一株豬源奇異變形桿菌的分離鑒定

張秋林，陳薈旭，潘姣姣，孫世浩，張偉信，李蓮瑞*

（1．塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2．新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

近年來關于奇異變形桿菌造成豬[1]、牛[2]、雞[3]、鴨[4]、孔雀[5]等動物發(fā)病的報道越來越多，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，奇異變形桿菌給養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害愈加嚴重。

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）為革蘭氏陰性桿菌，屬腸桿菌科，變形桿菌屬，無莢膜且無芽孢。奇異變形桿菌是一種人獸共患的條件致病菌，該菌具有較強的遷徙能力[6]。廣泛分布于自然環(huán)境、人體和動物的體表、黏膜、消化道、糞便中。當機體免疫力下降時，可引起動物和人腹瀉、化膿性炎癥和敗血癥[1]。已有研究報道，奇異變形桿菌能一起豬發(fā)病，且有一定的致死性。奇異變形桿菌感染后臨床癥狀為高熱、氣喘、嘔吐、腹瀉，引起豬的敗血癥[7]。本研究通過對阿克蘇某生豬養(yǎng)殖場腹瀉仔豬肛拭子病原分離，并通過對該分離菌株進行16S rDNA基因序列比對，確定分離株為奇異變形桿菌，有利于豐富阿克蘇地區(qū)該條件致病菌的基礎資料，并對該細菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品來自烏什縣某生豬養(yǎng)殖場無菌采集的肛拭子。

試驗試劑：細菌DNA提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；核酸染料、DL2000Maker、RNasenfree Water、2×TaqPCRMasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司；氯化鈉、瓊脂粉、酵母粉、蛋白胨均購自sigma公司。

試驗儀器：高壓鍋（HVE-50）購自上海天呈科技有限公司；小型臺式高速離心機（Eppendorf 5453）購自北京創(chuàng)世云博科技發(fā)展有限公司；小型高速冷凍離心機（Eppendorf 5426）購自北京創(chuàng)世云博科技發(fā)展有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ-2ED）購自上海五久自動化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)分離

無菌采集肛拭子，用接種環(huán)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 染色鏡檢

用接種環(huán)挑取單菌落于載玻片上涂勻，用酒精燈固定15 s，革蘭氏染色，經(jīng)結(jié)晶紫1 min、碘液1 min、95%酒精30 s、沙黃15 s，自然晾干后，100倍油鏡鏡檢。

1.2.3 細菌生化鑒定

將分離菌株分別接種于生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 細菌的DNA的提取及16S rDNA的擴增

用全式金細菌DNA提取試劑盒（M10280）按其說明書進行DNA提取后，進行PCR擴增，細菌通用引物 序 列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和11492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR反應體系 ：25 μL、DNA 模板1 μL、2×TaqPCRMasterMix12.5 μL、27F和1492R各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL，振蕩混勻離心。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物取20 μL，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中，進行觀察。

1.2.5 純化與測序

將出現(xiàn)與預期1 500 bp左右的目的條帶切膠回收，按照天根生化科技有限公司瓊脂糖凝膠回試劑盒（DP130419）說明書進行操作。將純化產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后，送至上海生工生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離及形態(tài)特征（見圖1、圖2）

由圖1可知，在LB固體培養(yǎng)基上形成灰白色、邊緣整齊的光滑菌落。

由圖2可知，革蘭氏染色呈陰性，無莢膜、無芽孢、鏡下呈短桿狀、長桿狀及球狀等多形性桿菌。

2.2 細菌生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果為分離株能利用葡萄糖分解尿素，硫化氫試驗陽性；乳糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、枸櫞酸鹽、吲哚、VP試驗陰性，初步判定為奇異變形桿菌。

2.3 16S rDNA擴增結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，細菌PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得預期1 500 bp左右的目的條帶。

2.4 序列分析及測序結(jié)果

本次分離獲得的菌株序列長度大小為1 450 bp，將本次測序結(jié)果與國內(nèi)外15株菌株比對，W1的起始位置為56～1 505，與國內(nèi)外15株菌比較在1 489和1 490位點多了AC。W1與處于同一分支南京株JF775415相比除起始位置不同外，在其他位點序列均相同。

將純膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體自連后，送上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果見圖4。

2.5 16S rDNA序列同源性比較及遺傳進化樹構(gòu)建（見圖5、圖6）

分離株W1與國內(nèi)外菌株的同源性為96.4%～99.4%，W1與 GenBank登錄 號 JF775415、AB272366、KF051774、KJ881162的同源性最高，為99%～99.4%，與GenBank登錄號 AB932536、EU643833、HQ407305、KC456557、EF091150、KC211292、MH532480、HQ407319、KF471507的 同 源 性為98%～98.5%，與巴基斯坦株KT216564同源性較低為96.4%；遺傳進化樹顯示W(wǎng)1與JF775415親緣關系較近處于同一分支并和KJ881162構(gòu)成同一亞群。

3 討論

奇異變形桿菌是條件致病菌。近年來，關于奇異變形桿菌引起動物和人發(fā)病的疫情報道越來越多，由奇異變形桿菌造成動物發(fā)病率和死亡率逐年增加[8-9]。奇異變形桿菌給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失及公共衛(wèi)生威脅也越來越嚴重，應予以重視。

16S rDNA是國際上通用的對未知細菌的鑒定技術?？蒲腥藛T可以用該方法快速確認細菌的種屬，通常認為16S rDNA序列同源性在99%～100%，為同一個種；97%～99%的序列同源性，為同一個屬[10-12]。本次分離株W1與JF775415、AB272366、KF051774、KJ881162為同一個種，與AB932536、EU643833、HQ407305、KC456557、EF091150、KC211292、MH532480、HQ407319、KF471507為同一個屬，與巴基斯坦株KT216564不是同一個屬。

本次試驗成功分離出一株細菌，將測序結(jié)果提交至NCBI經(jīng)BLAST，同時用DNA star做同源性比對和構(gòu)建遺傳進化樹分析，確定該分離株W1為奇異變形桿菌。此次從阿克蘇某生養(yǎng)殖場腹瀉仔豬肛拭子樣品中分離得到菌株W1，分析認為是仔豬免疫力較弱易受致病菌的侵襲[13]。本次試驗確定阿克蘇某規(guī)?；i養(yǎng)殖場感染奇異變形桿菌，該豬場應加強該病原菌的防控，加強飼養(yǎng)管理，做好病原菌的監(jiān)測，減少公共衛(wèi)生安全事件的發(fā)生。

4 結(jié)論

本試驗從腹瀉仔豬肛拭子中分離到一株細菌，采用生化鑒定和測序，經(jīng)16S rDNA序列比對和構(gòu)建遺傳進化樹分析，W1與南京株JF775415的同源性為99%，所以確定本次分離菌株W1為奇異變形桿菌。