s）

組別 例數(shù)（例） 血清PPP2R3A 表達量（ng/ml） 統(tǒng)計結果肝癌 30 13.40±6.73 P ＝ 0.033良性肝病 15 10.11±2.36

表3 PPP2R3A 的表達與臨床病理因素的關系

本研究顯示PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中主要定位于細胞胞質(zhì)，僅部分表達于胞膜。在良性肝病中PPP2R3A 蛋白也主要定位于細胞胞質(zhì)，少量表達于胞膜。有研究結果顯示PPP2R3A 的亞型PRl30 能使SHIP2 重新分布于細胞膜，與其結合后能抑制表皮生長因子受體的降解，而表皮生長因子受體在多種腫瘤中呈現(xiàn)出促腫瘤生長效應，因此細胞質(zhì)與細胞膜是該基因發(fā)揮生物學功能的關鍵部位［7］。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中的表達明顯高于其癌周組織的表達，亦顯著高于其在良性肝病的表達。ELISA 結果也發(fā)現(xiàn)在肝癌患者血清中PPP2R3A 蛋白的表達量高于其在良性肝病患者中的表達量。并且我們前期研究中的Western Blot 實驗也顯示， PPP2R3A 蛋白在肝癌組織中的表達高于其癌周組織。說明PPP2R3A 基因在肝癌組織中呈過表達。其表達上調(diào)可能與肝癌的發(fā)生有關。

本研究分析PPP2R3A 的表達與肝癌臨床病理因素之間的關系，發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 高表達與肝癌血清AFP 含量具有顯著相關性。AFP 是一種由卵黃囊和胎兒肝臟產(chǎn)生的參與多種物質(zhì)轉(zhuǎn)運的糖蛋白，屬于α 球蛋白，位于第4 對染色體上（4q11-q21），分子量約為 64 000 ～ 72 000［8］。AFP 在胚胎時期濃度較高，生理情況下人體內(nèi)水平低于20 μg/L，當肝臟發(fā)生癌變時，AFP 可以被激活呈高水平表達［9］。AFP 的生物學功能復雜，有研究顯示AFP對腫瘤細胞增殖作用及腫瘤逃逸機體免疫功能均有影響［8］。而在HCC 的細胞增殖階段和細胞凋亡階段中，AFP 通過改變p53/Bax/cytochrome c/caspase-3 信號傳導通路正向調(diào)節(jié)肝癌細胞的增殖［9］。并且有研究發(fā)現(xiàn)AFP 通過激活PI3K/AKT信號通路在促進HCC 的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移方面起著關鍵作用［10］。血清AFP 作為肝癌的特異性標志物，與超聲檢查結合，對早期肝癌的診斷具有重要意義。AFP 不僅是肝癌發(fā)生的標志物，同時也與肝癌的大小、數(shù)量、侵襲、癌栓形成、肝外轉(zhuǎn)移、復發(fā)率和生存期等密切相關，越來越多的研究證實AFP值與HCC 腫瘤體積、微血管侵襲關系密切，三者均是影響肝癌治療療效、生存率的重要因素［9-12］。本研究發(fā)現(xiàn)AFP 含量越高，PPP2R3A 的表達量越高，因此認為PPP2R3A 基因可能與AFP 存在某種聯(lián)系，為研究兩者在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的關系提供新的思路。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)過表達PPP2R3A 能引起肝癌細胞早期凋亡的減少，抑制肝癌細胞的凋亡，促進肝癌細胞的增殖，誘導肝癌細胞由G 期向S 期轉(zhuǎn)變；經(jīng)transwell 小室實驗還發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 能促進肝癌 Huh-7 細胞的遷移和侵襲能力［7，13］。并且有研究顯示PPP2R3A 的亞型PR130 能影響腫瘤細胞的遷移能力［4］，Lin 等和Jin 等亦發(fā)現(xiàn)β-catenin在過表達PPP2R3A 基因的肝癌細胞中表達增多，而Wnt / β-catenin 信號通路的激活通常與肝細胞癌的轉(zhuǎn)移有關，β-catenin 的上調(diào)能促進HCC細胞的增殖和遷移能力［14-15］。因此，我們認為PPP2R3A 基因可能參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。但本研究尚未發(fā)現(xiàn)PPP2R3A 的表達與肝癌的TNM、病理分期及VM 等臨床病理指標有顯著相關性，可通過擴大樣本量進一步分析。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)了PPP2R3A 蛋白在肝癌與良性肝病患者中的表達存在顯著差異性，且與肝癌臨床腫瘤特征（AFP）有相關性。因此，我們提出PPP2R3A 基因過表達可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關，可能成為一種潛在的肝癌診斷指標和治療靶點，但PPP2R3A 基因參與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機制和應用價值還需進一步研究。