山羊痘病毒SS株5個(gè)ANK基因缺失的重組病毒構(gòu)建

楊勇飛，張 成，張雪萍，童劍軍，高 娜,李有文*

（1．塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3．塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

山羊痘是由山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。本病以發(fā)熱、無(wú)毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹及淋巴結(jié)病變?yōu)橹饕卣?，被世界?dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病[1-3]。山羊痘病毒為DNA病毒，約150 kb，呈線形，A、T含量為75%。中部是核心編碼區(qū)域，編碼與病毒生長(zhǎng)繁殖等重要蛋白有關(guān)的基因；兩端為側(cè)翼序列，編碼與病毒毒力因子和宿主范圍蛋白有關(guān)的基因在基因組側(cè)翼序列中有5個(gè)ANK錨定蛋白樣基因?；蚪M的最末端是兩條鏈交叉連接的發(fā)卡環(huán)，緊接著由兩套獨(dú)特序列隔開的串聯(lián)排列的多拷貝的重復(fù)序列（綿羊痘病毒為46 bp、塊狀皮膚病病毒5 bp、山羊痘病毒中未發(fā)現(xiàn)），然后是編碼多肽的序列。羊痘病毒對(duì)宿主的選擇非常嚴(yán)格，綿羊痘只感染綿羊，山羊痘只感染山羊，很少發(fā)生交叉感染[4]。近年來(lái)羊痘病毒出現(xiàn)交叉感染，甚至出現(xiàn)感染人的報(bào)道，說(shuō)明病毒的宿主范圍發(fā)生了改變[5-6]。病原的宿主嗜性發(fā)生改變有2種可能：一是病原的毒力增強(qiáng)；二是病原的宿主范圍基因改變。ANK基因可能與病毒感染宿主范圍有關(guān)。為了解羊痘跨物種感染與錨定蛋白的關(guān)系，從試驗(yàn)角度研究錨蛋白是否具有宿主范圍因子的功能及其機(jī)理，用融合PCR方法和Overlap PCR方法構(gòu)建不同羊痘病毒ANK基因缺失的轉(zhuǎn)移載體，并且通過(guò)基因同源重組得到ANK基因缺失重組羊痘病毒以確認(rèn)ANK基因?qū)Σ《舅拗鞣秶x擇的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

毒株與菌株：山羊痘病毒（來(lái)自新疆南疆2010年流行的羊痘分離株）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pEGFP質(zhì)粒，均由塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ、dNTP、DL-2 000 Marker、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；二甲基亞砜購(gòu)自VETEC公司；1∶250胰蛋白酶、氨芐霉素、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自Blosharp生物科技有限公司；pEASY-T1載體、DNA/RNA病毒提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已經(jīng)在GenBank上發(fā)表的羊痘病毒基因全序列（登錄號(hào)為NC_004003.1），用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)5對(duì)錨蛋白 ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145基因的特異性引物，見(jiàn)表1。引物送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 山羊痘病毒SS株基因組提取

將細(xì)胞培養(yǎng)物從-80 ℃冰箱取出并平衡至室溫，吸取200 μL，加入1.5 μL離心管中，根據(jù)DNA提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行山羊痘病毒SS毒株基因組提取，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 山羊痘病毒SS株5個(gè)ANK基因缺失的表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.3.1 ANK010和ANK138基因采用融合PCR方法擴(kuò)增

分段進(jìn)行PCR擴(kuò)增：以SS株的基因組為模板，分別擴(kuò)增ANK010、ANK138兩端側(cè)翼（P1P2、P5P6）以pE-GFP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GFP基因（P3P4）。擴(kuò)增體系25 μL ：buffer 5 μL、dNTP 1 μL、模板 1.5 μL、上下游引物各 0.6 μL、Pimer Star酶 0.3 μL、ddH2O 16 μL。擴(kuò)增程序 ：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

預(yù)融合：以分段PCR產(chǎn)物作為模板，不需要引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系25 μL：前后兩臂PCR產(chǎn)物加入1.2 μL、中間GFP的PCR產(chǎn)物加入0.4 μL、buffer 5 μL、dNTP 1 μL、Pimer Star酶 0.3 μL、ddH2O 16.6 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，ll個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min ；4 ℃保存。

正式融合：以預(yù)融合產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)組合只加P1和P6引物即可。擴(kuò)增體系25 μL：上下游引物各 0.6 μL、Buffer 5 μL、dNTP 5 μL、模板 1.9 μL、Pimer Star酶 0.3 μL、ddH2O 16.6 μL。擴(kuò)增程序 ：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min ；4 ℃保存。

1.2.3.2 ANK140、ANK141.2和ANK145基因采用Overlap PCR方法擴(kuò)增

擴(kuò)增體系25 μL：模板pE-GFP質(zhì) 0.9 μL、上下游引物各 0.6 μL、Easy Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序 ：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

表1 山羊痘病毒SS株5個(gè)ANK基因擴(kuò)增所用的引物序列Tab.1 Primers used for amplification of 5 ANK genes in SS strain of goat pox virus

1.2.3.3 連接轉(zhuǎn)化

配置1%普通瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。連接分別做5 μL體系（目的片段4 μL、T載體0.5 μL、ddH2O 0.5 μL），將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行涂板至Kana固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h。

1.2.3.4 菌液PCR和雙酶切

菌液PCR擴(kuò)增體系10 μL：菌液0.8 μL、每個(gè)組合加兩端引物各0.3 μL、Easy Taq Mix 5 μL、ddH2O 3.2 μL。取2～4個(gè)陽(yáng)性菌的菌液40～100 μL加入至含Kana的液體LB培養(yǎng)基6 mL，搖菌12～14 h，直至液體渾濁。按照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，并進(jìn)行電泳鑒定。

雙酶切（Hind Ⅲ/XhoⅠ），酶切條件為16 ℃，酶切 3～4 h，Buf Tango 1 μL、Hind Ⅲ 0.5 μL、Xho Ⅰ 0.5 μL、質(zhì)粒 5 μL、ddH2O 3 μL。

1.3 病毒重組及鑒定

將經(jīng)鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒用Lip 2000轉(zhuǎn)染至已經(jīng)感染SS株羊痘病毒的綿羊睪丸細(xì)胞（轉(zhuǎn)染過(guò)程按說(shuō)明書操作），繼續(xù)培養(yǎng)促使其與病毒同源重組，并且在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光產(chǎn)生從而判斷病毒同源重組情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊痘病毒SS株5個(gè)ANK基因缺失的克隆鑒定

以ANK010、ANK138分段產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。其余3個(gè)ANK基因以pE-GFP質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖1可知，ANK010、ANK138基因片段大小皆為為1 200 bp，與理論大小相符。

由圖2可知，該3個(gè)ANK基因片段大小皆為900 bp，與理論大小相符。

2.2 菌液PCR鑒定

分別將5個(gè)缺失ANK基因構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化，將其搖至渾濁的菌液，進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。ANK010、ANK138出現(xiàn)的陽(yáng)性條帶基因片段大小為1 200 bp，ANK140、ANK141.2和ANK145出現(xiàn)的陽(yáng)性條帶基因片段大小皆為900 bp，與理論大小相符。

2.3 雙酶切鑒定

對(duì)構(gòu)建的5個(gè)ANK基因缺失表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化搖菌提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（HindⅢ/XhoⅠ），其產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，ANK010、ANK138重組質(zhì)粒被切開的基因片段大小分別為3 900 bp與1 200 bp分別符合T載體與ANK010、ANK138基因片段大小，與理論大小相符；ANK140、ANK141.2和ANK145重組質(zhì)粒被切開的基因片段大小皆分別為3 900 bp與900 bp，分別符合T載體與ANK140、ANK141.2和ANK145基因片段大小，與理論大小相符。

2.4 病毒重組及鑒定

將已鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行接毒轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染之后的24、48和72 h分別在明場(chǎng)和熒光場(chǎng)觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在顯微鏡下均出現(xiàn)綠色熒光。

3 討論

羊痘是動(dòng)物痘病毒中較為嚴(yán)重的一種疫病，不僅感染率高，而且死亡率極高，羔羊死亡率高達(dá)100%，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[7]。近年來(lái)羊痘病毒出現(xiàn)交叉感染，甚至出現(xiàn)感染人的報(bào)道，使羊痘病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)陡增，危害也成倍加大，因此研究其跨物種傳播的機(jī)理和原因至關(guān)重要[12-13]。很多研究顯示，ANK基因是正痘病毒的宿主范圍基因，參與痘病毒對(duì)其感染宿主的選擇，因此理論上ANK基因也可能是羊痘病毒宿主范圍基因，但缺乏實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)證明[8-9]。ANK基因作為細(xì)胞中重要的結(jié)聯(lián)蛋白或互作蛋白，具有廣泛的生物學(xué)功能。為研究其生物學(xué)功能，了解其是否與羊痘病毒宿主范圍選擇有關(guān)，本研究構(gòu)建SS新疆分離株的5個(gè)ANK基因缺失的山羊痘病毒，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)根據(jù)已在GenBank上發(fā)表的山羊痘病毒株（登錄號(hào)為NC_004003.1）的5個(gè)ANK基因ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145基因序列，采用2種方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建其基因缺失的山羊痘重組病毒。首先選擇綠色熒光蛋白（GFP）為報(bào)告基因，以ANK基因本身的啟動(dòng)子為啟動(dòng)子構(gòu)成報(bào)告系統(tǒng)，這樣一方面簡(jiǎn)化構(gòu)建過(guò)程，不需要擴(kuò)增克隆啟動(dòng)子，只要將GFP基因直接替換ANK基因就可以實(shí)現(xiàn)報(bào)告系統(tǒng)的表達(dá)；另一方面，GFP作為報(bào)告基因，其表達(dá)的熒光容易觀察，只要在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光就可以證明病毒發(fā)生了重組。其次選擇ANK基因兩側(cè)的一段核苷酸序列為同源臂，分別加在GFP基因的上5'端和3'端，便于發(fā)生同源重組[10-11]。同時(shí)，為了確定同源重組效果與同源臂長(zhǎng)短的關(guān)系，設(shè)計(jì)300 bp和60 bp大小的兩種同源臂，前者用融合PCR方法與GFP基因連接到一起（ANK010、ANK138），融合基因片段總長(zhǎng)度為1 200 bp，后者用Overlap PCR的方法將同源臂加在GFP兩側(cè)（ANK140、ANK141.2和ANK145），連接后基因片段總長(zhǎng)度為850～900 bp。各種設(shè)計(jì)均可以克隆為基因缺失表達(dá)載體，構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SS毒株感染的羔羊睪丸細(xì)胞，最終5個(gè)ANK基因缺失的表達(dá)載體均得到了重組病毒，說(shuō)明同源臂為60 bp也可能發(fā)生同源重組，但從同源效率上看，300 bp同源臂的表達(dá)載體明顯高于60 bp，這與同源重組原理理論相一致。

通過(guò)本次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)羊痘病毒同源重組是較易實(shí)現(xiàn)的，其重組效率與同源臂的長(zhǎng)短呈正相關(guān)關(guān)系，所以構(gòu)建重組羊痘病毒時(shí)，在條件允許的情況下，設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的同源臂較為合理。另外，因?yàn)檠蚨徊《净蚪M成中，AT含量達(dá)到75%以上，所以引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該注意引物序列的選擇，盡量選取GC含量相對(duì)較高的序列，并且對(duì)引物要進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，評(píng)分太低會(huì)給后續(xù)研究帶來(lái)不能擴(kuò)增或出現(xiàn)大量的特異擴(kuò)增的問(wèn)題。本試驗(yàn)中的引物是改進(jìn)2～3次才得以擴(kuò)增。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用融合PCR和Overlap PCR方法獲得山羊痘病毒SS毒株5個(gè)ANK基因缺失的表達(dá)載體片段，并成功獲得表達(dá)載體；60 bp以上的同源臂可以得到重組病毒，同源臂越長(zhǎng)其重組效率越高。