丁酸梭菌對哺乳母豬繁殖性能、免疫和抗氧化功能的影響

馮云龍，王晶瑩，于 淼，劉 萱，馬 倩，刁新平*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.哈爾濱市阿城區(qū)畜牧站，黑龍江阿城 150300）

抗生素作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，但抗生素不當(dāng)使用造成了嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境污染，同時(shí)抗生素的耐藥性已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)[1]，通過科學(xué)合理的方法替代抗生素就變得十分重要[2]?？股叵嚓P(guān)性腹瀉會(huì)隨著抗生素尤其是β-內(nèi)酰胺加酶抑制劑和抗真菌劑[3]的加大使用變得愈加嚴(yán)重，甚至?xí)l(fā)死亡[4]。因此，尋找安全、有效、綠色的抗生素替代產(chǎn)品迫在眉睫。益生菌作為一類很好的綠色添加劑，其中丁酸梭菌具有無毒、較強(qiáng)的穩(wěn)定性和適應(yīng)能力等特點(diǎn)，被用于飼料添加劑等方面[5]。鄭有秀等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加丁酸梭菌可減少有害菌數(shù)量，提高血清總蛋白含量和肝的總抗氧化能力。趙文文等[7]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雛鴨飼糧中添加丁酸梭菌和黃芪多糖可以提高雛鴨的免疫性能和抗氧化能力，改善腸道形態(tài)。耿正穎等[8]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中添加丁酸梭菌可提高其免疫機(jī)能和抗氧化能力。Zhan 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加5×104、1×105CFU/g 丁酸梭菌，蛋雞血清中IgM、總超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶濃度呈線性和二次增加，腸道中大腸桿菌的數(shù)量減少。本試驗(yàn)在妊娠后期和哺乳期母豬飼糧中添加不同含量的丁酸梭菌，旨在研究其對哺乳母豬繁殖性能、免疫性能和抗氧化性能的影響，為丁酸梭菌在哺乳母豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 丁酸梭菌（Clostridium butyricum）（活菌≥2×108CFU/g），粉末狀，由湖北綠雪生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選取預(yù)產(chǎn)期和胎次（2 胎）相近的健康長白母豬32 頭，隨機(jī)分成4 組，每組8 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加250、500、1 000 mg/kg 丁酸梭菌。用攪拌機(jī)將不同添加量的丁酸梭菌與基礎(chǔ)飼糧混合充分后進(jìn)行飼喂，預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期為28 d（產(chǎn)前7 d 至21 d 斷奶）。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧是結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐進(jìn)行配制的玉米-豆粕型飼糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)于黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)杏山村金玉米糧油貿(mào)易有限公司的豬場進(jìn)行。產(chǎn)前7 d 將母豬統(tǒng)一轉(zhuǎn)移至產(chǎn)床上飼養(yǎng)，保證飼養(yǎng)條件一致，期間由同一飼養(yǎng)員進(jìn)行飼養(yǎng)管理，產(chǎn)后21 d 斷奶。母豬產(chǎn)前，每天06:30、13:30 共飼喂3.5 kg 飼料，生產(chǎn)當(dāng)天停料，產(chǎn)后18:30 加料1.5 kg，保證母豬自由采食和飲水。母豬產(chǎn)后與新生仔豬的護(hù)理由專人看護(hù)，定時(shí)清理糞便與尿液，保證豬場的環(huán)境與衛(wèi)生。避免母豬與仔豬受到驚嚇，每日觀察母豬精神狀況和采食飲水是否有異常。定期對豬場進(jìn)行消毒，防止疫病的發(fā)生。初生仔豬出現(xiàn)死亡、拉稀等情況時(shí)要及時(shí)處理。

1.4 樣品采集 母豬分娩當(dāng)天12 h 內(nèi)和分娩第10 天、第21 天08:00，對母豬耳朵進(jìn)行消毒，耳緣靜脈處用一次性采血針頭和肝素鈉采血管進(jìn)行采血，采集10 mL，迅速放置于離心機(jī)中進(jìn)行離心，3 000 r/min 離心5～10 min，取上層血清于1.5 mL 離心管中，標(biāo)號(hào)存于-20℃冰箱備用。母豬哺乳第1 天和第21 天，采集母豬新鮮糞便于凍存管內(nèi)，標(biāo)號(hào)，存放于液氮罐中。

1.5 指標(biāo)測定與方法

1.5.1 繁殖性能 母豬分娩時(shí)，記錄窩產(chǎn)活仔數(shù)、窩產(chǎn)仔數(shù)（包括活仔和死仔）。仔豬出生后、吃初乳前對仔豬進(jìn)行稱重記為初生重。斷奶窩重為哺乳第21 天斷奶的仔豬空腹體重。

弱仔率=初生重量低于700 g 的仔豬數(shù)量/窩產(chǎn)仔數(shù)×100%

死胎率=初生死亡的仔豬數(shù)/窩產(chǎn)仔數(shù)×100%

1.5.2 血液免疫指標(biāo) 血清中免疫球蛋白A（Immunoglo bulin A，IgA）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）和免疫球蛋白G（ImmunoglobulinG，IgG）采用比色法測定，用A6 半自動(dòng)生化儀分析。白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）采用酶聯(lián)免疫法測定，用華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)分析儀分析。試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.5.3 血液抗氧化指標(biāo) 血清中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）均采用比色法測定，用A6 半自動(dòng)生化儀分析。試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.5.4 糞便中乳酸菌和大腸桿菌的測定 取一定量稀釋液將采集的樣品稀釋10 倍。乳酸菌（Lactobacillus）用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)，大腸桿菌（Escherichia coli）用麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用微生物平板計(jì)數(shù)法測定。菌群數(shù)量以每克糞便中所含細(xì)菌群落總數(shù)的對數(shù)[lg（CFU/g)]表示。試劑盒購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，運(yùn)用Duncan's 進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 丁酸梭菌對哺乳母豬繁殖性能的影響 如表2 所示，從產(chǎn)前7 d 至產(chǎn)后21 d 斷奶，窩產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、初生重、斷奶窩重、弱仔率和死胎率在各組間無顯著差異，表明日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬的繁殖性能沒有顯著影響。

2.2 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬血液免疫指標(biāo)的影響 如表3 所示，哺乳第1 天，1 000 mg/kg 丁酸梭菌組血清中IgA、IgM 和IgG 含量較對照組分別增加25.51%、5.04%和11.57%（P＜0.05）。哺乳第21 天，250、500、1 000 mg/kg 丁酸梭菌組IgA 含量較對照組分別提高22.43%、36.45%、44.86%（P＜0.05），500 mg/kg 丁酸梭菌組IgM 含量較對照組上升4.96%（P＜0.05），1 000 mg/kg 丁酸梭菌組IgG 含量較對照組升高7.47%（P＜0.05）。在哺乳第1 天和第10 天，1 000 mg/kg 丁酸梭菌組IL-6 含量較對照組分別降低28.89% 和24.37%（P＜0.05）。哺乳第1、10、21天，1 000 mg/kg 丁酸梭菌組IL-1β含量較對照組降低（P＜0.05）。哺乳第21 天，各丁酸梭菌添加組IL-6 含量均下降（P＜0.05）。

2.3 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬血液抗氧化指標(biāo)的影響 如表4 所示，哺乳第1、10、21 天，添加丁酸梭菌組的SOD 含量均高于對照組（P＜0.05），而MDA含量均低于對照組（P＜0.05）。哺乳第1、10、21 天，500 mg/kg 和1 000 mg/kg 丁酸梭菌組MDA 含量較對照組分別下降23.15%和24.38%、30.63%和37.86%、33.73%和42.06%（P＜0.05）。哺乳第1 天和第21 天，1 000 mg/kg 丁酸梭菌組CAT 含量較對照組分別上升96.46%、85.10%（P＜0.05）。哺乳第21 天，500 mg/kg丁酸梭菌組T-AOC 含量較對照組上升60.76%（P＜0.05），500、1 000 mg/kg 丁酸梭菌組GSH-Px 含量較對照組分別提高25.49%、24.79%（P＜0.05）。

表2 丁酸梭菌對哺乳母豬繁殖性能的影響

表3 丁酸梭菌對哺乳母豬血液免疫指標(biāo)的影響

2.4 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬糞便中乳酸菌和大腸桿菌的影響 如表5 所示，哺乳第1 天，500、1 000 mg/kg 丁酸梭菌組大腸桿菌含量較對照組分別降低63.28%、73.43%（P＜0.05）。哺乳第21 天，500、1 00 0 mg/kg 丁酸梭菌組大腸桿菌含量較對照組分別下降70.77%、72.24%（P＜0.05）。哺乳第1 天和第21 天，添加丁酸梭菌對糞便中乳酸菌含量無顯著影響。

3 討 論

3.1 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬繁殖性能的影響本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在妊娠后期和哺乳期的母豬飼糧中添加丁酸梭菌對窩產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、弱仔率和死胎率沒有顯著影響，但是仔豬初生重和斷奶窩重有升高趨勢。前人研究發(fā)現(xiàn)，將丁酸梭菌添加至斷奶仔豬飼糧中，仔豬生產(chǎn)性能提高，耗料增重比下降[10-11]。Casas 等[12]添加1 250×108CFU/kg 丁酸梭菌至仔豬飼糧中，仔豬增重顯著上升。李安東等[13]發(fā)現(xiàn)日糧中添加丁酸梭菌可以提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。趙雷等[14]將0.2%和0.1%復(fù)合丁酸梭菌制劑加入妊娠母豬日糧中，發(fā)現(xiàn)活仔數(shù)、仔豬初生重和21 日齡重均顯著升高。孫華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中2.5×108CFU/kg 丁酸梭菌可以提高保育豬日增重。本試驗(yàn)在妊娠后期和哺乳期母豬飼糧中添加不同劑量的丁酸梭菌，對哺乳母豬繁殖性能沒有顯著影響，窩產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、弱仔率和死胎率在各組之間無顯著差異，這與前人報(bào)道不一致，原因可能是配種后第25 天，受精卵已完成對子宮壁的吸附，因此母豬在產(chǎn)前7 d 子宮內(nèi)胎兒數(shù)量（包括存活和死亡的胎兒）已經(jīng)固定，外界因素難以改變窩產(chǎn)仔數(shù)（包括活仔和死仔）。但仔豬初生重和斷奶窩重有升高趨勢，是因?yàn)槎∷崴缶谀c道內(nèi)產(chǎn)生酶（如淀粉酶）和維生素類有益物質(zhì)（如B 族維生素），從而加快了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，具有保健作用，同時(shí)保證母豬哺乳期的健康狀態(tài)和營養(yǎng)水平，提供足夠的母乳，有利于仔豬的生長，提高了仔豬的斷奶重量。關(guān)于妊娠母豬在產(chǎn)前飼糧中添加丁酸梭菌的最佳時(shí)間有待進(jìn)一步探究。

表4 丁酸梭菌對哺乳母豬血液抗氧化指標(biāo)的影響 U/mL

表5 丁酸梭菌對哺乳第1 天和第21 天糞便中乳酸菌和大腸桿菌含量的影響

3.2 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬免疫指標(biāo)的影響機(jī)體內(nèi)免疫球蛋白含量反映了其對各種病毒和細(xì)菌的抵抗力、免疫功能的強(qiáng)弱。IgA、IgG 和IgM 為3 種重要的免疫球蛋白，可以抵御機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌和病毒[16]。IgA主要由黏膜相關(guān)淋巴樣組織產(chǎn)生，在黏膜免疫中發(fā)揮著重要作用。IgG 為一種抗感染免疫球蛋白，主要由淋巴結(jié)、脾臟中的漿細(xì)胞合成分泌，和抗原特異性地結(jié)合，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用。IgM 主要存在于血液中，具有很強(qiáng)的抗感染作用，為初次免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。白細(xì)胞介素在免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，IL-1β和IL-6 可以促進(jìn)B 細(xì)胞的增殖分化和分泌抗體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。王柳懿等[17]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加丁酸梭菌可以激活LR2/4 信號(hào)通路，通過MyD88 途徑分泌細(xì)胞因子，提升機(jī)體免疫力。張吉鹍[18]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物飼料中添加丁酸梭菌可提高體內(nèi)血清中IgA 和IgM 的含量。劉亭婷等[19]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋用仔公雞飼糧中添加適量丁酸梭菌，可以增加血清中IgG 和IgA 等免疫指標(biāo)的含量，降低空腸組織中IL-6 和TNF-α mRNA 相對表達(dá)水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。李玉鵬等[10]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5×105CFU/g 丁酸梭菌使斷奶仔豬血清IL-1β含量降低5.47%。劉硯涵[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200 mg/kg 丁酸梭菌可以顯著提高填飼北京鴨血清中IgA、IgG、C3 和C4 含量。Wang 等[21]也發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加丁酸梭菌和糞腸球菌的復(fù)合益生菌制劑，可以提高斷奶第14 天血清中IgM 含量，提高斷奶第28 天血清中IgA、IgG 和IgM 含量。本試驗(yàn)在妊娠后期和哺乳期母豬飼糧中添加500 mg/kg 和1 000 mg/kg丁酸梭菌，也顯著提高了哺乳第1、10、21 天母豬血清中IgA、IgG 和IgM 含量，降低IL-6 和IL-1β含量。原因是丁酸梭菌磷壁酸可以促進(jìn)炎癥抑制因子增多，從而應(yīng)對機(jī)體內(nèi)的炎癥，避免組織受損。以上研究表明，丁酸梭菌可以激活免疫系統(tǒng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫因子，提高免疫能力，維持機(jī)體健康，但還需進(jìn)一步探究。

3.3 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬血清抗氧化指標(biāo)的影響 細(xì)胞新陳代謝會(huì)產(chǎn)生各種活性氧，SOD 可以防止氧自由基對細(xì)胞體的破壞，從而保護(hù)細(xì)胞[22]。在逆境情況下，生物體內(nèi)自由基增多，細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞和損傷，CAT 催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解，防止氧化[23]。GSH-Px 具有清除脂類氫過氧化物等功能，反映抗氧化能力的強(qiáng)弱。MDA 為脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，可以反映脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度，脂質(zhì)過氧化越強(qiáng)，損傷程度越大，MDA 含量越大。鄭有秀等[6]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加500 mg/kg 丁酸梭菌可以提高斷奶仔豬肝的T-AOC。尹會(huì)方等[24]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加丁酸梭菌可顯著提高血清中SOD 含量，降低MDA 含量，且T-AOC 和GSH-Px 含量均有上升。劉婷婷等[25]給斷奶仔豬飼喂500 mg/kg 丁酸梭菌，血清中SOD 活性和T-AOC 均顯著高于對照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在妊娠后期和哺乳期母豬飼糧中添加1 000 mg/kg 丁酸梭菌，顯著降低了哺乳第1、10、21 天血清中MDA 含量，減少氧化應(yīng)激帶來的損害；添加500 mg/kg 和1 000 mg/kg丁酸梭菌顯著提高了哺乳第1、10、21 天血清中SOD、CAT 和GSH-Px 活力，增強(qiáng)T-AOC。原因是丁酸梭菌分泌產(chǎn)生丁酸鹽和氫氣，其中氫原子通過與自由基的結(jié)合，防止自由基對細(xì)胞的破壞，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化酶的活性，減少氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化能力。

3.4 日糧中添加丁酸梭菌對哺乳母豬腸道中乳酸菌和大腸桿菌的影響 丁酸梭菌在動(dòng)物腸道代謝過程中產(chǎn)生丁酸、丁酸梭菌素和淀粉酶等，丁酸和丁酸梭菌素可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌繁殖，同時(shí)淀粉酶分解碳水化合物產(chǎn)生的低聚糖可以間接促進(jìn)乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的生長，從而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。畜禽養(yǎng)殖中，乳酸菌是一類廣泛分布在腸道中，可以將碳水化合物發(fā)酵生成乳酸的有益細(xì)菌，可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，維持腸道健康，提高機(jī)體的生產(chǎn)性能[26]，同時(shí)可以提高免疫能力等。大腸桿菌主要分布在大腸中，是人和動(dòng)物腸道中數(shù)量最多的一種細(xì)菌，會(huì)引起人和動(dòng)物腹瀉，在一定條件下也可引發(fā)腸道外感染等疾病。Cao 等[27]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母豬飼糧中添加2×108CFU/kg 丁酸梭菌可以改變母豬腸道菌群組成。Sato 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可以改變仔豬腸道微生物群的結(jié)構(gòu)。劉韶娜等[29]在0～14 日齡斷奶仔豬飼糧中添加105個(gè)/g 丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)盲腸大腸桿菌數(shù)量降低，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量升高。梁明振等[30]添加丁酸梭狀芽孢桿菌至斷奶仔豬飼糧中，顯著減少腸道中大腸桿菌含量，顯著增加腸道中乳酸菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，妊娠后期和哺乳期飼糧中添加丁酸梭菌顯著降低了哺乳第1 天和第21 天母豬腸道中大腸桿菌數(shù)量，但對乳酸菌的含量影響并不顯著。可能原因是丁酸梭菌在腸道中產(chǎn)生淀粉酶，水解淀粉產(chǎn)生酸，乳酸菌對酸具有一定的耐受性，因此，在飼料中添加一定量的丁酸梭菌并不能顯著影響乳酸菌數(shù)量。還有一種可能是試驗(yàn)于產(chǎn)前7 d 開始至產(chǎn)后21 d結(jié)束，試驗(yàn)周期太短，丁酸梭菌進(jìn)入母豬腸道內(nèi)起作用時(shí)間太少，導(dǎo)致菌群中有益菌和致病菌之間未能完全達(dá)到平衡，作用不顯著。但不同添加量的丁酸梭菌對哺乳母豬腸道微生態(tài)平衡的研究有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在妊娠后期和哺乳期母豬飼糧中添加丁酸梭菌，可以顯著提高母豬免疫性能和抗氧化能力，且添加量為500～1 000 mg/kg 時(shí)效果明顯；添加丁酸梭菌7 d 后，母豬腸道中大腸桿菌數(shù)量顯著下降。